معلومة

RT-qPCR للجينات المعبر عنها التفاضلية المختارة: ما التخفيفات في منحنى المعايرة؟

RT-qPCR للجينات المعبر عنها التفاضلية المختارة: ما التخفيفات في منحنى المعايرة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد رأيت في إرشادات MIQE أن المعايرة منحنيات ضرورية عند إجراء RT-qPCR. سأستخدم الحمض النووي الجيني لإجراء منحنيات المعايرة هذه.

سؤالي هو أنني لا أعرف مدى التركيزات التي يجب اختبارها.

الجينات التي سأفحصها للتعبير التفاضلي لها logFC بين 2-8 (سجل الأساس 2).

50 نانوغرام / ميكرولتر هو تركيز العينة الذي سأحصل عليه عند إجراء تجربة التصوير المقطعي المحوسب المقارنة ، لكن 98 ٪ هو الحمض النووي الريبي الريبوزومي.

اسمحوا لي أن أعرف اقتراحاتكم والكتب المرجعية المحتملة / الأوراق لمراجعتها.


التعبير الجيني هو العملية التي يتم من خلالها استخدام المعلومات من الجين في تخليق منتج جيني وظيفي. غالبًا ما تكون هذه المنتجات بروتينات ، ولكن في الجينات غير المشفرة للبروتين مثل جينات الرنا الريباسي أو جينات الحمض النووي الريبي ، يكون المنتج عبارة عن رنا هيكلي أو منزلي. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك RNAs الصغيرة غير المشفرة (miRNAs ، piRNA) وفئات مختلفة من RNAs الطويلة غير المشفرة في مجموعة متنوعة من الوظائف التنظيمية (Taft ، R.Pang ، KC Mercer ، TR Dinger ، M. and Mattick ، ​​JS 2010 ).

عند دراسة التعبير الجيني باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR) ، يقوم العلماء عادةً بالتحقيق في التغييرات - الزيادات أو النقصان - في التعبير عن جين معين أو مجموعة من الجينات عن طريق قياس وفرة النسخة الخاصة بالجين. يراقب التحقيق استجابة الجين للعلاج بمركب أو دواء ذي فائدة ، في ظل مجموعة محددة من الشروط. يمكن أن تتضمن دراسات التعبير الجيني أيضًا النظر في الملامح أو أنماط التعبير عن العديد من الجينات. سواء كان تقدير التغييرات في مستويات التعبير أو النظر إلى الأنماط العامة للتعبير ، يتم استخدام PCR في الوقت الفعلي من قبل معظم العلماء الذين يقومون بالتعبير الجيني.


مقدمة

غالبًا ما تُعتبر الخلايا الميكروبية التي تنمو في ظل نفس الظروف والبيئات مجموعات متجانسة يمكن وصفها بشكل مناسب بالقيم المتوسطة (Brehm-Stecher and Johnson ، 2004). ومع ذلك ، تظهر الأدلة على أن المجموعات المتجانسة للكائنات الحية الدقيقة المتزايدة بشكل كبير لديها تباين كبير من خلية إلى خلية في كل من مستويات التعبير الجيني ومعدل النمو (Kelly and Rahn ، 1932 ، Maloney and Rotman ، 1973 ، Siegele and Hu ، 1997 ، Becskei et al.، 2005، Kuang et al.، 2004، Colman-Lerner et al.، 2005، Golding et al.، 2005، Le et al.، 2005، Kaern et al.، 2005، Pedraza and van Oudenaarden، 2005، Rosenfeld وآخرون ، 2005 ، Strovas وآخرون ، 2007 ، Strovas and Lidstrom ، 2009). لقد تم اقتراح أن عدم تجانس التعبير الجيني يمكن أن ينشأ من العشوائية ، أو الضوضاء ، في التعبير الجيني لكل فرد. يتم التحكم في اتساع مثل هذه الضوضاء في التعبير الجيني من خلال العديد من العوامل ، بما في ذلك معدل النسخ ، والديناميات التنظيمية ، والعوامل الوراثية للخلايا (Banerjee et al. ، 2004 ، Colman-Lerner et al. ، 2005 ، Pedraza and van Oudenaarden ، 2005 Rosenfeld et al. ، 2005 ، Newman et al. ، 2006 ، Strovas et al. ، 2007). نتيجة لهذه العوامل ، تحتوي الخلايا الفردية في مجموعات متجانسة وراثيًا على أعداد نسخ مختلفة من جزيئات الرنا المرسال (mRNA) ، والتي قد تؤدي في النهاية إلى أعداد مختلفة من جزيئات البروتين العاملة. يمكن لهذه الضوضاء ، بمجرد تضخيمها ، أن توفر الفرصة لتوليد عدم تجانس طويل المدى على المستوى الخلوي في مجموعة ميكروبية نسيلية. بالإضافة إلى ذلك ، داخل النظم البيئية الطبيعية ، يتم وضع الخلايا الميكروبية ذات الأنماط الجينية والأنماط الظاهرية المتنوعة التي تعبر عن مسارات التمثيل الغذائي المتميزة ، واستجابات الإجهاد والأنشطة البيولوجية المحددة الأخرى جنبًا إلى جنب (Macfarlane and Dillon ، 2007). تشمل الآليات التي تساهم في هذا التغاير الجيني والفسيولوجي التدرجات الكيميائية الدقيقة ، والتكيف مع الظروف البيئية المحلية ، والتعبير الجيني العشوائي ، والاختلاف الجيني الذي يحدث من خلال الطفرة والاختيار (ستيوارت وفرانكلين ، 2008). يشير عدم تجانس التعبير الجيني لمجتمع ميكروبي إلى أنه بمجرد حصاد mRNA أو البروتينات من مجموعات سكانية كاملة ، قد تُفقد الأنماط الفريدة للتعبير الجيني المتعلقة بمناطق معينة من الاتحادات أو مجموعات سكانية فرعية وظيفية مميزة في المجتمع. علاوة على ذلك ، من المقدر أن أقل من 1٪ فقط من الأنواع الميكروبية في البيئات الطبيعية يمكن استزراعها والوصول إليها من خلال طرق تحليل التعبير الجيني التقليدية التي تتطلب عادةً عددًا كبيرًا من الخلايا. كان هناك اهتمام كبير بالحصول على خلايا بكتيرية فردية باستخدام طرق مثل فرز الخلايا التي يتم تنشيطها بواسطة التألق ثم تحليل التعبير الجيني مباشرة في الخلايا البكتيرية المفردة.

تم اقتراح العديد من الأساليب لقياس التعبير الجيني في خلية بكتيرية واحدة ، مثل نهج الجين / البروتين المراسل الذي يستخدم البروتين الفلوري الأخضر أو ​​لوسيفيراز (Golding et al. ، 2005 ، Le et al. ، 2005 ، Le et al. ، 2006 ، Cai et al. ، 2006 ، Yu et al. ، 2006 ، Strovas et al. ، 2007 ، Guet et al. ، 2008 ، Stewart and Franklin ، 2008 ، Strovas and Lidstrom ، 2009) ، مجسات الفلورسنت في مضان فى الموقع تجارب التهجين (FISH) (Levsky et al. ، 2002 ، Capodieci et al. ، 2005) ، و فى الموقع PCR جنبا إلى جنب مع فى الموقع النسخ العكسي (فى الموقع RT-PCR) (المنظمة العربية للتصنيع ، 2002). ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب تتطلب إما سلالات معدلة وراثيًا أو بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية التي تستغرق وقتًا طويلاً والعمالة للحصول على القياس ، وبالتالي من الصعب جدًا تحسين إنتاجيتها في القياس. طريقة أخرى لتحليل التعبير الجيني هي تقنية الكشف عن جزيء واحد متحد البؤر (SMD) للكشف عن جزيئات الفلورسنت المفردة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (SNR). ومع ذلك ، فإن هذه التحليلات عادة ما تكون لها متطلبات أعلى للأدوات ، كما أنها تستغرق وقتًا طويلاً وعمالة (Lu et al.، 1998، Korn et al.، 2003، Raj et al.، 2008، Raj and van Oudenaarden، 2009). يتمثل أحد الأساليب البديلة ، التي ربما تكون أكثر وضوحًا وقابلية للتوسع ، في إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT) مباشرة في خلايا بكتيرية مفردة (Kubista et al. ، 2006 ، Nolan et al. ، 2006). إلى جانب طرق مختلفة لفرز الخلايا وجمعها ، تم نشر العديد من البروتوكولات لتحليل التعبير الجيني بواسطة RT-qPCR لخلايا الثدييات أحادية الخلية (Lindqvist et al. ، 2002 ، Hartshorn et al. ، 2007 ، Wacker et al. ، 2008 ، تانيجوتشي وآخرون ، 2009 ، لي وآخرون ، 2010). تم نشر البروتوكول الأكثر تقدمًا بواسطة Taniguchi et al. (2009) الذي استخدم طريقة PCR الكمية التي تتميز بمكتبة cDNA أحادية الخلية قابلة لإعادة الاستخدام مثبتة على خرز لقياس التعبير عن أهداف cDNA متعددة (من عدة نسخ إلى عدة مئات الآلاف من النسخ) في خلية ثديية واحدة ، وأظهرت النتائج أن الخطأ التجريبي أقل من 15.9٪ ، مما يشير إلى أن الطريقة دقيقة بما يكفي للتحقيق في عدم تجانس الخلايا المفردة.


نتائج

أظهرت جميع الجينات المرجعية المختبرة مستوى عاليًا من التعبير باستخدام Cتي القيمة أقل من 35 ، على النحو الموصى به سابقًا 60 ، وتم اختيارها لمزيد من التقييم لاستقرار التعبير. كجينات مستهدفة ، استخدمنا وحدة تفاعل مركز ضوئي لوحدة فرعية IV (PSI) 44 وعامل نسخ الإجهاد الحراري A-1d (HSF) 61.

كانت كفاءات RT-qPCR متشابهة بين تركيزين للجينات الـ 12 المرشحة (10 جينات مرجعية و 2 جينات مستهدفة) واخترنا أقل تركيز (أي 100 نانومتر) لجميع أزواج التمهيدي. كشف تحليل منحنى التفكك بعد 40 دورة من التضخيم أن جميع أزواج التمهيدي تضخيم منتج PCR واحد ، وأكد الرحلان الكهربائي للهلام لمنتجات PCR أحجام الأمبليكون المتوقعة (البيانات غير معروضة). عرضت جميع PCR معاملات الارتباط أكبر من 0.95 وتراوحت الكفاءات بين 88 و 114 ٪ (الجدول 1 والشكل التكميلي S1). تكرار تقلبات Cتي تم فحص القيم بين التكرارات التقنية الثلاثة لكل مجموعة من العينات الجينية. كانت قابلية تكرار الفحص بين التكرارات التقنية متسقة عبر الجينات المختلفة مع تباين التكرار الذي يقع ضمن الحد المعين لدورات & # x0003c0.5 لجميع مجموعات عينات الجينات التي تم اختبارها.

تم اختيار أفضل جينات المراجع والتحقق من صحتها من أجل التطبيع الدقيق للتعبير الجيني تحت قيود الضوء باستخدام برنامج geNorm 49 ضمن حزمة برامج qbase + و BestKeeper 57 و NormFinder 56. تم قياس جميع العينات في نفس التشغيل لجين مرجعي معين (أي استراتيجية تعظيم العينة 58). تم تحديد استقرار التعبير الجيني المرجعي بواسطة (i) M (متوسط ​​ثبات التعبير ، قيم M المنخفضة التي تقابل تعبيرًا جينيًا أكثر استقرارًا) في برنامج NormFinder و geNorm (الشكل 3 أ ، ب). بالنسبة لمعظم الجينات المرجعية ، كانت قيم M أقل من 1 ، مما يعكس ثباتًا نسبيًا استجابةً لتوهين الضوء ، باستثناء جينات S4 و adenosylhomocysteinase (قيمة M بين 1 و 3 لـ NormFinder ، الشكل 3A و M بين 1 و 2.5 لـ geNorm ، الشكل 3 ب). ومع ذلك ، عرضت الجينات المرجعية المرشحة نطاقًا واسعًا في قيمها M ، وتم العثور على التعبير الأكثر ثباتًا تحت قيود الضوء لـ PolyA لـ NormFinder (M & # x02009 = & # x020090.14 ، الشكل 3 أ) وعامل بدء الترجمة 1 وحدة فرعية بيتا لـ geNorm (M & # x02009 = & # x020090.545 الشكل 3 ب). ثم تم استخدام تحليل التباين الزوجي (V) لتحديد العدد الأمثل للجينات المرجعية التي سيتم استخدامها (أي عن طريق تقدير تأثير تضمين الجين الإضافي 55. Vandesompele وآخرون. 55 تباينًا مزدوجًا مقترحًا قدره 0.15 كقيمة حدية مرنة لا يكون من دونها إدراج جين مرجعي إضافي مطلوبًا. وفقًا لقيمة القطع هذه ، تشير نتائجنا إلى أن العدد الأمثل للجينات المرجعية لتطبيع التعبير عن الجينات المستهدفة بدقة في Z. مويليري استجابة لقيود الضوء كانت 4 (V4 / 5 & # x02009 = & # x020090.115 ، الشكل 3C). لم تؤد إضافة جين مرجعي خامس إلى مزيد من الانخفاض في عامل التطبيع ، ولكن زيادة كبيرة إلى حد ما (V5 / 6 & # x02009 = & # x020090.174 ، الشكل 3C).

متوسط ​​قيمة ثبات التعبير (على النحو المحدد بواسطة Normfinder ، أ وبواسطة geNorm ، ب) لكل جين مرشح والاختلافات الزوجية (على النحو المحدد بواسطة geNorm ، ج) لتحديد العدد الأمثل للجينات المرجعية للتطبيع. يشير الخط المتقطع إلى 0.15 كقيمة فاصلة تحتها لا يلزم إدراج جين مرجعي إضافي. S4: 30S بروتين الريبوسوم S4 AHCY: Adenosylhomocysteinase 18S: 18S بروتين الريبوسوم PolyA: Poly (A) RNA polymerase GADPH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase TubB: سلسلة Tubulin beta-1 Calmo: Calmodulin EloF1b: بدء الترجمة: عامل البدء 2 وحدة فرعية بيتا.

باستخدام BestKeeper ، أعطى معامل تحديد كل جين أعلى موثوقية لـ GADPH و PolyA و S4 و TubB (الجدول 2). أشارت المقارنة بين التصنيفات التي تم إنتاجها بواسطة الأساليب الثلاثة (geNorm و Normfinder و BestKeeper) إلى وجود اختلافات كبيرة (الجدول 3). ومع ذلك ، باستخدام حزمة RankAggreg ، تمكنا من إنشاء قائمة إجماع بين الخوارزميات الثلاثة المختلفة. تضمنت قائمة الإجماع هذه PolyA و GADPH و ELOF1 و TubB كأفضل أربعة جينات مرجعية (الجدول 3) ، والتي تم استخدامها بعد ذلك لتقييم ملف تعريف التعبير الجيني المستهدف في Z. مويليري تحت قيود الضوء. أظهر التقدير الكمي النسبي 55 أن مستوى التعبير عن جينات PSI و HSF كان مختلفًا بشكل كبير في ظل قيود الضوء مع أسبوعين من علاج التظليل مما أدى إلى انخفاض بمقدار ضعفين في مستوى التعبير عن جين PSI (الشكل 4 أ ، التحكم & # x02009 = & # x020091.303 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.516 إضاءة منخفضة & # x02009 = & # x020090.665 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.140 T-test، t3& # x02009 = & # x020092.295، p & # x02009 = & # x020090.0416) وفي تنظيم 9 أضعاف لجين HSF (الشكل 4 ب ، التحكم & # x02009 = & # x020091.196 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.567 إضاءة منخفضة & # x02009 = & # x0200910.217 & # x02009 & # x000b1 4.615 اختبار T ، t3& # x02009 = & # x020092.196، p & # x02009 = & # x020090.0465).

التعبير النسبي لـ PSI (نظام الصور الأول ، الوحدة الفرعية لمركز التفاعل IV ، سلائف البلاستيدات الخضراء ، (أ) و HSF (عامل نسخ الإجهاد الحراري A-1d ، (ب) تم تطبيعها إلى الإجماع على أربعة جينات مرجعية أكثر استقرارًا (بولي (A) RNA بوليميريز ، Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ، عامل بدء الترجمة 1 وحدة فرعية بيتا وسلسلة Tubulin beta-1). يشار إلى الفرق الإحصائي بين الوسائل على النحو التالي * P & # x02009 & # x0003c & # x020090.05. تمثل أشرطة الخطأ SEM مع 3 مكررات بيولوجية.

الجدول 2

& # x000a0جادف18 ثانيةEloF1كالموEloF2TubBأكتينAHCYبولي أ4 س
ن6666666666
المتوسط ​​الهندسي (ط م)24.2925.8724.1923.1026.2824.2925.9231.0528.6929.17
الانحراف المعياري (& # x000b1Ct)0.971.550.890.841.060.990.692.760.754.23
معامل التحديد0.6860.2840.3080.3550.4970.6080.4560.0450.6770.638
قيمة P.0.0420.2760.2540.2130.1170.0670.1410.6890.0440.056

الجدول 3

جينورمنورمفايندرأفضل حارسإجماع 3 جيناتإجماع 4 جيناتإجماع 5 جيناتإجماع 6 جينات
EloF1بولي أجادفبولي أبولي أجادفجادف
EloF2أكتينبولي أجادفجادفبولي أبولي أ
هدوءجادف4 سEloF2EloF1EloF2EloF2
TubBTubBTubB& # x000a0TubBTubBTubB
جادفEloF2EloF2& # x000a0& # x000a0أكتينكالمو
بولي أكالموأكتين& # x000a0& # x000a0& # x000a0أكتين
أكتينEloF1كالمو& # x000a0& # x000a0& # x000a0& # x000a0
18 ثانية18 ثانيةEloF1& # x000a0& # x000a0& # x000a0& # x000a0
AHCYAHCY18 ثانية& # x000a0& # x000a0& # x000a0& # x000a0
4 س4 سAHCY& # x000a0& # x000a0& # x000a0& # x000a0

يتم سرد المرشحين من أعلى إلى أسفل من أجل تقليل استقرار التعبير.


نتائج

تقييم أداء الدوبلكس BCR-ABL1 و ABL1 المقايسة بواسطة RT-dPCR

قبل التحليل السريري ، أجريت تجارب التحقق من الصحة باستخدام منصة QS3D. كان الهدف هو تقييم خصائص الأداء لمقايسة RT-qPCR المطبقة سريريًا على منصة RT-dPCR. تم استخدام تخفيفات ERM-AD623 و Wessex plasmids لقياس ومقارنة الهدفين (BCR-ABL1 و ABL1). تضمنت خصائص الأداء التي تم تقييمها إعداد التفاعل (تركيزات المسبار التمهيدي ، ودرجات حرارة التلدين ، ومقارنة التفاعلات أحادية الاتجاه والمزدوجة التي تم تقييمها أيضًا على المنصتين الرقميتين الأخريين) ، والخطية وحساسية الفحص ، وتحديد التحيز بين الهدفين ( انظر التين التكميلي عبر الإنترنت. S2 – S6).

باستخدام المادة المرجعية ERM-AD623 ، تم إجراء تفاعلات مزدوجة مع نتائج مماثلة لتفاعلات أحادية الاتجاه. لم يكن هناك فرق كبير في التراكيز المقاسة (ص = 0.385) (انظر الشكل التكميلي عبر الإنترنت S6A). بالنسبة للمدى الذي تم فحصه ، لم تظهر النسبة بين الهدفين أي انحراف كبير عن النسبة المتوقعة 1 (ص = 0.471 انظر الشكل التكميلي عبر الإنترنت. S6B). لذلك ، تم استخدام تجارب الطباعة على الوجهين لبقية الدراسة.

تم الحفاظ على الخطية عبر نطاق التخفيف لكلا الهدفين باستخدام ص 2 من 0.99 (انظر الشكل التكميلي عبر الإنترنت S6C). تم إجراء تخفيف لبلازميد Wessex الداخلي وقياسات مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام معيار ERM-AD623. نظرًا لأن تركيز الأول تم تحديده بواسطة القياس الطيفي ، فقد تم استخدام المقارنة مع المادة المرجعية ERM-AD623 لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى عامل تحويل. تم تحديد تحيز منهجي عالي الأهمية بنسبة 50 ٪ تقريبًا مع Wessex plasmid مقارنةً بـ ERM-AD623 (ص & lt 0.0001) (انظر الشكل التكميلي عبر الإنترنت. S7A). تم تحديد تحيز مشابه أيضًا في دراسة تقييم ERM (12) وتم توضيحه من خلال تخصيص أرقام النسخ بافتراض بلازميد Wessex أحادي الخيط ، ولكن بلازميد ERM مزدوج تقطعت بهم السبل. باستخدام مؤامرات Bland-Altman Ratio تم حساب عامل تحويل قدره 0.46 واستخدامه لبقية الدراسة. الأهم من ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير في نسبة كلا الهدفين (انظر الشكل التكميلي عبر الإنترنت S7B).

تقييم dPCR لتحديد كمية العينات السريرية

لجميع العينات السريرية BCR-ABL1 و ABL1 تم قياس النصوص بواسطة RT-qPCR و RT-dPCR على نفس عينات (كدنا) ، وتمت مقارنة النسبة المئوية بين الهدفين. لمنصة QS3D ، 2 سلبي ABL1 تم ملاحظة السكان في جميع العينات. لم يتم فصلها بوضوح عن بعضها البعض ، ولكن من الواضح أنها تختلف عن المجموعة الإيجابية للأقسام (انظر الشكل التكميلي عبر الإنترنت. S8). استقصاء لمجموعة فرعية من عينات (كدنا) تمت معالجتها مع وبدون DNase ، بالإضافة إلى استخدام أنواع مختلفة ABL1 فحوصات ، حددت أن سبب هذه المشكلة هو تلوث الحمض النووي الجيني من عملية الاستخراج. لذلك ، في جميع تحليلات QS3D ، تم تضمين المجموعات السكانية السلبية الإضافية في عدد الأقسام السالبة عن طريق ضبط قيمة عتبة شدة الفلورسنت (انظر الشكل التكميلي عبر الإنترنت S8). لم يتم ملاحظة ذلك في التجارب التي أجريت على منصات القطيرات 2.

ABL1 أظهرت أرقام نسخ النص المقاسة لجميع منصات RT-dPCR الثلاثة ارتباطًا جيدًا مع RT-qPCR عبر جميع مجموعات العينات (ص 2 = 0.91 و 0.93 و 0.95 لـ QS3D و QX200 و RainDrop على التوالي الشكل 1 أ). RT-dPCR الكمي BCR-ABL1 ترتبط أرقام نسخ النص بشكل جيد بـ RT-qPCR عبر جميع الأنظمة الأساسية الثلاثة فقط وصولاً إلى ≥0.1٪ (ص 2 = 0.85 و 0.94 و 0.92 لـ QS3D و QX200 و RainDrop على التوالي الشكل 1 ب). أقل من 0.1 ٪ ، بينما تم الحفاظ على ارتباطات رقم النسخ بين RT-qPCR وقياسات RT-dPCR 3 ، أنتج RT-dPCR تباينًا أكبر في قياسات النسخ المتماثل لكل عينة لم يتم ملاحظتها لقياسات RT-qPCR النظيرة. ومن المثير للاهتمام ، نسخ عدد تركيزات ل BCR-ABL1 كانت النصوص متشابهة عبر المنصات الأربعة بينما ABL1 أظهرت التركيزات المزيد من التباين. كما ٪BCR-ABL1 يرتبط IS ارتباطًا جوهريًا بتركيزات عدد النسخ لكلا الهدفين ، وزيادة التباين في ABL1 أسفرت النصوص في٪BCR-ABL يتفاوت بشكل متكرر بترتيب واحد من حيث الحجم عند مقارنته بـ RT-qPCR (ص 2 = 0.89 ، 0.92 ، 0.97 لـ QS3D ، QX200 ، RainDrop ، على التوالي الشكل 1C). علاوة على ذلك ، لم تكن أي من المنصات قادرة على تحسين حساسية القياس الكمي بشكل كبير بواسطة RT-qPCR في عينات المرضى بنسبة٪BCR-ABL1 هو مستوى & lt0.001٪.

مقارنة RT-qPCR مع RT-dPCR لتقدير BCR-ABL1 و ABL1 أرقام نسخ النصوص في العينات السريرية.

مخططات مبعثرة توضح العلاقة الخطية بين القياس الكمي لـ (أ) ، BCR-ABL1، (ب)، ABL1، و (ج) ،٪BCR-ABL1 يكون . التحديد الكمي لـ (كدنا) المستمدة من العينات السريرية بواسطة RT-qPCR (x-axis) مع منصات QS3D (الأزرق) و QX200 (الأخضر) و RainDrop (الأحمر). تمثل كل نقطة بيانات القيمة المتوسطة المشتقة من تفاعلات ثلاثية أو 9 مكررة. كانت معاملات الارتباط على النحو التالي: (ص 2 = 0.91 ، 0.93 ، 0.95 لـ QS3D ، QX200 ، RainDrop ، على التوالي) لـ ABL1 أرقام نسخ النصوص (ص 2 = 0.85 ، 0.94 ، 0.92 لـ QS3D ، QX200 ، RainDrop ، على التوالي) لـ BCR-ABL1 أرقام نسخ النصوص (ص 2 = 0.89 ، 0.92 ، 0.97 لـ QS3D ، QX200 ، RainDrop ، على التوالي) بالنسبة المئويةBCR-ABL1 يكون .

مخططات مبعثرة توضح العلاقة الخطية بين القياس الكمي لـ (أ) ، BCR-ABL1، (ب)، ABL1، و (ج) ،٪BCR-ABL1 يكون . التحديد الكمي لـ (كدنا) المستمدة من العينات السريرية بواسطة RT-qPCR (x-axis) مع منصات QS3D (الأزرق) و QX200 (الأخضر) و RainDrop (الأحمر). تمثل كل نقطة بيانات القيمة المتوسطة المشتقة من تفاعلات ثلاثية أو 9 مكررة. كانت معاملات الارتباط على النحو التالي: (ص 2 = 0.91 ، 0.93 ، 0.95 لـ QS3D ، QX200 ، RainDrop ، على التوالي) لـ ABL1 أرقام نسخ النصوص (ص 2 = 0.85 ، 0.94 ، 0.92 لـ QS3D ، QX200 ، RainDrop ، على التوالي) لـ BCR-ABL1 أرقام نسخ النصوص (ص 2 = 0.89 ، 0.92 ، 0.97 لـ QS3D ، QX200 ، RainDrop ، على التوالي) بالنسبة المئويةBCR-ABL1 يكون .

عند استخدام QS3D ، كان هناك ارتباط جيد يصل إلى ما يقرب من 20 نسخة من BCR-ABL1 النصوص ، والتي لوحظ تحتها هضبة (الشكل 2). لتقدير أقل فئتي CML المتبقيتين ، 0.001٪ (حيث أرجع RT-qPCR قيمة ثابتة لنسخة واحدة لكل 3 ميكرولتر (كدنا) لجميع المرضى العشرة) و & lt0.001٪ (حيث كانت نتائج qPCR سلبية) ، كل 3 RT أجهزة dPCR المكتشفة تضخيم BCR-ABL1 الأهداف (الشكل 2). ومع ذلك ، أظهرت مجموعات التحكم التي لا تحتوي على سرطان الدم النخاعي المزمن أيضًا قياسًا إيجابيًا لـ BCR-ABL1 التي جعلت القياسات التي تم الحصول عليها في مجموعات المرض المنخفضة غير قابلة للتمييز عن ضوضاء الخلفية العادية (الشكل 2). كما هو متوقع ، كان RT-qPCR سلبيًا باستمرار مع عدم وجود BCR-ABL1 تم قياس النصوص في فئة & lt0.001٪ (تم اختيار العينات في هذه الفئة بناءً على قراءة صفرية بواسطة RT-qPCR) ، ولكنها اكتشفت 1-3 نسخ في بعض مجموعات مرضى المراقبة و NTCs. كان لمنصات QS3D و Raindrop معدل إيجابي كاذب ملموس (FPR) في تفاعلات NTC بينما لوحظت قطيرة إيجابية واحدة فقط في 1 من تفاعلات NTC الثلاثين باستخدام منصة QX200 (الشكل 2).

مقارنة بين BCR-ABL1 تم قياس أعداد نسخ النص لكل تفاعل في مريض منخفض مستوى المرض (≤0.01٪) وعينات التحكم المتطابقة.

يتم عرض المرضى الثلاثة ذوي مستوى المرض المنخفض كما تم قياسه بواسطة RT-qPCR (0.01٪ ، 0.001٪ ، & lt0.001٪) مع عناصر تحكم غير مطابقة لـ CML (SNH و SNB) والتي هي اسميًا 0٪ BCR-ABL1 يكون . تم إنشاء تفاعلات NTC مع الماء بدلاً من cDNA. تُظهر مخططات الصندوق النطاق المتوسط ​​والربيعي مع شعيرات تُظهر الحد الأدنى والحد الأقصى لنقاط البيانات من 9 مكررات لكل منصة. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى الصفر BCR-ABL1 نسخ نصية لكل رد فعل.

يتم عرض المرضى الثلاثة ذوي مستوى المرض المنخفض كما تم قياسه بواسطة RT-qPCR (0.01٪ ، 0.001٪ ، & lt0.001٪) مع عناصر تحكم غير مطابقة لـ CML (SNH و SNB) والتي هي اسميًا 0٪ BCR-ABL1 يكون . تم إنشاء تفاعلات NTC مع الماء بدلاً من cDNA. تُظهر مخططات الصندوق النطاق المتوسط ​​والربيعي مع شعيرات تُظهر الحد الأدنى والحد الأقصى لنقاط البيانات من 9 مكررات لكل منصة. يشير الخط الأفقي المتقطع إلى الصفر BCR-ABL1 نسخ نصية لكل رد فعل.

بالنسبة لمنصة QX200 ، كانت الهضبة أقل وضوحًا من تلك التي لوحظت مع QS3D. كان FPR أقل بشكل واضح من منصات QS3D و Raindrop. ومع ذلك ، بالنسبة لـ QX200 ، فإن القراءات التي تم الحصول عليها من أدنى 3 فئات من سرطان الدم النخاعي المزمن (≤0.01٪) لا يمكن تمييزها عن مجموعات مرضى التحكم السلبي (الشكل 2). فقط منصة Raindrop كانت قادرة على قياس النسبة المئوية BCR-ABL1 هو في نطاق & lt0.001٪ عند مستوى أعلى من FPR في مجموعات مرضى التحكم (الشكل 2). ربما كان هذا مرتبطًا بالحجم الأكبر من (كدنا) الذي تمت إضافته إلى كل تفاعل (10 ميكرولتر مقابل 1 ميكرولتر). ومع ذلك ، في عينات مرضى سرطان الدم النخاعي المزمن ، لم تحدد منصة Raindrop أي اختلاف في BCR-ABL1 النسخ مقارنة بمستوى المرض الذي تم تعيينه لهم بواسطة RT-qPCR (0.01٪ ، 0.001٪ أو & lt0.001٪ الشكل 2).

استكشفنا تأثير كميات مختلفة من المدخلات (كدنا) على الحساسية من خلال إجراء 9 تفاعلات مكررة على منصات dPCR مع 20000 قسم (أي باستخدام إجمالي 9 ميكرولتر من (كدنا)) للعينات المعروفة بأنها أقل من معدل وفيات الأمهات (0.1٪ IS) باعتباره يعني اختبار حجم أكبر من [كدنا] لكل عينة. أدى هذا إلى زيادة الدقة الكمية ولكن ليس من حساسية الاختبارات.


التحقق من صحة الجينات المرجعية لتطبيع RT-qPCR في الفول الشائع أثناء الضغوط الحيوية واللاأحيائية

يعد اختيار الجينات المرجعية أحد الاعتبارات الأساسية لزيادة دقة وجودة تحليل التعبير النسبي بواسطة طريقة RT-PCR الكمية. تم تقييم ثبات ثماني علامات تسلسل معبر عنها لتحديد الجينات المرجعية المحتملة لدراسة التعبير التفاضلي للجينات الشائعة للفاصوليا المستهدفة تحت الأحيائية (تفاعل غير متوافق بين الفول الشائع والفطريات Colletotrichum lindemuthianum) والإجهادات اللاأحيائية (الجفاف والملوحة ودرجة الحرارة الباردة). كفاءة منحنيات التضخيم ودورة القياس الكمي (ج ف) باستخدام برنامج LinRegPCR. تم الحصول على استقرار الجينات المرجعية المرشحة باستخدام برنامجي geNorm و NormFinder ، بينما تطبيع التعبير التفاضلي للجينات المستهدفة [بيتا-1,3-جلوكاناز 1 (BG1) الجين للتوتر الحيوي و التجفاف استجابة عنصر ملزمة (دريب) الجين للضغط اللاأحيائي] تم تعريفه بواسطة برنامج REST. تم الحصول على ثبات عالي لـ إنزيم الأنسولين المهين (IDE), الأكتين-11 (قانون 11), غير معروف 1 (المملكة المتحدة 1) و غير معروف 2 (المملكة المتحدة 2) الجينات أثناء الإجهاد الحيوي ، ول SKP1 / اسأل-تفاعل البروتين 16 (تخطي 16), قانون 11, توبولين بيتا-8 (β-حوض 8) و Unk1 الجينات تحت الضغوط اللاأحيائية. لكن، IDE و قانون 11 تم الإشارة إليها على أنها أفضل مزيج من الجينات المرجعية لتحليل الإجهاد الحيوي ، في حين أن تخطي 16 و قانون 11 كانت الجينات هي أفضل توليفة لدراسة الإجهاد اللاأحيائي. يجب أن تكون هذه الجينات مفيدة في تطبيع التعبير الجيني عن طريق تحليل RT-PCR في الفول الشائع ، وهو البقوليات الأكثر أهمية للأكل.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


شكر وتقدير

نشكر Luis Roberto Aguiar على مساعدته في تربية الملكات العديدة اللازمات لهذه الدراسة ، Gustavo Jacomini Tiberio للمساعدة في تشريح المبيض ، والدكتورة Karina R. تلقت الدراسة دعمًا ماليًا من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP ، أرقام المنح 2014 / 08147-3 ، 2011 / 03171-5 ، 2012/01808 / -9) و Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq رقم المنحة 303401 / 2014-1).


خلفية

العدوى الجهازية التي تسببها البكتيريا سالبة الجرام فرانسيسيلا نواتونينسيس لا يزال يشكل تهديدًا خطيرًا لسمك القد الأطلسي جادوس مورهوا الزراعة في النرويج. أمراض مماثلة مرتبطة بسلالات مختلفة من F. noatunensis تم الإبلاغ عنها في كل من أسماك المياه العذبة والبحرية المستزرعة في تايوان واليابان [1] شيلي [2] وأمريكا [3] وبريطانيا العظمى [4]. ومع ذلك ، توجد فجوات كبيرة في المعرفة فيما يتعلق بالإمراض وآليات تطور المرض. كشف تحليل الجينوم الأخير عن وجود العديد من المواضع المحددة للفوعة في مسببات الأمراض للأسماك فرانسيسيلا spp. ، التي تشترك في درجة عالية من هوية التسلسل مع الممرض البشري F. tularensis[5]. يتم ترجمة بعض الجينات الأكثر إثارة للاهتمام على 33 كيلو بايت فرانسيسيلا جزيرة القدرة المرضية (FPI) [6،7] ، بما في ذلك جينات عامل النمو داخل الخلايا iglABCD. ال iglC وقد ثبت أيضًا أن الجين مهم للفوعة في F. noatunensis ssp. أورينتاليس[8,9].

تتمثل إحدى طرق التحقيق في التسبب في المرض على المستوى الجزيئي في تحليل النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) للنسخ الجيني في مراحل مختلفة من تطور المرض. ومع ذلك ، فإن استخدام RT-qPCR لدراسات النسخ الجيني له عيوبه. تحتوي الطريقة على متطلب جوهري لتطبيع مستويات نسخ الجينات المستهدفة مقابل تلك الخاصة بالجينات المرجعية لضمان تفسير موثوق للبيانات ، كما يتضح من Dedha et al. [10] ، وجويتيريز وآخرون. [11]. تم اقتراح استخدام ما لا يقل عن ثلاث جينات مرجعية تم التحقق من صحتها [12]. وبالمثل ، تم التأكيد على أهمية توحيد تقنيات استخراج الحمض النووي الريبي ، وتقييم جودة الحمض النووي الريبي واستخدام الجينات المرجعية في العديد من المنشورات [13-15].

في هذه الدراسة ، تم تثبيت الاستقرار النسخي لثمانية جينات مرجعية في فرانسيسيلا نواتونينسيس ssp. تم التحقيق في ظل ثلاثة ظروف بيئية مختلفة باستخدام برنامج GeNorm القائم على Excel [12]. لتقدير التغييرات بدقة في مستويات النسخ لأهداف mRNA محددة ، فإن iglC تم اختيار الجين وتطبيعه مقابل الجينات المرجعية المختارة التي تخضع لظروف النمو نفسها باستخدام البروتوكول المعمول به.


معلومات الكاتب

الانتماءات

Université de Toulouse INSA، UPS، INP LISBP، 135 Avenue de Rangueil، F-31077، Toulouse، France

أوجستينا لانوس وجان ماري فرانسوا وجان لوك بارو

INRA، UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés، F-31400، Toulouse، France

أوجستينا لانوس وجان ماري فرانسوا وجان لوك بارو

CNRS ، UMR5504 ، F-31400 ، تولوز ، فرنسا

أوجستينا لانوس وجان ماري فرانسوا وجان لوك بارو

Cinabio-Adisseo France S.A.S.، 135 Avenue de Rangueil، 31077، Toulouse، France

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

المؤلف المراسل


مراجع

أبوقمر ، س ، تشاي ، م- ف ، لو ، هـ ، سونج ، ف ، ومنجيست ، ت. (2008). يتوسط بروتين كيناز 1 ب في إشارة استجابات النبات للفطريات النخرية والحيوانات العاشبة للحشرات. الخلية النباتية 20 ، 1964 & # x020131983. دوى: 10.1105 / tpc.108.059477

أبو قمر ، إس ، تشين ، إكس ، داوان ، آر ، بلوم ، بي ، سالميرون ، جي ، لام ، إس ، وآخرون. (2006). يكشف تحديد ملامح التعبير وتحليل الطفرات عن شبكات تنظيمية معقدة تشارك في استجابة Arabidopsis لعدوى Botrytis. مصنع J. 48 ، 28 & # x0201344. دوى: 10.1111 / j.1365-313X.2006.02849.x

ألبا ، آر ، بايتون ، بي ، فاي ، زي ، مكوين ، آر ، ديبي ، بي ، مارتن ، جي بي ، وآخرون. (2005). تكشف تحليلات النسخ والمستقلب المختار عن نقاط متعددة للتحكم في الإيثيلين أثناء نمو فاكهة الطماطم. الخلية النباتية 17 ، 2954 & # x020132965. دوى: 10.1105 / tpc.105.036053

Audenaert ، K. ، Pattery ، T. ، Cornelis ، P. ، and H & # x000F6fte ، M. (2002). تحريض المقاومة الجهازية ل بوتريتيس سينيريا في الطماطم بواسطة Pseudomonas aeruginosa 7NSK2: دور حمض الساليسيليك والبيوكلين والبيوسيانين. مول. تفاعل ميكروب النبات. 15 ، 1147 & # x020131156. دوى: 10.1094 / MPMI.2002.15.11.1147

باليني ، إي ، نغوين ، تي تي ، وموريل ، ج. (2013). تنوع ووراثة القابلية التي يسببها النيتروجين لفطر الانفجار في الأرز والقمح. أرز 6:32. دوى: 10.1186 / 1939-8433-6-32

Benjamini، Y. and Hochberg، Y. (1995). التحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ: نهج عملي وقوي للاختبارات المتعددة. J.R Statist. شركة ب دوى: 10.1198 / 016214504000001907

بيرجر ، س. ، سينها ، أ.ك. ، ورويتش ، ت. (2007). يلتقي فسيولوجيا النبات بعلم الأمراض النباتية: التمثيل الغذائي للنبات والتفاعلات المسببة للأمراض النباتية. J. إكسب. بوت. 58 ، 4019 & # x020134026. دوى: 10.1093 / jxb / erm298

بيروكال - لوبو ، م ، مولينا ، أ ، وسولانو ، ر. (2002). التعبير التأسيسي عن ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 في نبات الأرابيدوبسيس يمنح مقاومة للعديد من الفطريات النخرية. مصنع J. 29 ، 23 & # x0201332. دوى: 10.1046 / j.1365-313x.2002.01191.x

Blanco-Ulate، B.، Vincenti، E.، Powell، A.L.T، and Cantu، D. (2013). تشير تحليلات نصوص الطماطم والطفرات إلى دور هرمونات الإجهاد النباتية في التفاعل بين الفاكهة و بوتريتيس سينيريا. أمام. علوم النبات. 4: 142. دوى: 10.3389 / fpls.2013.00142

بولتون ، إم دي (2009). التمثيل الغذائي الأساسي ودفاع النبات & # x02013fuel for the fire. مول. تفاعل ميكروب النبات. 22 ، 487 & # x02013497. دوى: 10.1094 / MPMI-22-5-0487

بويل ، إي آي ، وينج ، إس ، جولوب ، جي ، جين ، إتش ، وبوتستين ، د. (2004). GO :: TermFinder & # x02014open برنامج المصدر للوصول إلى معلومات Gene Ontology وإيجاد مصطلحات Gene Ontology المثرية بشكل كبير والمرتبطة بقائمة الجينات. المعلوماتية الحيوية 20 ، 3710 & # x020133715. دوى: 10.1093 / المعلوماتية الحيوية / bth456

بريتلينغ ، آر ، أرمنجود ، بي ، أمتمان ، إيه ، وهيرزيك ، بي (2004). تصنيف المنتجات: طريقة بسيطة ، لكنها قوية ، وجديدة لاكتشاف الجينات المنظمة تفاضليًا في تجارب المصفوفات الدقيقة المكررة. FEBS ليت. 573 ، 83 & # x0201392. دوى: 10.1016 / j.febslet.2004.07.055

Caarls، L.، Pieterse، C.M J.، and Van Wees، S.C M. (2015). كيف يأخذ حمض الساليسيليك السيطرة النسخية على إشارات حمض الياسمين. أمام. علوم النبات. 6:17. دوى: 10.3389 / fpls.2015.00170

Cama & # x000F1es، G.، Pastor، V.، Cerezo، M.، Garc & # x000EDa-Andrade، J.، Vicedo، B.، Garc & # x000EDa-Agust & # x000EDn، P.، et al. (2012). يؤدي الحذف في NRT2.1 إلى تخفيف الاضطرابات الهرمونية التي يسببها Pseudomonas syringae ، مما يؤدي إلى دفاعات نباتية معدة. نبات فيزيول. 158 ، 1054 & # x020131066. دوى: 10.1104 / ص 111.184424

كانيسا ، ب ، شوماخر ، جيه ، هيفيا ، إم إيه ، تودزينسكي ، بي ، ولاروندو ، إل إف (2013). تقييم تأثيرات الضوء على تمايز وضراوة مسببات الأمراض النباتية بوتريتيس سينيريا: توصيف مجمع ذوي الياقات البيضاء. بلوس واحد 8: e84223. دوى: 10.1371 / journal.pone.0084223

كانتو ، دي ، بلانكو أولاتي ، بي ، يانغ ، إل ، لابافيتش ، جي إم ، بينيت ، إيه بي ، وباول ، إيه إل تي (2009). النضوج - تنظيم حساسية ثمار الطماطم بوتريتيس سينيريا يتطلب NOR ولكن ليس RIN أو الإيثيلين. نبات فيزيول. 150 ، 1434 & # x020131449. دوى: 10.1104 / ص 109.138701

كانتو ، دي ، فيسينتي ، إيه.ر. ، جريف ، إل سي ، ديوي ، إف إم ، بينيت ، إيه بي ، لابافيتش ، جي إم ، وآخرون. (2008). التقاطع بين تفكيك جدار الخلية والنضج وقابلية الثمار بوتريتيس سينيريا. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 105 ، 859 & # x02013864. دوى: 10.1073 / pnas.0709813105

Castro Mar & # x000EDn، I.، Loef، I.، Bartetzko، L.، Searle، I.، Coupland، G.، Stitt، M.، et al. (2010). Nitrate regulates floral induction in Arabidopsis, acting independently of light, gibberellin and autonomous pathways. بلانتا 233, 539�. doi: 10.1007/s00425-010-1316-5

Catinot, J., Huang, J. B., and Huang, P. Y. (2015). ETHYLENE RESPONSE FACTOR 96 positively regulates Arabidopsis resistance to necrotrophic pathogens by direct binding to GCC elements of jasmonate𠄺nd …. مصنع. doi: 10.1111/pce.12583

Davidson, J. A., Pande, S., Bretag, T. W., Lindbeck, K. D., and Krishna-Kishore, G. (2007). 𠇋iology and management of botrytis spp. in legume crops,” in Botrytis: Biology, Pathology and Control, eds Y. Elad, B. Williamson, P. Tudzynski, and N. Delen (Dordrecht: Springer), 295�. doi: 10.1007/978-1-4020-2626-3_16

Dean, R., van Kan, J. A. L., Pretorius, Z. A., Hammond-Kosack, K. E., Di Pietro, A., Spanu, P. D., et al. (2012). The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. مول. Plant Pathol. 13, 414�. doi: 10.1111/J.1364-3703.2011.00783.X

Dechorgnat, J., Patrit, O., Krapp, A., Fagard, M., and Daniel-Vedele, F. (2012). Characterization of the Nrt2.6 gene in Arabidopsis thaliana: a link with plant response to biotic and abiotic stress. بلوس واحد 7:e42491. doi: 10.1371/journal.pone.0042491

Dekkers, B. J. W., Willems, L., Bassel, G. W., van Bolderen-Veldkamp, R. P. M., Ligterink, W., Hilhorst, H. W. M., et al. (2012). Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. فيسيول الخلية النباتية. 53, 28�. doi: 10.1093/pcp/pcr113

D໚z, J., ten Have, A., and van Kan, J. A. (2002). The role of ethylene and wound signaling in resistance of tomato to بوتريتيس سينيريا. نبات فيزيول. 129, 1341�. doi: 10.1104/pp.001453

Dietrich, R., Plo, ß. K., and Heil, M. (2004). Constitutive and induced resistance to pathogens in Arabidopsis thaliana depends on nitrogen supply. Plant Cell Environ. 27, 896�. doi: 10.1111/j.1365-3040.2004.01195.x

Dordas, C. (2008). Role of nutrients in controlling plant diseases in sustainable agriculture. A Rev. Agron. الحفاظ. ديف. 28, 33�. doi: 10.1051/agro:2007051

Edgar, R., Domrachev, M., and Lash, A. E. (2002). Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. الدقة الأحماض النووية. 30, 207�. doi: 10.1093/nar/30.1.207

Edwards, K., Johnstone, C., and Thompson, C. (1991). A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. الدقة الأحماض النووية. 19, 1349.

Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., and Botstein, D. (1998). تحليل الكتلة وعرض أنماط التعبير على مستوى الجينوم. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 95, 14863�

Fagard, M., Launay, A., Clément, G., Courtial, J., Dellagi, A., Farjad, M., et al. (2014). Nitrogen metabolism meets phytopathology. J. إكسب. بوت. 65, 5643�. doi: 10.1093/jxb/eru323

Farmer, E. E., Alméras, E., and Krishnamurthy, V. (2003). Jasmonates and related oxylipins in plant responses to pathogenesis and herbivory. بالعملة. رأي. مصنع بيول. 6, 372�. doi: 10.1016/S1369-5266(03)00045-1

Ferrari, S., Plotnikova, J. M., and De Lorenzo, G. (2003). Arabidopsis local resistance to بوتريتيس سينيريا involves salicylic acid and camalexin and requires EDS4 and PAD2, but not SID2, EDS5 or PAD4. مصنع J. 35, 193�. doi: 10.1046/j.1365-313X.2003.01794.x

Fu, Y., Yi, H., Bao, J., and Gong, J. (2015). LeNRT2.3 functions in nitrate acquisition and long-distance transport in tomato. FEBS ليت. 589, 1072�. doi: 10.1016/j.febslet.2015.03.016

Gachon, C., and Saindrenan, P. (2004). Real-time PCR monitoring of fungal development in Arabidopsis thaliana infected by Alternaria brassicicola and بوتريتيس سينيريا. نبات فيزيول. بيوتشيم. 42, 367�. doi: 10.1016/j.plaphy.2004.04.001

Gautier, L., Cope, L., Bolstad, B. M., and Irizarry, R. A. (2004). affy𠅊nalysis of Affymetrix GeneChip data at the probe level. المعلوماتية الحيوية 20, 307�. doi: 10.1093/bioinformatics/btg405

Giovannoni, J. J. (2007). Fruit ripening mutants yield insights into ripening control. بالعملة. رأي. مصنع بيول. 10, 283�. doi: 10.1016/j.pbi.2007.04.008

Glazebrook, J. (2005). Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. القس فيتوباثول. 43, 205�. doi: 10.1146/annurev.phyto.43.040204.135923

Good, A. G., Shrawat, A. K., and Muench, D. G. (2004). Can less yield more? Is reducing nutrient input into the environment compatible with maintaining crop production? اتجاهات نباتية. 9, 597�. doi: 10.1016/j.tplants.2004.10.008

Hey, S. J., Byrne, E., and Halford, N. G. (2010). The interface between metabolic and stress signalling. آن. بوت. 105, 197�. doi: 10.1093/aob/mcp285

Hirel, B., Tétu, T., Lea, P. J., and Dubois, F. (2011). Improving nitrogen use efficiency in crops for sustainable agriculture. الاستدامة 3, 1452�. doi: 10.3390/su3091452

Hoffland, E., Jeger, M. J., and van Beusichem, M. L. (2000). Effect of nitrogen supply rate on disease resistance in tomato depends on the pathogen. Plant Soil 218, 239�. doi: 10.1023/A:1014960507981

Hoffland, E., van Beusichem, M. L., and Jeger, M. J. (1999). Nitrogen availability and susceptibility of tomato leaves to بوتريتيس سينيريا. Plant Soil 210, 263�. doi: 10.1023/A:1004661913224

Hwang, I. S., An, S. H., and Hwang, B. K. (2011). Pepper asparagine synthetase 1 (CaAS1) is required for plant nitrogen assimilation and defense responses to microbial pathogens. مصنع J. 67, 749�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2011.04622.x

Irizarry, R. A., Hobbs, B., Collin, F., Beazer-Barclay, Y. D., Antonellis, K. J., Scherf, U., et al. (2003). Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostat. 4, 249�. doi: 10.1093/biostatistics/4.2.249

Jones, P., Binns, D., Chang, H.-Y., Fraser, M., Li, W., McAnulla, C., et al. (2014). InterProScan 5: genome-scale protein function classification. المعلوماتية الحيوية 30, 1236�. doi: 10.1093/bioinformatics/btu031

Kachroo, P., Shanklin, J., Shah, J., Whittle, E. J., and Klessig, D. F. (2001). A fatty acid desaturase modulates the activation of defense signaling pathways in plants. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 98, 9448�. doi: 10.1073/pnas.151258398

Kangasjärvi, S., Neukermans, J., Li, S., Aro, E.-M., and Noctor, G. (2012). Photosynthesis, photorespiration, and light signalling in defence responses. J. إكسب. بوت. 63, 1619�. doi: 10.1093/jxb/err402

Kliebenstein, D. J., Rowe, H. C., and Denby, K. J. (2005). Secondary metabolites influence Arabidopsis/Botrytis interactions: variation in host production and pathogen sensitivity. مصنع J. 44, 25�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2005.02508.x

Lamb, C., and Dixon, R. A. (1997). The oxidative burst in plant disease resistance. Annu. القس فيزيول النبات. مصنع مول. بيول. 48, 251�. doi: 10.1146/annurev.arplant.48.1.251

Lau, G., and Hamer, J. E. (1996). Regulatory genes controlling MPG1 expression and pathogenicity in the rice blast fungus magnaporthe grisea. الخلية النباتية 8, 771�. doi: 10.1105/tpc.8.5.771

Lecompte, F., Abro, M. A., and Nicot, P. C. (2010). Contrasted responses of بوتريتيس سينيريا isolates developing on tomato plants grown under different nitrogen nutrition regimes. Plant Pathol. 59, 891�. doi: 10.1111/j.1365-3059.2010.02320.x

Lecompte, F., Abro, M. A., and Nicot, P. C. (2013). Can plant sugars mediate the effect of nitrogen fertilization on lettuce susceptibility to two necrotrophic pathogens: بوتريتيس سينيريا and Sclerotinia sclerotiorum? Plant Soil 369, 387�. doi: 10.1007/s11104-012-1577-9

Li, C., He, X., Luo, X., Xu, L., Liu, L., Min, L., et al. (2014). Cotton WRKY1 mediates the plant defense-to-development transition during infection of cotton by Verticillium dahliae by activating JASMONATE ZIM-DOMAIN1 expression. نبات فيزيول. 166, 2179�. doi: 10.1104/pp.114.246694

Li, J., Brader, G., and Palva, E. T. (2004). The WRKY70 transcription factor: a node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense. الخلية النباتية 16, 319�. doi: 10.1105/tpc.016980

Li, L., Stoeckert, C. J. Jr., and Roos, D. S. (2003). OrthoMCL: identification of ortholog groups for eukaryotic genomes. الدقة الجينوم. 13, 2178�. doi: 10.1101/gr.1224503

Linquist, B. A., Byous, E., Jones, G., Williams, J. F., and Six, J. (2008). Nitrogen and potassium fertility impacts on aggregate sheath spot disease and yields of rice. Plant Prod. علوم. 11, 260�. doi: 10.1626/pps.11.260

Liu, G., Ji, Y., Bhuiyan, N. H., Pilot, G., Selvaraj, G., Zou, J., et al. (2010). Amino acid homeostasis modulates salicylic acid-associated redox status and defense responses in Arabidopsis. الخلية النباتية 22, 3845�. doi: 10.1105/tpc.110.079392

Long, D. H., Lee, F. N., and TeBeest, D. O. (2007). Effect of nitrogen fertilization on disease progress of rice blast on susceptible and resistant cultivars. مصنع ديس. 84, 403�. doi: 10.1094/PDIS.2000.84.4.403

Lorenzo, O., Piqueras, R., Sánchez-Serrano, J. J., and Solano, R. (2003). ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 integrates signals from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. الخلية النباتية 15, 165�. doi: 10.1105/tpc.007468

Løvdal, T., and Lillo, C. (2009). Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in tomato subjected to nitrogen, cold, and light stress. شرجي. بيوتشيم. 387, 238�. doi: 10.1016/j.ab.2009.01.024

Masclaux-Daubresse, C., and Daniel-Vedele, F. (2010). Nitrogen uptake, assimilation and remobilization in plants: challenges for sustainable and productive agriculture. Ann Bot. 105, 1141�. doi: 10.1093/aob/mcq028

Massad, T. J., Dyer, L. A., and Vega, C. G. (2012). Costs of defense and a test of the carbon-nutrient balance and growth-differentiation balance hypotheses for two co-occurring classes of plant defense. بلوس واحد 7:e47554. doi: 10.1371/journal.pone.0047554

Mathioni, S. M., Bel, ó. A., Rizzo, C. J., Dean, R. A., and Donofrio, N. M. (2011). Transcriptome profiling of the rice blast fungus during invasive plant infection and في المختبر stresses. علم الجينوم BMC 12:049. doi: 10.1186/1471-2164-12-49

McGrath, K. C., Dombrecht, B., Manners, J. M., Schenk, P. M., Edgar, C. I., Maclean, D. J., et al. (2005). Repressor- and activator-type ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen of Arabidopsis transcription factor gene expression. نبات فيزيول. 139, 949�. doi: 10.1104/pp.105.068544

Morris, J. H., Apeltsin, L., Newman, A. M., Baumbach, J., Wittkop, T., Su, G., et al. (2011). clusterMaker: a multi-algorithm clustering plugin for Cytoscape. المعلوماتية الحيوية BMC 12:436. doi: 10.1186/1471-2105-12-436

Nandi, A., Moeder, W., and Kachroo, P. (2005). Arabidopsis ssi2-conferred susceptibility to Botrytis cinerea is dependent on EDS5 and PAD4. مول. Plant Pathol. 18, 363�. doi: 10.1094/MPMI-18-0363

von Wirén, N., Lauter, F. R., Ninnemann, O., Gillissen, B., Walch-Liu, P., Engels, C., et al. (2000). Differential regulation of three functional ammonium transporter genes by nitrogen in root hairs and by light in leaves of tomato. مصنع J. 21, 167�. doi: 10.1046/j.1365-313x.2000.00665.x

Obayashi, T., Okamura, Y., Ito, S., Tadaka, S., Aoki, Y., Shirota, M., et al. (2014). ATTED-II in 2014: evaluation of gene coexpression in agriculturally important plants. فيسيول الخلية النباتية. 55, e6(1𠄷). doi: 10.1093/pcp/pct178

Olesen, J. E., Jørgensen, L. N., Petersen, J., and Mortensen, J. V. (2003). Effects of rates and timing of nitrogen fertilizer on disease control by fungicides in winter wheat. 2. Crop growth and disease development. J. أغر. علوم. 140, 15�. doi: 10.1017/S0021859602002897

Pageau, K., Reisdorf-Cren, M., Morot-Gaudry, J.-F., and Masclaux-Daubresse, C. (2006). The two senescence-related markers, GS1 (cytosolic glutamine synthetase) and GDH (glutamate dehydrogenase), involved in nitrogen mobilization, are differentially regulated during pathogen attack and by stress hormones and reactive oxygen species in Nicotiana tabacum L. أوراق. J. إكسب. بوت. 57, 547�. doi: 10.1093/jxb/erj035

Pan, X., Zhu, B., Luo, Y., and Fu, D. (2013). Unraveling the protein network of tomato fruit in response to necrotrophic phytopathogenic Rhizopus nigricans. بلوس واحد 8:e73034. doi: 10.1371/journal.pone.0073034

Pieterse, C. M. J., Leon-Reyes, A., Van der Ent, S., and Van Wees, S. C. M. (2009). Networking by small-molecule hormones in plant immunity. Nat Chem Biol. 5, 308�. doi: 10.1038/nchembio.164

Poultney, C. S., Gutiérrez, R. A., Katari, M. S., Gifford, M. L., Paley, W. B., Coruzzi, G. M., et al. (2007). Sungear: interactive visualization and functional analysis of genomic datasets. المعلوماتية الحيوية 23, 259�. doi: 10.1093/bioinformatics/btl496

Pusztahelyi, T., Holb, I. J., and P༼si, I. (2015). Secondary metabolites in fungus-plant interactions. أمام. علوم النبات. 6:573. doi: 10.3389/fpls.2015.00573

Reid, K. E., Olsson, N., Schlosser, J., and Peng, F. (2006). An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development. بيول مصنع بيول. 6:27. doi: 10.1186/1471-2229-6-27

Rizhsky, L., Davletova, S., Liang, H., and Mittler, R. (2004). The zinc finger protein Zat12 is required for cytosolic ascorbate peroxidase 1 expression during oxidative stress in Arabidopsis. J. بيول. تشيم. 279, 11736�. doi: 10.1074/jbc.M313350200

Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Tzin, V., and Mysore, K. S. (2014). Regulation of primary plant metabolism during plant-pathogen interactions and its contribution to plant defense. أمام. علوم النبات. 5:17. doi: 10.3389/fpls.2014.00017

Scalschi, L., Sanmartín, M., Cama༞s, G., Troncho, P., Sánchez-Serrano, J. J., Garc໚-Agustín, P., et al. (2015). Silencing of OPR3 in tomato reveals the role of OPDA in callose deposition during the activation of defense responses against Botrytis cinerea. مصنع J. 81, 304�. doi: 10.1111/tpj.12728

Schneider, C. A., Rasband, W. S., and Eliceiri, K. W. (2012). NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. نات. أساليب 9, 671�. doi: 10.1038/nmeth.2089

Seifi, H., De Vleesschauwer, D., Aziz, A., and H཯te, M. (2014). Modulating plant primary amino acid metabolism as a necrotrophic virulence strategy: the immune-regulatory role of asparagine synthetase in Botrytis cinerea-tomato interaction. Plant Signal. Behav. 9:e27995. doi: 10.4161/psb.27995

Seifi, H. S., Curvers, K., De Vleesschauwer, D., Delaere, I., Aziz, A., and H཯te, M. (2013). Concurrent overactivation of the cytosolic glutamine synthetase and the GABA shunt in the ABA-deficient sitiens mutant of tomato leads to resistance against Botrytis cinerea. فيتول جديد. 199, 490�. doi: 10.1111/nph.12283

شانون ، ب ، ماركيل ، أ ، أوزيير ، أو.باليجا ، إن إس ، وانج ، ج.ت ، راماج ، دي ، وآخرون. (2003). Cytoscape: بيئة برمجية للنماذج المتكاملة لشبكات التفاعل الجزيئي الحيوي. الدقة الجينوم. 13, 2498�. دوى: 10.1101 / غرام .1239303

Smith, J. E., Mengesha, B., Tang, H., Mengiste, T., and Bluhm, B. H. (2014). Resistance to Botrytis cinerea in Solanum lycopersicoides involves widespread transcriptional reprogramming. علم الجينوم BMC 15:334. doi: 10.1186/1471-2164-15-334

Snoeijers, S. S., Pérez-Garc໚, A., Joosten, M. H. A. J., and De Wit, P. J. G. M. (2000). The effect of nitrogen on disease development and gene expression in bacterial and fungal plant pathogens. يورو. J. Plant Pathol. 106, 493�. doi: 10.1023/A:1008720704105

Su, G., Kuchinsky, A., Morris, J. H., States, D. J., and Meng, F. (2010). GLay: community structure analysis of biological networks. المعلوماتية الحيوية 26, 3135�. doi: 10.1093/bioinformatics/btq596

Thimm, O., Bläsing, O., Gibon, Y., Nagel, A., Meyer, S., Krüger, P., et al. (2004). mapman: a user𢄭riven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. مصنع J. 37, 914�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2004.02016.x/pdf

Thomma, B. P., Penninckx, I. A., Cammue, B. P., and Broekaert, W. F. (2001). The complexity of disease signaling in Arabidopsis. أوبن بالعملة إمونول. 13, 63�. doi: 10.1016/S0952-7915(00)00183-7

Torres, M. A., Jones, J. D. G., and Dangl, J. L. (2006). Reactive oxygen species signaling in response to pathogens. نبات فيزيول. 141, 373�. doi: 10.1104/pp.106.079467

Vanacker, H., Sandalio, L., Jiménez, A., Palma, J. M., Corpas, F. J., Meseguer, V., et al. (2006). Roles for redox regulation in leaf senescence of pea plants grown on different sources of nitrogen nutrition. J. إكسب. بوت. 57, 1735�. doi: 10.1093/jxb/erl012

Van Baarlen, P., Staats, M., and Van Kan, J. A. (2004). Induction of programmed cell death in lily by the fungal pathogen Botrytis elliptica. مول. Plant Pathol. 5, 559�. doi: 10.1111/J.1364-3703.2004.00253.X

Van der Does, D., Leon-Reyes, A., Koornneef, A., Van Verk, M. C., Rodenburg, N., Pauwels, L., et al. (2013). Salicylic acid suppresses jasmonic acid signaling downstream of SCFCOI1-JAZ by targeting GCC promoter motifs via transcription factor ORA59. الخلية النباتية 25, 744�. doi: 10.1105/tpc.112.108548

Vidal, E. A., Araus, V., Lu, C., Parry, G., Green, P. J., Coruzzi, G. M., et al. (2010). Nitrate-responsive miR393/AFB3 regulatory module controls root system architecture in Arabidopsis thaliana. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 107, 4477�. doi: 10.1073/pnas.0909571107

Vidal, E. A., Moyano, T. C., Canales, J., and Gutiérrez, R. A. (2014). Nitrogen control of developmental phase transitions in Arabidopsis thaliana. J. إكسب. بوت. 65, 5611�. doi: 10.1093/jxb/eru326

Vlot, A. C., Dempsey, D. A., and Klessig, D. F. (2009). Salicylic Acid, a multifaceted hormone to combat disease. Annu. القس فيتوباثول. 47, 177�. doi: 10.1146/annurev.phyto.050908.135202

Walters, D., and Heil, M. (2007). Costs and trade-offs associated with induced resistance. فيسيول. مول. Plant P. 71, 3�. doi: 10.1016/j.pmpp.2007.09.008

Walters, D. R., and Bingham, I. J. (2007). Influence of nutrition on disease development caused by fungal pathogens: implications for plant disease control. آن. تطبيق بيول. 151, 307�. doi: 10.1111/j.1744-7348.2007.00176.x

Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., and Crawford, N. M. (2003). Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. نبات فيزيول. 132, 556�. doi: 10.1104/pp.103.021253

Wang, R., Tischner, R., Gutiérrez, R. A., Hoffman, M., Xing, X., Chen, M., et al. (2004). Genomic analysis of the nitrate response using a nitrate reductase-null mutant of Arabidopsis. نبات فيزيول. 136, 2512�. doi: 10.1104/pp.104.044610

Wang, Y. H., Garvin, D. F., and Kochian, L. V. (2001). Nitrate-induced genes in tomato roots. Array analysis reveals novel genes that may play a role in nitrogen nutrition. نبات فيزيول. 127, 345�. doi: 10.1104/pp.127.1.345

Ward, J. L., Forcat, S., Beckmann, M., Bennett, M., Miller, S. J., Baker, J. M., et al. (2010). The metabolic transition during disease following infection of Arabidopsis thaliana by Pseudomonas syringae pv. tomato. مصنع J. 63, 443�. doi: 10.1111/j.1365-313X.2010.04254.x

Weirauch, M. T., Yang, A., Albu, M., Cote, A. G., Montenegro-Montero, A., Drewe, P., et al. (2014). Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity. زنزانة 158, 1431�. doi: 10.1016/j.cell.2014.08.009

Windram, O., Madhou, P., McHattie, S., Hill, C., Hickman, R., Cooke, E., et al. (2012). Arabidopsis defense against Botrytis cinerea: chronology and regulation deciphered by high-resolution temporal transcriptomic analysis. الخلية النباتية 24, 3530�. doi: 10.1105/tpc.112.102046

Windram, O., Penfold, C. A., and Denby, K. J. (2014). Network modeling to understand plant immunity. Annu. القس فيتوباثول. 52, 93�. doi: 10.1146/annurev-phyto-102313-050103

Zhang, G.-B., Yi, H.-Y., and Gong, J.-M. (2014). The Arabidopsis ethylene/jasmonic acid-NRT signaling module coordinates nitrate reallocation and the trade-off between growth and environmental adaptation. الخلية النباتية 26, 3984�. doi: 10.1105/tpc.114.129296

Zhang, H., Rong, H., and Pilbeam, D. (2007). Signalling mechanisms underlying the morphological responses of the root system to nitrogen in Arabidopsis thaliana. J. إكسب. بوت. 58, 2329�. doi: 10.1093/jxb/erm114

Keywords: nitrate nutrition, tomato, defense mechanisms, jasmonic acid, gene network analysis, ethylene signaling, microarray analysis

Citation: Vega A, Canessa P, Hoppe G, Retamal I, Moyano TC, Canales J, Gutiérrez RA and Rubilar J (2015) Transcriptome analysis reveals regulatory networks underlying differential susceptibility to بوتريتيس سينيريا in response to nitrogen availability in Solanum lycopersicum. أمام. علوم النبات. 6:911. doi: 10.3389/fpls.2015.00911

Received: 29 July 2015 Accepted: 12 October 2015
Published: 04 November 2015.

Stéphane Hacquard, Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Germany

Katherine Denby, University of Warwick, UK
Barbara Blanco-Ulate, University of California, Davis, USA

Copyright © 2015 Vega, Canessa, Hoppe, Retamal, Moyano, Canales, Gutiérrez and Rubilar. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License (CC BY). يُسمح بالاستخدام أو التوزيع أو الاستنساخ في منتديات أخرى ، بشرط أن يتم اعتماد المؤلف (المؤلفين) الأصلي أو المرخص له وأن يتم الاستشهاد بالنشر الأصلي في هذه المجلة ، وفقًا للممارسات الأكاديمية المقبولة. لا يُسمح بأي استخدام أو توزيع أو إعادة إنتاج لا يتوافق مع هذه الشروط.


شاهد الفيديو: How to Normalize cDNA Concentrations -- Ask TaqMan Ep. 15 by Life Technologies (شهر نوفمبر 2022).