معلومة

6.5: تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) - علم الأحياء

6.5: تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إعادة النظر

يتم تحقيق تكاثر الحمض النووي بواسطة إنزيم بوليميراز DNA الذي يتميز بالخصائص التالية:

  1. يحفز بوليميراز الحمض النووي تمديد أليغنوكليوتيد في 5 '→ 3' اتجاه. لا يمكن أن تسير في الاتجاه المعاكس.
  2. أ قالب الحمض النووي (أي أليغنوكليوتيد خصلة واحدة) مطلوب. هذه هي المعلومات التي يتم نسخها (عبر الاقتران الأساسي Watson-Crick). إذا كنت ترغب في تكرار خيط "الإحساس" الخاص بـ DNA مزدوج ، فإن القالب هو الشريط المضاد للحس. نظرًا لأن الحمض النووي عبارة عن مزدوج ، يتم تجميعه معًا بواسطة قوى غير تساهمية ، يمكننا فصل خيوط الطباعة المزدوجة (والحصول على قالب مناسب) عن طريق التمسخ الحراري (أو القلوي).
  3. يمكن لبوليميراز الحمض النووي أن يمتد فقط إلى قليل النوكليوتيد الموجود، لا يمكن بدء النسخ المتماثل. وهكذا ، بالإضافة إلى القالب ، يتطلب بوليميراز الحمض النووي أوليغنوكليوتيد أولي. يمتد بوليميراز الحمض النووي التمهيدي في 5 '3 'الاتجاه.
  4. يجب أن تكون النيوكليوتيدات المدمجة في قليل النوكليوتيد الناشئ نوكليوزيد ثلاثي الفوسفات (أي dNTP). تُستخدم الطاقة المنبعثة من التحلل المائي لروابط أنهيدريد الفوسفات في تكوين روابط تساهمية (دمج الفوسفات في العمود الفقري للفوسفوديستر من قليل النوكليوتيد المتنامي)
  5. على الرغم من أن بوليمرات الحمض النووي تحفز التمديد في 5 '3 'الاتجاه ، البعض لديه القدرة على "صحح بروفات الطباعة"قراءة الإثبات" هي القدرة على التعرف على خطأ في دمج قاعدة ما ، والقدرة على النسخ الاحتياطي واستئصال القاعدة غير الصحيحة ، ثم الاستمرار.

الشكل 6.5.1: تخليق الحمض النووي

  • PCR هو ملف في المختبر تقنية لتضخيم منطقة الحمض النووي التي تقع بين منطقتين من تسلسل معروف.
  • يتم تحقيق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيد. هذه عادة ما تكون قصيرة ، قليل النوكليوتيدات التي تقطعت بهم السبل والتي هي مكملة للمناطق الخارجية من تسلسل معروف.

الشكل 6.5.2: تضخيم PCR

تعمل oligonucleotides مثل الاشعال بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي وكل من الخيوط المشوهة للوصلة المزدوجة للحمض النووي الأبوي بمثابة نموذج.

ينتج عن هذا تخليق خيوط DNA جديدة مكملة لخيوط القالب الأصل.

خطوات:

  1. تمسخ القالب
  2. التلدين التمهيدي
  3. تمديد التمهيدي

تضم "دورة" واحدة في منهجية تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.

  • بعد كل دورة ، يمكن لخيوط الحمض النووي المركبة حديثًا بمثابة قوالب في الدورة التالية (عادةً ما يتم إضافة بادئات PCR في فائض كبير من الأضراس إلى قالب DNA)

ملخص المنتجات في نهاية كل دورة PCR:

الشكل 6.5.3: منتجات PCR

سيكون منتج PCR المطلوب ملف مزدوج لجزء الطول المحدد. السؤال هو: كم سينتج؟

· من المتوقع تضخيم من منتج الطول المحدد المطلوب فيما يتعلق بتركيز القالب الأصلي "x" يمكن بالتالي تمثيله بالصيغة:

[(2ن - (ن + 1)) - (ن + 1)] س

أو

(2ن - 2 (ن + 1))

(غالبًا ما يتم اختصار هذا إلى قاعدة أساسية بسيطة لـ تضخيم: (2ن - 2 ن) x)

· تفسير هذه الصيغة هو أن

  • لعدد معين من الدورات 'n' نصنع '2ن x ' مجموع الدوبلكس الممكنة
  • بالنسبة لعدد معين من الدورات ، سيكون هناك "2 (ن + 1) (أو 2 ن في تقريبنا) ×" مزدوجة التي يتم تشكيلها إما من القالب الأصلي ، أو جزء من الطول غير المحدد ، جنبًا إلى جنب مع جزء من الطول المحدد ( وتمثل منتجًا غير مرغوب فيه)
  • وبالتالي ، سيكون التركيز الكلي للمنتج المطلوب (الدوبلكس بطول محدد بواسطة البادئات PCR)
    (2ن - 2 (n + 1)) x (حيث x هو تركيز وحدة الطباعة على الوجهين الأصلية)

لا يتم تحقيق قيمة التضخيم النظري في الممارسة. هناك عدة عوامل تمنع حدوث ذلك ، بما في ذلك:

1. التنافس بين خيوط الابنة التكميلية مع البادئات من أجل إعادة الالتحام (أي أن خصلتين ابنتيتين تؤديان إلى عدم التضخيم).

2. فقدان نشاط الإنزيم بسبب التمسخ الحراري ، خاصة في الدورات اللاحقة

3. حتى بدون التمسخ الحراري ، تصبح كمية الإنزيم محدودة بسبب زيادة الهدف المولي في الدورات اللاحقة (أي بعد 25-30 دورة يحتاج الكثير من البادئات إلى التمديد)

4. إمكانية التلدين التمهيدي للموقع الثاني والتهيئة غير المنتجة

معلمات الدراجات الحرارية

تعد معلمات الدراجات الحرارية ضرورية لتجربة PCR الناجحة. تتضمن الخطوات المهمة في كل دورات PCR ما يلي:

1. تمسخ القالب (عادةً ما يتم إجراؤه عند أعلى درجة حرارة - 100 درجة مئوية)

2. تلدين البرايمر (يتم اختيار درجة الحرارة بناءً على درجة حرارة انصهار البرايمر)

3. تمديد البادئات (يتم إجراؤه على النحو الأمثل لاستخدام البوليميراز)

قد يبدو ملف تعريف درجة الحرارة التمثيلي لكل دورة كما يلي:

الشكل 6.5.4: ركوب الدراجات الحرارية

المخازن و MgCl2 في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل

قد يكون المخزن المؤقت للتفاعل النموذجي لـ PCR مثل:

  • 10 ملم تريس ، درجة الحموضة 8.3
  • 50 ملي بوكل
  • 1.5 ملي MgCl2
  • 0.01٪ جيلاتين
  • إن MgCl2 عادة ما يكون التركيز في خليط التفاعل النهائي بين 0.5 إلى 5.0 ملي مولار ، ويتم تحديد التركيز الأمثل تجريبياً (نموذجياً بين 1.0 - 1.5 ملي مولار). ملغ2+ الأيونات:
    • تشكل معقدًا قابلًا للذوبان باستخدام dNTP وهو أمر ضروري لتضمين dNTP
    • تحفيز نشاط البلمرة
    • زيادة Tm (درجة حرارة الانصهار) للتفاعل التمهيدي / القالب (أي أنه يعمل على استقرار التفاعل المزدوج

عموما،

  • قليل ملغ2+ يؤدي إلى عوائد منخفضة (أو عدم وجود عائد) و
  • عالي ملغ2+ يؤدي إلى تراكم منتجات غير محددة (خطأ في التصميم).

اختيار البوليميراز لـ PCR

  • كان أحد التطورات المهمة التي سمحت بتطوير PCR هو توافر البوليميرات الحرارية.
  • سمح هذا للإنزيم المضاف مبدئيًا بالبقاء على قيد الحياة في دورات درجة الحرارة التي تقترب من 100 درجة مئوية.
  • خصائص بوليميرات الحمض النووي المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل

طق/ أمبليتاك®

تنفيس ™

Deep Vent ™

Pfu

ث

ULTma

95 درجة مئوية نصف عمر

40 دقيقة

400 دقيقة

1380 دقيقة

> 120 دقيقة

20 دقيقة

> 50 دقيقة

معدل الامتداد (nt / sec)

75

>80

?

60

>33

?

النهايات الناتجة

3 'أ

> 95٪ حادة

> 95٪ حادة

حاد

3 'أ

حاد

ستراند ديسبلاسيون

+

+

5'®3 'exo

+

+

3'®5 'exo

+

+

+

+

الاشعال

تصميم التمهيدي

  • بشكل عام ، يكون طول البادئات المستخدمة 20 - 30 ميكر. يوفر هذا درجات حرارة التلدين العملية (لنظام درجة الحرارة المرتفعة حيث يكون البوليميراز القابل للحرارة أكثر نشاطًا).
  • يجب أن تتجنب المواد الأولية امتدادات متواليات polybase (مثل poly dG) أو الزخارف المتكررة - يمكن أن يتم تهجينها مع تسجيل غير مناسب في القالب.
  • يجب تجنب تسلسل التكرار المعكوس لمنع تكوين بنية ثانوية في التمهيدي ، مما قد يمنع التهجين إلى القالب
  • يجب تجنب التتابعات المكملة للبادئات الأخرى المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل وذلك لمنع التهجين بين البادئات 3 'النهاية من التمهيدي)
  • إذا أمكن ، يجب أن تكون النهاية 3 'من التمهيدي غنية بقواعد G و C لتعزيز التلدين للطرف الذي سيتم تمديده
  • يجب أن تكون المسافة بين البادئات أقل من 10 كيلو بايت في الطول. عادة ، لوحظ انخفاض كبير في العائد عندما تمتد البادئات من بعضها البعض إلى ما بعد 3 كيلو بايت تقريبًا.

درجة حرارة انصهار البادئات

  • يمكن حساب Tm للتهجين التمهيدي باستخدام صيغ مختلفة. الصيغة الأكثر استخدامًا هي:

(1) Tm = [(عدد مخلفات A + T) × 2 درجة مئوية] + [(عدد مخلفات G + C) × 4 درجة مئوية]

  • أمثلة على T.م العمليات الحسابية

جي

أ

تي

ج

تيم

15 مير

3

5

2

5

46

20 مير

6

5

4

5

62

30 مير

8

6

8

8

92

إذا كانت درجة حرارة التلدين عالية جدًا ، لن تصلب البرايمر. إذا كانت منخفضة جدًا ، سوء فهم يمكن أن تحدث في مواقع تسلسل DNA مماثل لموقع الربط التمهيدي المقصود

تحليل تجربة PCR

  • 25-30 دورة شائعة
  • يجب أن يكون المنتج الرئيسي عبارة عن جزيء DNA مزدوج يتم تحديد نهاياته 5 'و 3' بواسطة اثنين من البادئات PCR
  • ومع ذلك ، يمكن إنتاج منتجات أخرى. غالبًا ما تمثل هذه المنتجات مواقع فتيلة ثانوية (خطأ في الإعداد) أو أخطاء في التضمين الخاطئ للبوليميراز
  • وبالتالي ، يمكن أن يكون منتج PCR غير متجانس ويجب فصله وتحليله
  • الاغاروز هلام الكهربائي، بالاشتراك مع تلطيخ بروميد الإيثيديوم ، هي الطريقة الأكثر شيوعًا لفصل وتحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل

تضخيم الأحماض النووية

تفاعل متعدد البوليميراز المتسلسل

في تعدد إرسال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم تضمين مجموعتين أو أكثر من مجموعات التمهيدي المصممة لتضخيم أهداف مختلفة في نفس تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. باستخدام هذه التقنية ، يمكن تضخيم أكثر من تسلسل مستهدف في عينة سريرية في أنبوب واحد. كامتداد للاستخدام العملي لـ PCR ، يمكن أن توفر هذه التقنية الوقت والجهد. يجب أن يتم اختيار المواد الأولية المستخدمة في التفاعلات المتعددة بعناية لتكون لها درجات حرارة تلدين متشابهة ويجب ألا تكون مكملة لبعضها البعض. يجب أن تكون أحجام الأمبليكون مختلفة بما يكفي لتشكيل نطاقات متميزة عند تصورها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. يمكن تصميم Multiplex PCR إما في تفاعل PCR أحادي القالب الذي يستخدم عدة مجموعات من البادئات لتضخيم مناطق معينة داخل قالب ، أو تفاعل PCR متعدد القوالب ، والذي يستخدم قوالب متعددة والعديد من مجموعات التمهيدي في نفس أنبوب التفاعل (الشكل 9.6) ). على الرغم من أن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال يمكن أن يقلل التكاليف والوقت للكشف في وقت واحد عن اثنين أو ثلاثة أو أكثر من مسببات الأمراض في العينة ، إلا أن تطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد أكثر تعقيدًا وغالبًا ما يكون أقل حساسية من PCR أحادي المجموعة. تتمثل ميزة تعدد إرسال تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنه يمكن استخدام مجموعة من البادئات كعنصر تحكم داخلي ، حتى نتمكن من القضاء على احتمالية الإيجابيات أو السلبيات الخاطئة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر PCR متعدد الإرسال البوليميراز المكلف والقالب في حالة نقص العرض.

الشكل 9.6. نظرة عامة على Multiplex PCR.


لماذا يستخدم Taq في PCR؟

طاق بوليميراز هو شكل مستقر للحرارة من بوليميريز الحمض النووي التي يمكن أن تعمل بعد التعرض لدرجات الحرارة المرتفعة اللازمة ل PCR. بوليميرات أخرى تتعرض لدرجات حرارة عالية تستخدم في ال تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) من شأنه أن يفسد ويصبح غير وظيفي.

قد يتساءل المرء أيضًا ، لماذا كان اكتشاف بوليميراز DNA Taq مهمًا لتطوير PCR؟ طاق بوليميراز، أول مستقر للحرارة بوليميريز الحمض النووي ل PCR، كنت اكتشف في عام 1966. PCR تحول الحمض النووي التضخيم ، مما يجعل العملية سريعة وفعالة. هذا من شأنه أن يحدث ثورة في الاستنساخ ، الحمض النووي الاختبارات والطب الشرعي وتصميم الأدوية.

إذن ، لماذا يستخدم Thermus aquaticus في تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

وبسبب هذه الخاصية ، فإن طق بوليميراز سلعة مهمة. تم العثور على بوليميريز الحمض النووي في Thermus aquaticus يظل مستقرًا حتى في درجات حرارة عالية جدًا. بسبب هذا الاستقرار يمكن أن يكون تستخدم في العملية المعروفة باسم تفاعل البلمرة المتسلسل، أو PCR.


في العلوم البيولوجية ، كانت هناك تطورات تكنولوجية دفعت النظام إلى عصور ذهبية من الاكتشاف. على سبيل المثال ، تم تغيير مجال علم الأحياء الدقيقة مع ظهور مجهر أنطون فان ليوينهوك ، والذي سمح للعلماء بتصور بدائيات النوى لأول مرة. يعد تطوير تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) أحد تلك الابتكارات التي غيرت مسار العلوم الجزيئية بتأثيرها الذي يمتد إلى تخصصات فرعية لا حصر لها في علم الأحياء. تم تحديد العملية النظرية من قبل Keppe وزملاؤه في عام 1971 ، ومع ذلك ، فقد مرت 14 عامًا أخرى حتى تم وصف إجراء PCR الكامل وتطبيقه تجريبيًا بواسطة Kary Mullis أثناء وجوده في Cetus Corporation في عام 1985. تقدمت أتمتة وصقل هذه التقنية مع إدخال بوليميراز DNA مستقر حراريًا من البكتيريا Thermus aquaticus، وبالتالي الاسم طق بوليميريز الحمض النووي.

PCR هي تقنية تضخيم قوية يمكن أن تولد إمدادًا وافرًا لجزء معين من الحمض النووي (أي amplicon) من كمية صغيرة فقط من مادة البداية (أي قالب DNA أو تسلسل الهدف). على الرغم من أنه بسيط وخالي من المتاعب بشكل عام ، إلا أن هناك بعض المزالق التي تعقد التفاعل مما ينتج عنه نتائج زائفة. عندما يفشل تفاعل البوليميراز المتسلسل يمكن أن يؤدي إلى العديد من منتجات الحمض النووي غير المحددة بأحجام مختلفة والتي تظهر كسلم أو مسحة من العصابات على المواد الهلامية agarose. في بعض الأحيان لا تتشكل أي منتجات على الإطلاق. تحدث مشكلة محتملة أخرى عندما يتم إدخال الطفرات عن غير قصد في الأمبليكون ، مما يؤدي إلى مجموعة غير متجانسة من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن أن تصبح حالات فشل PCR محبطة ما لم يتم استخدام الصبر واستكشاف الأخطاء وإصلاحها بعناية لحل المشكلة (المشكلات) وحلها. يحدد هذا البروتوكول المبادئ الأساسية لـ PCR ، ويوفر منهجية من شأنها أن تؤدي إلى تضخيم معظم التسلسلات المستهدفة ، ويقدم استراتيجيات لتحسين التفاعل. باتباع دليل PCR هذا ، يجب أن يكون الطلاب قادرين على:

  • قم بإعداد التفاعلات وظروف التدوير الحراري لتجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية
  • فهم وظيفة مكونات التفاعل المختلفة وتأثيرها العام على تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل
  • تصميم وتحسين تجربة PCR لأي قالب DNA
  • استكشاف أخطاء تجارب PCR الفاشلة وإصلاحها

تعزيز خصوصية تفاعل البلمرة المتسلسل بواسطة أكسيد الجرافين من خلال تعديل السطح: يتفوق البوليمر zwitterionic على البوليمرات الأخرى بشحنات مختلفة

1 قسم المواد الحيوية ، كلية المواد ، 2 مختبر رئيسي للولاية لبيولوجيا الإجهاد الخلوي ، كلية علوم الحياة ، 3 قسم الفيزياء ، معهد أبحاث المحاكاة الحيوية والمواد اللينة ، جامعة شيامن ، شيامن ، الناس و rsquos جمهورية الصين

*ساهم هؤلاء المؤلفين بالتساوي على هذا العمل

الملخص: تم تحضير أكاسيد الجرافين (GOs) ذات الخصائص السطحية المختلفة ، مثل الحجم ودرجة الاختزال والشحنة ، وتم دراسة تأثيرها على خصوصية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). في هذه الدراسة ، نوضح أن GO بحجم كبير ودرجة تخفيض عالية تتفوق على GO الصغيرة وغير المخفضة في تعزيز خصوصية PCR. يتم استخدام حمض البولي أكريليك سالب الشحنة (PAA) ، بولي أكريلاميد موجب الشحنة (PAM) ، البولي إيثيلين جلايكول المحايد (PEG) والبوليمر zwitterionic poly (sulfobetaine) (pSB) لتعديل GO. تزداد قدرة تحسين خصوصية PCR بالترتيب التالي: GO-PAA & lt GO-PAM & lt GO-PEG & lt GO-pSB. وبالتالي ، فإن GO المعدلة بالبوليمر zwitterionic متفوقة على مشتقات GO الأخرى بشحنات مختلفة في تعزيز خصوصية PCR. تُستخدم مشتقات GO أيضًا بنجاح لتعزيز خصوصية PCR لتضخيم الحمض النووي البشري للميتوكوندريا باستخدام الحمض النووي الجيني للدم كقالب. يتم إجراء محاكاة الديناميكيات الجزيئية والالتحام الجزيئي لتوضيح التفاعل بين البوليمرات و Pfu بوليميريز الحمض النووي. توضح بياناتنا أن حجم ودرجة التخفيض وشحنة السطح لـ GO تؤثر على خصوصية PCR. بناءً على نتائجنا ، يمكن استخدام GO المعدلة بالبوليمر zwitterionic كمادة مضافة فعالة لتعزيز خصوصية PCR.

الكلمات الدالة: مضافة PCR ، شحنة ، pSB ، Pfu بوليميريز الحمض النووي

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو أحد أكثر الأدوات انتشارًا وتطوراً في البيولوجيا الجزيئية. 1،2 نظرًا لقدرتها على إنتاج بلايين من نسخ الحمض النووي عن طريق التضخيم السريع والانتقائي لمنطقة معينة في سلسلة الحمض النووي ، فإن لديها مجموعة واسعة من التطبيقات في تضخيم الجينات والاستنساخ الجزيئي وتشخيص الأمراض. 3 يتطلب PCR الأساسي عادةً المكونات الخمسة التالية: 1) قالب DNA الذي يحتوي على منطقة DNA المستهدفة ، 2) اثنين من البادئات لبدء تخليق DNA ، 3) بوليميراز DNA قابل للحرارة لتحفيز تخليق الحمض النووي ، 4) deoxynucleoside triphosphates (dNTPs ، المبنى كتل من جديلة DNA جديدة) و 5) عازلة بما في ذلك الكاتيونات ثنائية التكافؤ (عادة Mg 2 & # 43). 4 غالبًا ما تكون هناك حاجة لعملية تحسين تستغرق وقتًا طويلاً من أجل الحصول على PCR ناجح ، في المقام الأول عندما يكون التضخيم من الحمض النووي الجيني مطلوبًا.

ستؤثر العديد من العوامل على خصوصية PCR ، مثل نقاء التمهيدي وتسلسله ، ونقاء قالب DNA ، وتركيز Mg 2 & # 43 ، ودرجة حرارة التلدين والإضافات الأخرى مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، والتي يتم تضمينها بشكل متكرر في خليط PCR . عادةً ، عندما يكون تركيز قالب الحمض النووي منخفضًا جدًا ، أو يكون هيكل قالب الحمض النووي شديد التعقيد ، مثل الجين الغني بالـ GC أو الحمض النووي الجيني للثدييات ، قد تكون خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل منخفضة جدًا. تم تطوير إستراتيجيات مختلفة لتحسين خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل باستخدام مجموعتين منفصلتين من البادئات ، و PCR مع انخفاض درجات حرارة التلدين تدريجيًا وبداية تفاعل البوليميراز المتسلسل الساخنة التي تحجب بوليميريز الحمض النووي أو البادئات حتى يصل خليط التفاعل إلى درجة حرارة أعلى عتبة الربط غير المحدد للطلاء التمهيدي بالقالب. 4 ومع ذلك ، فإن تحسين تصميم التمهيدي وظروف دورة PCR ودرجات حرارة التلدين وضبط تركيزات مكونات PCR هي عمليات طويلة ومحبطة. لتعزيز خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم استخدام العديد من الجزيئات الصغيرة كمواد مضافة ، مثل DMSO والجلسرين والبيتين والفورماميد وألبومين المصل البقري (BSA). 7،8 استخدامها إما منفردة أو مجتمعة لا يضمن تعزيز خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل. وبالتالي ، فإن تأثير هذه المواد المضافة لا يمكن التنبؤ به. لذلك ، لا يزال من الصعب العثور على إضافات جديدة لتعزيز خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل.

في السنوات الأخيرة ، تم استخدام المواد النانوية في نظام PCR ، بما في ذلك الجسيمات النانوية المعدنية ونقاط الكم شبه الموصلة والمواد النانوية الكربونية وجسيمات البوليمر النانوية. 9 & # 821119 غالبًا ما تمتلك المواد النانوية خصائص فيزيائية وكيميائية فريدة ، على سبيل المثال ، تأثير السطح الناتج عن نسبة السطح إلى الحجم الكبيرة ، والتي تختلف اختلافًا كبيرًا عن المواد العيانية. يعتمد تأثير المواد النانوية على تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل أساسي على التفاعل القوي بين مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل والمواد النانوية. 20 ومع ذلك ، تم الحصول على نتائج متضاربة من مجموعات بحثية مختلفة. 21 & # 821125 لذلك ، فإن تأثير المواد النانوية ذات الخصائص السطحية المختلفة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لا يزال غير واضح ، ومن الضروري إجراء المزيد من التحقيقات المنهجية والعميقة لفهم الآلية المقابلة.

أظهرت دراستنا السابقة أن انخفاض أكسيد الجرافين (RGO) يمكن أن يحسن خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل كبير. 19 ومع ذلك ، فإن RGO لديه قابلية ذوبان ضعيفة في الماء بسبب نقص المجموعات الوظيفية على سطحه ، مما يثبط تطبيق المزيد من RGO. بالمقارنة مع RGO ، هناك العديد من مجموعات الهيدروكسيل والإيبوكسي والكربوكسيل على ورقة أكسيد الجرافين (GO) ، مما يؤدي إلى ارتفاع قطبية وماء GO.وبالتالي ، فإن GO محبة للماء ويمكن أن تشتت جيدًا في الماء. يمكن أن يوفر تعديل السطح الإضافي لـ GO بعض خصائص السطح الجديدة لـ GO. 26 & # 821131 في هذه الدراسة ، تم تعديل GO بحمض بولي أكريليك منتهي بالكربوكسيل سالب الشحنة (PAA) ، بولي أكريلاميد منتهي أميني موجب الشحنة (PAM) ، بولي إيثيلين جلايكول محايد (PEG) أو بوليمر zwitterionic بولي (سلفوبيتين) (pSB). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بدراسة تأثير GO بخصائص سطح مختلفة ، مثل الحجم ودرجة الاختزال وتعديل السطح ، على خصوصية PCR. وجدنا أن الحجم الكبير و RGO كان متفوقًا على الصغير وغير RGO في تعزيز خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل. أثرت الشحنة السطحية لـ GO أيضًا على خصوصية PCR بالترتيب التالي: GO-PAA & # 60 GO-PAM & # 60 GO-PEG & # 60 GO-pSB. بالنسبة لـ GO المعدلة بالبوليمر ، وجد أن pSB zwitterionic متفوق في تعزيز خصوصية PCR مقارنة بالبوليمرات المحايدة والسالبة والشحنة الموجبة. تم استخدام مشتقات GO هذه بشحنات سطحية مختلفة بنجاح كإضافات في تضخيم الحمض النووي للميتوكوندريا باستخدام الحمض النووي الجيني للدم كقالب. بناءً على نتائجنا ، نقترح أن مشتقات GO يمكن أيضًا أن تعزز خصوصية PCR للحمض النووي منخفض الوفرة الذي تم الحصول عليه من العينات السريرية. تُستخدم أيضًا محاكاة الديناميكيات الجزيئية والالتحام الجزيئي لاستقصاء التفاعل بين البوليمرات و Pfu بوليميراز الحمض النووي لفهم آلية تحسين النوعية. قد تؤدي نتائج أبحاثنا في النهاية إلى تقدم تطبيق GO في المجالات الطبية الحيوية.

تم شراء مسحوق الجرافيت الطبيعي (320 شبكة ، Alfa ، 99 & # 37) من شركة Tianjin Guangfu Chemical Agent Co.، Ltd. (Tianjin، People & # 8217s Republic of China). نانو3، KMnO4، ك3ص4 (99%), إل-ليسين (98 & ​​# 37) ، نينهيدرين (97 & # 37) و H.2ا2 تم شراؤها من شركة Guoyao Co.، Ltd. (Shanghai ، People & # 8217s Republic of China). حمض الأكريليك (AA) ، الأكريلاميد (AM) ، H2وبالتالي4، حمض الهيدروكلوريك ، هيدرات الهيدرازين (80 & # 37) ، الإيثانول ، NaHCO3، هيدروكسيد الصوديوم ، مغ2وبالتالي4 (99 & # 37) ، الميثيل الأحمر وبورات الصوديوم تم شراؤها من Xilong Chemical (Guangzhou ، People & # 8217s جمهورية الصين). تم شراء بيروكسوسلفات البوتاسيوم من Dahao Nanhong Industrial Co.، Ltd. (Shantou، People & # 8217s Republic of China). mPEG-NH2 تم شراؤها من شركة Kaizheng Biotech Development Co.، Ltd. (بكين ، People & # 8217s جمهورية الصين). تم شراء 1-Ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC، 98 & # 37) من Aladdin Industrial Corporation (Shanghai ، People & # 8217s Republic of China). تم شراء BSA (98 & ​​# 37) و [2- (methacryloyloxy) ethyl] ثنائي ميثيل- (3-sulfopropyl) هيدروكسيد الأمونيوم (SB ، 98 & # 37) من Sigma-Aldrich. جميع الكواشف المستخدمة كانت من درجة الكاشف التحليلي باستثناء ما هو مذكور بشكل خاص. تم شراء أنابيب غسيل الكلى (8000 & # 821114000 MWCO) من Solarbio Life Sciences (بكين ، People & # 8217s جمهورية الصين). تم شراء DNA البلازميد pET-32a من Novegan، Shanghai، People & # 8217s Republic of China. ال Pfu بوليميراز ، dNTP ، 10 & # 215 عازلة ، 0.22 & # 956 م مرشح ، الاغاروز ، الجلسرين ، مرق Luria-Bertani ، بروميد الإيثيديوم (EB) ، علامة الحمض النووي ، محلول تحميل الحمض النووي ، CaCl اللامائي2، أنابيب PCR ، 50 & # 215 TAE العازلة والأمبيسلين تم شراؤها من Sangon Biotech Co.، Ltd. (شنغهاي ، People & # 8217s جمهورية الصين). تم تصنيع المواد الأولية بواسطة شركة Sangon Biotech Co.، Ltd. (الجدول S1). تم تسلسل منتجات PCR بواسطة Sangon Biotech Co.، Ltd. تم شراء Mini Plasmid Kit من TIANGEN Biotech Co.، Ltd. (بكين ، People & # 8217s جمهورية الصين). تم شراء مجموعة أدوات تحضير قالب PCR عالي النقاء من شركة Roche Ltd. (ألمانيا). تم استخدام الماء منزوع الأيونات في جميع التجارب.

توليف GO ومشتقاتها

تم تصنيع GO وفقًا لطريقتنا السابقة. 32،33 أولاً ، 2.0 جرام من مسحوق الجرافيت و 1.0 جرام من NaNO3 تمت إضافتها إلى 46 مل من 98 & # 37 H.2وبالتالي4 في حمام جليدي ، ثم 6.0 جم من KMnO4 يضاف ببطء إلى الخليط مع التقليب الشديد. يقلب الخليط باستمرار لمدة ساعتين في حمام جليدي ويوضع في حمام مائي عند 35 & # 176 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم تمت إضافة 92 مل من الماء تدريجيًا ، ورفعت درجة الحرارة إلى 95 & # 176 درجة مئوية. تم تقليب المحلول لمدة 3 ساعات. أخيرًا ، تمت إضافة 400 مل من الماء ، و 6 مل من 30 & # 37 H.2ا2 تم إسقاطه في رد الفعل. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، يرشح الخليط ويغسل بـ 1:10 HCl (نسبة الحجم) ، متبوعًا بالغسيل المتكرر بالماء لإزالة الحمض. تم بعد ذلك تشتيت عجينة المرشح في ماء للحصول على أكسيد الجرافيت. تم تقشير أكسيد الجرافيت إلى GO عن طريق الموجات فوق الصوتية لمدة 3 ساعات عند 500 وات. تمت إزالة الركام بالطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تم جمع المادة الطافية ودالتها في الماء لمدة أسبوع لإزالة الأملاح المتبقية.

تم إعداد GO الصغيرة (S-GO) و GO (L-GO) الكبيرة وفقًا للأدبيات. تم صوتنة محلول GO الذي تم غسله لمدة 10 ساعات ، متبوعًا بالطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة. تم جمع المادة الطافية كـ S-GO. تم تفريق الركام في الماء مرة أخرى وطرده عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تم جمع المادة الطافية كـ L-GO. تم تحضير RGO من GO ، والذي تم تقليله بواسطة هيدرات الهيدرازين في الأمونيا. تم تحميل ما مجموعه 50 مل من 1 مجم مل & # 87221 GO في دورق رباعي العنق ، ثم تمت إضافة 6 & # 956 لتر من 80 & # 37 هيدرات الهيدرازين و 100 & # 956 لتر من 28 & # 37 هيدروكسيد الأمونيوم. بعد الخلط الكامل ، تم تسخين المحلول في حمام زيت عند 95 & # 176 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تم جمع المادة الطافية وغسيلها لمدة أسبوع في الماء. تم تحضير عينة أخرى من RGO بدرجة تخفيض أعلى بإضافة 42 & # 956 لتر من 80 & # 37 هيدرات هيدرازين و 700 & # 956 لتر من 28 & # 37 هيدروكسيد الأمونيوم.

تم إعداد GO-PAA و GO-PAM وفقًا لبروتوكولنا السابق. 35 أولاً ، تمت إضافة 1 مل من 1 جم مل & # 87221 AA مونومر إلى 50 مل من محلول 1 مجم مل & # 87221 GO تحت التحريك القوي عند درجة حرارة الغرفة. تحت تطهير النيتروجين لمدة 30 دقيقة ، 80 مجم من (NH4)2س2ا8 يضاف ويسخن عند 70 & # 176 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في حمام زيت. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، تمت إضافة 200 مل من الماء وصوتها لمدة ساعة واحدة ، متبوعًا بغسيل الكلى لمدة أسبوع لإزالة PAA المجاني. بعد الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة ، تم جمع المادة الطافية على أنها GO-PAA. تم تحضير GO-PAM و GO-pSB بطريقة مماثلة فيما عدا أنه تم استبدال مونومر AA بـ AM أو SB monomer. لتحضير GO-pSB ، تم استخدام بيروكسوسلفات البوتاسيوم كبادئ وتم تسخين خليط التفاعل عند 70 & # 176 درجة مئوية لمدة 15 ساعة.

تم إعداد GO-PEG وفقًا للأدبيات. 36 أولاً ، تم خلط 10 مل من 3 مولار هيدروكسيد الصوديوم مع 20 مل من محلول 2 ملجم & # 87221 GO وصوتها لمدة 3 ساعات. ثم يضاف 10 & # 37 HCl لمعادلة المحلول إلى الرقم الهيدروجيني 7. ويرشح الخليط ويشطف بالماء. تم بعد ذلك تشتيت عجينة الترشيح في 40 مل من الماء. ما مجموعه 80 مجم mPEG-NH2 يضاف في المحلول ويصوت لمدة 5 دقائق. ثم تمت إضافة 20 مجم من EDC وصوتنة لمدة 30 دقيقة أخرى ، متبوعة بإضافة 60 مجم من EDC والتقليب طوال الليل. تم جمع المادة الطافية ودالتها لمدة أسبوع في الماء لإزالة فائض mPEG-NH2. بعد 30 دقيقة من الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة ، تم جمع المادة الطافية باسم GO-PEG.

توصيف GO ومشتقاته

تم الحصول على صور مجهر القوة الذرية (AFM) في وضع التنصت في الهواء باستخدام Nanoscope Multimode 8 (Veeco Instruments Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على أطياف امتصاص UV & # 8211vis باستخدام مطياف TU-1901 UV & # 8211Vis (Beijing Purkinje General Instrument ، People & # 8217s Republic of China). تم تسجيل أطياف فورييه لتحويل الأشعة تحت الحمراء (FTIR) على مقياس طيف نيكوليت iS10 (Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). نظام حيود المسحوق بالأشعة السينية (XRD) (Ultima IV Rigaku ، اليابان) مجهز بإشعاع Cu K & # 945 (λ & # 611.542 & # 197) لوصف الهياكل البلورية للمواد. تم تسجيل أطياف التحليل الطيفي الكهروضوئي بالأشعة السينية (XPS) على مطياف الإلكترون الضوئي بالأشعة السينية Phi Quantum 2000 (PHI ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تحليل الجاذبية الحرارية (TGA) على SDT-Q600 (TA Instruments ، الولايات المتحدة الأمريكية) تحت جو النيتروجين بمعدل تسخين 10 & # 176 درجة مئوية دقيقة & # 87221. تم قياس إمكانات زيتا بواسطة Malvern Nano-ZS (Malvern Instruments ، Co. ، المملكة المتحدة). أجريت معايرات Boehm 37 لتحديد محتوى مجموعات الكربوكسيل والهيدروكسيل على سطح RGO. تقارب ربط Pfu تمت دراسة البلمرة مع GO و RGO بواسطة أجهزة قياس حرارية معايرة (NANO ITC TA Instruments) عند 25 & # 176 درجة مئوية. Pfu تمت معايرة البوليميراز باستخدام GO و RGO لمحتويات كربوكسيل مختلفة (8.39 & # 37 ، 7.28 & # 37 و 5.43 & # 37 ، على التوالي). تم ملء خلية العينة بـ 0.12 & # 956g mL & # 87221 Pfu بوليميراز ، وتم ملء الخلية المرجعية بالماء. في كل تجربة ، تم أخذ 50 & # 956L من 100 & # 956g mL & # 87221 RGO بواسطة حقنة وإضافتها إلى خلية العينة على فترات متساوية تبلغ 200 ثانية. تم قياس التغيرات الحرارية بعد كل إضافة. بيانات قياس السعرات الحرارية للجرافين & # 8211Pfu تم تحليل ربط البوليميراز باستخدام برنامج NanoAnalyze لـ NANO ITC.

PCR و الاغاروز الكهربائي للهلام

تم استخدام البلازميد pET-32a كقالب لـ PCR. تم خلط المكونات التالية في الجولة الأولى من PCR: 1 & # 215 PCR عازلة تحتوي على 2 ملي Mg 2 & # 43 ، dNTP (كل 0.2 مم) ، التمهيدي F1 (0.4 & # 956M) ، التمهيدي R1 (0.4 & # 956M) ( الجدول S1) ، DNA البلازميد (0.5 نانوغرام # 956 لتر & # 87221) و Pfu بوليميراز (0.1 U & # 956L & # 87221). تمت إضافة GO أو مشتقاته بتركيزات مختلفة في نظام PCR. تم تكوين كل عينة حتى الحجم النهائي 25 & # 956 لتر من الماء. في الجولة الثانية من PCR ، تم تعيين نفس حالة التفاعل ، باستثناء أنه تم استخدام 0.5 & # 956L من منتج PCR لاستبدال DNA البلازميد كقالب. تم وصف شروط PCR في الجدول S2.

تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية لكلية الطب بجامعة شيامن. تم جمع عينات الدم من المتطوعين الأصحاء الذين قدموا موافقة خطية مستنيرة. تم عزل الحمض النووي الجيني البشري باستخدام مجموعة إعداد قالب PCR عالي النقاء. تمت إضافة ما مجموعه 20 نانوغرام & # 956L & # 87221 DNA بدلاً من DNA البلازميد. تم استخدام الاشعال F2 و R2 (الجدول S1) لتضخيم جزء من الحمض النووي البشري للميتوكوندريا. كانت مكونات PCR هي نفسها كما هو مذكور أعلاه ، باستثناء أنه تم استبدال DNA البلازميد بـ 2.5 & # 956L من الحمض النووي الجيني. في الجولة الثانية أو الثالثة من PCR ، تم استخدام 2.5 & # 956L من منتج PCR الأخير كقالب بدلاً من الحمض النووي الجيني. يتم سرد شروط PCR في الجدول S2. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في دورة T3 الحرارية (Biometra ، ألمانيا). تم فصل منتجات PCR بالكهرباء في 1.5 & # 37 agarose gel لمدة 30 دقيقة ، ملطخة بـ 0.5 & # 956g mL & # 87221 EB وتم تحليلها باستخدام نظام Gel Doc XR (Bio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل شدة التألق لحزام منتج PCR باستخدام وحدة تحليل الكثافة الضوئية لبرنامج Image Lab.

في محاكاة السيليكو Pfu بوليميراز & # 8211 تفاعل البوليمر

تم استخدام محاكاة الديناميكيات الجزيئية والالتحام الجزيئي لدراسة التفاعل المحتمل بين البوليمرات و Pfu بوليميراز. تم استخدام أشكال مؤينة من PAA و PAM و pSB في جميع عمليات الإرساء والمحاكاة (الشكل S1). تم إجراء عمليات محاكاة الديناميات الجزيئية باستخدام آلة جرونينجن للمحاكاة الكيميائية (GROMACS 5.0.4). 38 تم استخدام مجال القوة CHARMM36 39 لبوليميراز الحمض النووي ومياه نقطة الشحن البسيطة للمذيب. تم وضع كل مركب بوليمر & # 8211 بروتين في صندوق محاكاة (14 & # 21514 & # 21514 نانومتر) ومليء بالمذيب. PAA و PAM لهما رسوم صافية تبلغ & # 872270e و 70 e ، على التوالي. PEG و pSB محايدة. Pfu البوليميراز لديه شحنة صافية تبلغ & # 87224e. تمت إضافة أيونات Na & # 43 و Cl & # 8722 لتحييد الشحنات الصافية للنظام. في كل محاكاة مستقلة ، تم وضع البوليمر في مكان عشوائي حول البروتين. قبل الديناميات ، تم تخفيف الهيكل من خلال تقليل الطاقة باستخدام خوارزمية النسب الأكثر حدة. لموازنة النظام ، تم إجراء محاكاة 100 ps NVT ، متبوعة بمحاكاة 100 ps NPT. تم الحفاظ على درجة حرارة النظام عند 345 كلفن (72 & # 176 درجة مئوية) ، وهي درجة حرارة الاستطالة لـ Pfu بوليميراز. تم التعامل مع التفاعلات الكهروستاتيكية باستخدام طريقة Ewald الجسيمية الملساء. تم تقييد جميع الروابط في الجزيئات المحاكاة بقيمها المرجعية باستخدام Linear Constraint Solver. تم حساب طاقات Coul قصيرة المدى بعد الوصول إلى الموازنة.

من أجل حساب المواقع النشطة المحتملة في بوليميريز الحمض النووي ، تم إجراء الباحث عن الموقع بواسطة بيئة التشغيل الجزيئية (2012.10). 40 الغرض من محاكاة الالتحام هو حساب وتسجيل التفاعلات بين الروابط و Pfu البوليميراز باستخدام برنامج AutoDockVina 1.1.2 مع معلمات مجال القوة الافتراضية الخاصة به. 41 خمس عمليات محاكاة لرسو السفن مستقلة ، لكل منها 10 مواقع من Pfu بوليميراز للتجربة ، لكل نظام بوليمر & # 8211 بروتين.

تحضير وتوصيف GO ومشتقاته

يوضح الشكل 1 إعداد S-GO و L-GO و GO-PAA و GO-PEG و GO-PAM و GO-pSB. تم تصنيع GO من الجرافيت الطبيعي باستخدام طريقة Hummers المعدلة. تم تجهيز 32،33 S-GO و L-GO بتقنية الطرد المركزي عالية السرعة. أظهرت صور AFM أن متوسط ​​حجم S-GO (50 نانومتر) كان أصغر بكثير من L-GO (500 نانومتر) ، في حين أن السماكة كانت & # 1260.9 نانومتر لكلتا العينتين (الشكل S2). تظهر النتيجة أن كلا من S-GO و L-GO عبارة عن صفائح أحادية الطبقة بنفس السماكة. 42 وبالتالي ، يمكننا استبعاد تأثير سماكة GO على خصوصية PCR في التجارب الأخيرة. أدى تطعيم البوليمر على سطح GO إلى زيادة السماكة إلى 1 & # 82113 نانومتر (الشكل S2C & # 8211F). أظهرت معايرة Boehm أن كمية مجموعات الكربوكسيل لـ S-GO و L-GO كانت 9.01 & # 37 و 8.17 & # 37 ، على التوالي. كان لدى S-GO المزيد من مجموعات الكربوكسيل بسبب نسبة السطح إلى الحجم الأكبر. كانت إمكانات زيتا لـ S-GO (& # 872245.1 & # 1770.6 mV) أقل من L-GO (& # 872235.6 & # 1770.8 mV) ، مما يعني أن محتوى مجموعات الكربوكسيل في S-GO أعلى من ذلك L-GO ، والنتيجة متوافقة مع نتائج معايرات Boehm.

شكل 1 تحضير GO ومشتقاته.
ملحوظات: (أ) إعداد S-GO و L-GO. (ب) تحضير أربعة مشتقات GO. تظهر الصور ألوان مختلفة من مشتقات GOs و GO في الماء. (ج) الصيغ الجزيئية لـ PAA و PAM و PEG و pSB.
الاختصارات: EDC ، 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride GOs ، أكاسيد الجرافين L-GO ، GO PAA كبير ، حمض البولي أكريليك PAM ، بولي أكريلاميد PEG ، بولي إيثيلين جلايكول pSB ، بولي (سلفوبيتين) S-GO ، GO صغير.

تم تحضير GO-PAA و GO-PAM و GO-pSB عن طريق بلمرة الجذور الحرة لمونومرات AA و AM و SB على سطح GO ، على التوالي. من ناحية أخرى ، mPEG-NH2 تم تصريفه إلى مجموعات الكربوكسيل على GO عبر تكوين أميد محفز بالكربوديميد. تم استخدام أطياف الأشعة فوق البنفسجية & # 8211 (UV & # 8211vis) (الشكل S3) وأطياف FTIR (الشكل S4) وأطياف XRD (الشكل S5) وأطياف XPS (الشكل S6) لتوصيف جميع العينات والمدرجة في المواد التكميلية. أشارت كل هذه الخصائص إلى أنه تم تطعيم PAA و PAM و PEG و pSB بنجاح على GO. يظهر TGA of GO و GO-PAA و GO-PAM و GO-PEG و GO-pSB في الشكل S7. تعرض TGA لـ GO مع 8.39 & # 37 محتوى كربوكسيل منطقتين من فقدان الكتلة. يُعزى أول فقدان للوزن عند درجة الحرارة & # 60100 & # 176C إلى فقدان الماء الممتز. يُعزى فقدان الوزن الثاني بين 180 & # 176 درجة مئوية و 230 & # 176 درجة مئوية إلى تحلل المجموعات الوظيفية المحتوية على الأكسجين ، مثل مجموعات الكربوكسيل والإيبوكسيد والهيدروكسيل ، في GO. يتناقص فقدان الوزن من الجرافين مع انخفاض محتوى الكربوكسيل (الشكل S7A). مقارنة بـ GO ، يحدث فقدان الوزن الثاني لمشتقات GO في درجات حرارة أعلى ، والذي ينتج بشكل أساسي عن تحلل السلسلة البوليمرية. من خلال حساب النسبة المئوية لفقدان الوزن ، كانت المحتويات المحسوبة لـ PAA و PAM و PEG و pSB هي 43.48 & # 37 و 40.96 & # 37 و 42.53 & # 37 و 38.70 & # 37 ، على التوالي (الجدول S3). تحتوي هذه الكائنات الحية المعدلة بالبوليمر على محتوى مماثل من البوليمر. وبالتالي ، يمكننا استبعاد آثار محتوى البوليمر على خصوصية PCR في التجارب الأخيرة.

كانت إمكانات زيتا لـ GO و RGO & # 872239.1 & # 1770.5 mV و & # 872215.6 & # 1770.3 mV ، على التوالي ، مما يشير إلى أن GO كان أكثر استقرارًا من RGO. بعد تطعيم البوليمرات على سطح GO ، أصبحت إمكانات زيتا لـ GO-PAA (& # 872246.9 & # 1770.9 mV) أكثر سلبية بسبب الشحنة السالبة لـ COO & # 8722 في PAA. زادت إمكانات زيتا لـ GO-PAM إلى & # 872224.1 & # 1771.2 mV بسبب NH الموجب الشحنة3 & # 43 في بام. نتجت الإمكانات السلبية لـ GO-PEG (& # 872235.7 & # 1770.8 mV) و GO-pSB (& # 872220.4 & # 1770.9 mV) عن مجموعات COO & # 8722 على سطح GO ، على الرغم من أن PEG كان بوليمر محايد و pSB كان بوليمر zwitterionic (الجدولان S4 و S5).

تأثير حجم GO على PCR

تتضمن العملية الشائعة لـ PCR 25 & # 821130 دورة من التغيير المتكرر في درجة الحرارة. تتكون دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) النموذجية من الخطوات الثلاث التالية: 1) تمسخ الحمض النووي للقالب ، 2) تلدين اثنين من البادئات الاصطناعية لقالب الحمض النووي و 3) تمديد البادئات المرتبطة المحفزة بواسطة بوليميراز DNA القابل للحرارة. 5 على الرغم من أن تفاعل البوليميراز المتسلسل يمكن أن يضاعف الجين المستهدف أضعافًا مضاعفة ، إلا أن التضخيم غير المحدد يظل مشكلة. لا سيما في PCR متعدد الجولات ، فإن قالب DNA الأولي غير المتفاعل والبادئات يزعج التفاعل ويسبب تراكم منتجات غير محددة. 43 في الدراسات الأولية ، استخدمنا البلازميد pET-32a كقالب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تحديد تركيز القالب الأمثل من خلال تجارب التخفيف التسلسلي (الشكل S8). تم اعتبار ما مجموعه 0.5 نانوغرام & # 956L & # 87221 من البلازميد هو التركيز الأمثل للقالب في الجولة الأولى من PCR ، وكان 0.5 & # 956 لتر من منتج PCR في الجولة الأولى هو تركيز القالب الأمثل في الجولة الثانية من PCR. تم التحقيق في تأثير GO بأحجام مختلفة (S-GO و L-GO) على جولتي PCR. في الجولة الأولى من PCR ، تنخفض شدة النطاق المستهدف 689 نقطة أساس مع زيادة تركيز GO ، مما يشير إلى أن التفاعل يتم تثبيطه بواسطة كل من S-GO و L-GO بتركيز عالٍ (4.8 & # 956g mL & # 87221 لـ S-GO و 6.4 & # 956g mL & # 87221 لـ L-GO الشكل 2A & # 8211C). في الجولة الثانية من PCR ، تم استخدام منتج PCR من الجولة الأولى كقالب.نظرًا لأن منتج PCR لا يحتوي فقط على المنتج المستهدف ولكن أيضًا على قالب الحمض النووي الأولي غير المتفاعل ، والبادئات الأولية والمنتجات غير المحددة ، فإن هذه المواد قد تزعج الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل وتتسبب في تراكم منتجات غير محددة ، مما يؤدي إلى نطاقات تشويه واضحة بدون GO (الشكل 2 د) و ه). ومع ذلك ، بعد إضافة S-GO أو L-GO ، اختفت عصابات اللطاخة. تم تقليل المنتجات غير النوعية مع زيادة تركيز S-GO و L-GO. كان لـ L-GO تأثير أفضل من S-GO ، لأنه كان لديه نطاق تركيز فعال أوسع لتعزيز خصوصية PCR (1.6 & # 82113.2 & # 956g مل & # 87221 لـ S-GO مقابل 0.8 & # 82114.8 & # 956g mL & # 87221 لجدول L-GO S6).

الشكل 2 تأثير GO بأحجام مختلفة على تقارير PCR للجولة الأولى والثانية.
ملحوظات: م: علامة الحمض النووي. (أ) S-GO في الجولة الأولى PCR. (ب) L-GO في الجولة الأولى PCR. (ج) شدة نطاق PCR بتركيزات مختلفة من GO في الجولة الأولى من PCR. (د) S-GO في الجولة الثانية PCR. (ه) L-GO في الجولة الثانية PCR. (F) شدة نطاق PCR بتركيزات مختلفة من GO في الجولة الثانية من PCR. تركيز GO في الممرات 1 & ​​# 82117 هو 0 & # 956g mL & # 87221، 0.8 & # 956g mL & # 87221، 1.6 & # 956g ml & # 87221، 3.2 & # 956g ml & # 87221، 4.8 & # 956g ml & # 87221، 6.4 & # 956g mL & # 87221 and 8.0 & # 956g ml & # 87221 ، على التوالي.
الاختصارات: GOs ، أكاسيد الجرافين L-GO ، GO PCRs كبيرة ، تفاعلات سلسلة البوليميراز S-GO ، GO الصغيرة.

فرضية العمل الخاصة بنا لتأثير تركيز GO الملحوظ هي كما يلي. عندما يكون تركيز GO منخفضًا ، فإن الكمية الممتصة من الشحنة الموجبة Pfu كان البوليميراز و Mg 2 & # 43 على سطح GO المشحون سالبًا مرتفعًا نسبيًا. ثم تنجذب الجزيئات سالبة الشحنة ، مثل قالب الحمض النووي والبادئات و dNTPs ، بواسطة الشحنة الموجبة Pfu البوليميراز على سطح GO. وبالتالي ، يتم تقليل احتمال عدم التطابق وتحسين خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل. ومع ذلك ، عند زيادة تركيز GO ، تزداد كمية GO المشحونة سالبًا في نظام PCR ، وبالتالي فإن الكمية الممتصة للشحنة الموجبة Pfu ينخفض ​​البوليميراز و Mg 2 & # 43 على سطح GO الفردي. علاوة على ذلك ، فإن الشحنات السالبة الزائدة لـ GO ستصد البادئات سالبة الشحنة و dNTP ، مما يؤدي إلى قمع PCR. قمنا بقياس إمكانات زيتا لـ GO ومزيجها مع Pfu البوليميراز في الماء (الجدول S4). زادت إمكانات زيتا لـ S-GO من & # 872245.1 & # 1770.6 mV إلى & # 872233.2 & # 1770.9 mV ، بينما زادت إمكانات zeta لـ L-GO من & # 872235.6 & # 1770.8 mV إلى & # 872229.8 & # 1771.1 mV ، مما يؤكد وجود تفاعل كهرباء أقوى بين S-GO و Pfu بوليميراز من L-GO و Pfu بوليميراز. يتم الحصول على الاتجاه المماثل في المخزن المؤقت PCR (الجدول S5). تُعزى النتيجة إلى المحتوى الأعلى لمجموعات الكربوكسيل المشحونة سالبة في S-GO (9.01 & # 37) من L-GO (8.17 & # 37). لذلك ، يمنع S-GO PCR بتركيز أقل (1.6 & # 956 جم مل & # 87221) من L-GO (6.4 & # 956 جم مل & # 87221) ولدى L-GO نطاق تركيز أوسع لتعزيز خصوصية PCR .

تأثير درجة تخفيض GO على PCR

قمنا بإعداد RGO باستخدام الهيدرازين كمختزل في الأمونيا. أظهرت معايرة Boehm و TGA (الشكل S7A) أن محتوى الكربوكسيل قد انخفض من 8.39 & # 37 إلى 5.43 & # 37 بعد التخفيض. تمت زيادة إمكانات زيتا من & # 872239.1 & # 1770.5 mV إلى & # 872215.6 & # 1770.3 mV بعد التخفيض. في الجولة الأولى من PCR ، انخفضت شدة العصابات مع زيادة تركيزات GO و RGO (الشكل 3A & # 8211D). في الوقت نفسه ، انخفض تأثير التثبيط مع تقليل محتوى مجموعات الكربوكسيل على GO. في الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ظهرت نطاقات تشويه واضحة وتناقصت مع زيادة تركيزات GO و RGO. نطاق التركيز الفعال للخصوصية المثلى لـ PCR لـ GO (8.39 & # 37) و RGO (7.28 & # 37) و RGO (5.43 & # 37) هو 0.8 & # 82113.2 & # 956g مل & # 87221 ، 3.2 & # 82114.8 & # 956g mL & # 87221 and 0.8 & # 82116.4 & # 956g mL & # 87221 ، على التوالي. تزداد خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل ويقل تأثير التثبيط على تفاعل البوليميراز المتسلسل مع تناقص محتويات الكربوكسيل في GO ، مما يدل على أن مجموعات الكربوكسيل في GO لها تأثير كبير على تفاعل البوليميراز المتسلسل. تحتوي RGO على شحنات سالبة أقل من GO ، مما يؤدي إلى تنافر أقل للكهرباء الساكنة مع مكونات PCR سالبة الشحنة. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي التفاعل الأقوى & # 960-التراص بين الهياكل الحلقية للقواعد النووية والهيكل الهيدروكربوني متعدد الحلقات لـ RGO إلى تقارب أكبر لـ RGO مع خيوط DNA مقارنة بـ GO مع DNA. تتمتع RGO بشبكة سداسية مثالية أكثر من GO ، وبالتالي فهي تتمتع بتفاعلات أقوى ضد الماء و & # 960 - التراص مع Pfu بوليميراز من GO مع Pfu بوليميراز. ال Pfu يتكون البوليميراز من 775 حمضًا أمينيًا ، بما في ذلك 26 فينيل ألانين و 47 تيروزين و 11 تريبتوفان ، تحتوي جميع هذه الجزيئات على حلقات بنزين. يمكن لمركبات البنزين غير القطبية الغنية لهذه الأحماض الأمينية العطرية أن تلتصق بقوة على ورقة الجرافين عبر التفاعل & # 960 & # 8211 & # 960. 44 لذلك ، تتفوق RGO على GO في تعزيز خصوصية PCR بسبب تنافر أقل للكهرباء الساكنة مع مكونات PCR سالبة الشحنة وتقارب أعلى مع قالب DNA و Pfu بوليميراز. امتصاص الكهرباء الساكنة بين الشحنة الموجبة Pfu البوليميراز و RGO أصغر من ذلك الموجود بينهما Pfu بوليميراز و GO بشحنات سالبة أكثر ، والتفاعل الكارثي للماء هو القوة الدافعة لامتصاص الإنزيم على RGO. 45 وبالتالي ، فإن RGO لديها تقارب أقوى مع Pfu بوليميراز من GO. تم دعم هذا الاستنتاج أيضًا من خلال تحليل قياس درجة حرارة المعايرة الحرارية (ITC) (الجدول S7 والشكل S9). ثوابت التفكك (كد) للجرافين & # 8211Pfu كان تفاعل البوليميراز 12.3 مول & # 87225 ، 10.5 مول & # 87225 و 3.96 مول & # 87225 لـ GO (8.39 & # 37 كربوكسيل) ، RGO (7.28 & # 37 كربوكسيل) و RGO (5.43 & # 37 كربوكسيل) ، على التوالي. القيم السلبية لتغيير الطاقة الحرة جيبس ​​(& # 916جي) أكد الارتباط التلقائي للجرافين مع Pfu بوليميراز. 46،47 كان RGO الأكثر (5.43 & # 37) هو الأدنى كد وأكثر سلبية & # 916جي القيم ، مما يشير إلى تقارب أعلى بين RGO و Pfu البوليميراز من بين GO و Pfu بوليميراز.

الشكل 3 تأثير درجة تخفيض GO على PCR.
ملحوظات: (أ) GO (8.93 & # 37) في الجولة الأولى PCR. (ب) RGO (7.28 & # 37) في الجولة الأولى PCR. (ج) RGO (5.43 & # 37) في الجولة الأولى PCR. (د) شدة نطاق PCR بتركيزات مختلفة من GO و RGO في الجولة الأولى من PCR. (ه) GO (8.93 & # 37) في الجولة الثانية PCR. (F) RGO (7.28 & # 37) في الجولة الثانية PCR. (جي) RGO (5.43 & # 37) في الجولة الثانية PCR. (ح) شدة نطاق PCR بتركيزات مختلفة من GO و RGO في الجولة الثانية من PCR. م: علامة الحمض النووي. تشير النسب المئوية إلى محتوى مجموعات الكربوكسيل التي تحددها معايرة TGA و Boehm في GO و RGO. تركيز GO و RGO في الممرات 1 & ​​# 82117 هو 0 & # 956g mL & # 87221، 0.8 & # 956g mL & # 87221، 1.6 & # 956g ml & # 87221، 3.2 & # 956g mL & # 87221، 4.8 & # # 956 جم مل & # 87221، 6.4 & # 956 جم مل & # 87221 و 8.0 & # 956 جم مل & # 87221 ، على التوالي.
الاختصارات: GO ، أكسيد الجرافين RGO ، انخفاض أكسيد الجرافين PCR ، تفاعل البلمرة المتسلسل TGA ، تحليل الجاذبية الحرارية.

تأثير تعديل سطح GO على PCR

لمزيد من التحقيق في تأثير تعديل سطح GO على خصوصية PCR ، قمنا بتعديل GO باستخدام PAA سالب الشحنة ، PAM موجب الشحنة ، PEG المحايد و zwitterionic pSB. في الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لم يتم العثور على نطاقات مسحة لجميع العينات ، مما يشير إلى نوعية جيدة من تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 4 أ و # 8211E). في الجولة الثانية من PCR ، ظهرت لطاخة غير محددة في تجارب التحكم بدون إضافات ، لكن اللطاخات انخفضت مع زيادة تركيزات مشتقات GO ، مما يشير إلى أن خصوصية PCR تم تحسينها في جميع أنظمة PCR المدعومة من GO. مقارنةً بـ GO-PAA و GO-PAM و GO-PEG ، فإن GO-pSB بها نطاقات تشويه أقل (الشكل 4F & # 8211J) ونطاق تركيز فعال أوسع (9.6 & # 821124.0 & # 956 جم مل & # 87221 جدول S6) ، مما يشير إلى ذلك يتمتع GO-pSB بأداء أفضل لتحسين خصوصية PCR مقارنةً بـ GOs الأخرى المعدلة بالبوليمر. تزداد القدرة على تحسين خصوصية PCR بالترتيب التالي: GO-PAA & # 60 GO-PAM & # 60 GO-PEG & # 60 GO-pSB. تشير النتائج إلى أن GO-pSB متفوق على GOs الأخرى المعدلة بالبوليمر في تعزيز خصوصية PCR. يقارن الجدول S6 نطاق التركيز الفعال للخصوصية المثلى لـ PCR لـ GO و RGO و GOs المعدلة بالبوليمر وأربعة بوليمرات وفقًا لنتائج الجولة الثانية PCR. بالمقارنة مع RGO ، فإن GO-pSB لديها قابلية ذوبان أفضل بكثير. وفي الوقت نفسه ، لديها أيضًا نطاق تركيز فعال أوسع بكثير من GO و RGO.

الشكل 4 تأثير مشتقات GO على الجولة الأولى والثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل.
ملحوظات: م: علامة الحمض النووي. تركيز مشتق GO في الممرات 1 & ​​# 82118 في (أ), (ب), (F) و (جي) هو 0 & # 956g mL & # 87221، 0.8 & # 956g mL & # 87221، 1.6 & # 956g mL & # 87221، 3.2 & # 956g mL & # 87221، 4.8 & # 956g mL & # 87221، 6.4 & # 956 جم مل & # 87221، 8.0 & # 956 جم مل & # 87221 و 9.6 & # 956 جم مل & # 87221 ، على التوالي. تركيز مشتق GO في الممرات 1 & ​​# 82116 في (ج), (د), (ح) و (أنا) ، هو 0 & # 956 جم مل & # 87221 ، 4.8 & # 956 جم مل & # 87221 ، 9.6 & # 956 جم مل & # 87221 ، 14.4 & # 956 جم مل & # 87221 ، 19.2 & # 956 جم مل & # 87221 و 24.0 & # 956 جم مل & # 87221 على التوالي. محتويات PAA و PAM و PEG و pSB في مشتقات GO هي 43.48 & # 37 و 40.96 & # 37 و 42.53 & # 37 و 38.70 & # 37 ، على التوالي. (ه) شدة نطاق PCR بتركيزات مختلفة من مشتقات GO في الجولة الأولى من PCR. (ي) شدة نطاق PCR بتركيزات مختلفة من مشتقات GO في الجولة الثانية PCR.
الاختصارات: GO ، أكسيد الجرافين PAA ، حمض البولي أكريليك PAM ، بولي أكريلاميد PCRs ، تفاعلات البوليميراز المتسلسلة PEG ، البولي إيثيلين جلايكول pSB ، بولي (سلفوبيتين).

من أجل تأكيد أن تعزيز خصوصية نتائج PCR من GOs المعدلة بالبوليمر وليس من البوليمرات ، قمنا بدراسة تأثير البوليمرات العارية على خصوصية PCR بدون GO. تمت إضافة الكميات المحسوبة من البوليمرات وفقًا لبيانات TGA لمشتقات GO إلى نظام PCR. تظهر النتائج أنه لا يوجد تغيير في النطاق (الشكل S10). فقط عند زيادة تركيز البوليمر & # 621000 ضعف من ميكروجرام لكل مليلتر إلى مليغرام لكل مليلتر ، يمكن تحسين خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل S11). تشير هذه النتائج إلى أن تعزيز خصوصية نتائج PCR من GO المعدل بالبوليمر وليس من البوليمرات العارية. بناءً على النتائج السابقة ، GO ليس معززًا جيدًا في خصوصية PCR. وبالتالي ، فإن تعزيز خصوصية مشتق PCR بواسطة GO يُعزى إلى الجمع أو التأثير التآزري لـ GO والبوليمرات.

يوضح الشكل 5 أنه عند التركيزات العالية من مشتقات GO أو GO ، يتم منع نطاقات التحكم (الممر 1). من أجل اختبار ما إذا كان Pfu يتم امتصاص البوليميراز على أسطح GO ومشتقاتها ، تمت إضافة BSA إلى نظام PCR الذي تم تثبيطه بواسطة مشتقات GO و GO الزائدة. بعد إضافة مساحة سطح الجسم ، يتم استرداد جميع تفاعلات البوليميراز وتزداد شدة النطاق مع زيادة تركيز مساحة سطح الجسم. وتعزى النتيجة إلى الامتصاص التنافسي لـ BSA على سطح GO ومشتقاته. وهكذا ، فإن كثف Pfu تم إطلاق البوليميراز في المحلول ، مما أدى إلى استرداد PCR. تشير النتائج إلى وجود تفاعل قوي بين مشتقات GO و GO و Pfu بوليميراز. قمنا أيضًا باحتضان GO ومشتقاتها مع Pfu بوليميراز لمدة ساعة في الجليد للسماح بامتصاص كافٍ لـ Pfu بوليميراز مع GO أو مشتقاته. ثم أضفنا مكونات PCR أخرى وأجرينا PCRs. يؤكد الشكل S12 كفاءة PCR بعد امتصاص Pfu البوليميراز على GO أو مشتقاته.

الشكل 5 تأثير BSA على PCR مثبط بواسطة GO ومشتقاته.
ملحوظات: م: علامة الحمض النووي. (أ) GO (9.6 & # 956g مل & # 87221) ، (ب) GO-PAA (4.8 & # 956g مل & # 87221) ، (ج) GO-PAM (8.0 & # 956g ml & # 87221). (د) GO-PEG (24.0 & # 956g مل & # 87221) و (ه) GO-pSB (24.0 & # 956g مل & # 87221). تركيز BSA في الممرات 1 & ​​# 82114 هو 0 & # 956g mL & # 87221، 2.0 & # 956g mL & # 87221، 20.0 & # 956g ml & # 87221 and 200.0 & # 956g mL & # 87221 ، على التوالي.
الاختصارات: BSA ، مصل الألبومين البقري GO ، أكسيد الجرافين PAA ، حمض البولي أكريليك PAM ، بولي أكريلاميد PCR ، تفاعل البوليميراز المتسلسل PEG ، البولي إيثيلين جلايكول pSB ، بولي (سلفوبيتين).

تم تثبيط PCR عندما تم زيادة تركيز مشتق GO (الشكل 4). يمكن أن تمتص كل ورقة GO مشحونة إيجابيا Pfu بوليميراز أو Mg 2 & # 43 بسبب مساحة سطحها الكبيرة والعديد من مجموعات الكربوكسيل سالبة الشحنة. ستؤدي زيادة تركيز مشتق GO إلى تقليل كمية الامتصاص لـ Pfu البوليميراز و Mg 2 & # 43 على ورقة GO واحدة ، مما يؤدي إلى تقليل كفاءة PCR. عند إضافة Mg 2 & # 43 الزائدة إلى نظام PCR ، سيتم امتصاص المزيد من Mg 2 & # 43 على مشتقات GO المشحونة سالبًا باستخدام Pfu البوليميراز لاستعادة PCR. يوضح الشكل 6 أن النطاقات المثبطة يتم استعادتها بعد إضافة 1 & # 82112 ملي مولار ملغ 2 & # 43. لذلك ، تشير النتائج كذلك إلى أنه سيتم منع تفاعل البوليميراز المتسلسل إذا كان Pfu يتم امتصاص البوليميراز و Mg 2 & # 43 على انخفاض مشتق GO واحد.

الشكل 6 تأثير تركيز Mg 2 & # 43 على تفاعل البوليميراز المتسلسل بمساعدة GO ومشتقاته.
ملحوظات: م: علامة الحمض النووي. (أ) GO (9.6 & # 956g mL & # 87221). (ب) GO-PAA (4.8 & # 956g مل & # 87221). (ج) GO-PAM (8.0 & # 956g mL & # 87221). (د) GO-PEG (24.0 & # 956g مل & # 87221). (ه) GO-pSB (24.0 & # 956g مل & # 87221). تركيز Mg 2 & # 43 المضاف في الممرات 1 & ​​# 82114 هو 0 ملم ، 0.4 ملم ، 1.0 ملم و 2.0 ملم ، على التوالي (لم يتم تضمين 2 ملم مغ 2 & # 43 الأصلي).
الاختصارات: GO ، أكسيد الجرافين PAA ، حمض البولي أكريليك PAM ، بولي أكريلاميد PCR ، تفاعل البوليميراز المتسلسل PEG ، البولي إيثيلين جلايكول pSB ، بولي (سلفوبيتين).

Pfu يمتلك البوليميراز نشاطًا تدقيقًا ويمكن استخدامه بدلاً من طق بوليميراز لأداء دقة أعلى في تخليق الحمض النووي. لتأكيد ما إذا كانت GO أو مشتقاتها ستؤثر على دقة PCR ، تم ترتيب جميع منتجات PCR في غياب أو وجود GO ومشتقاتها. تؤكد البيانات أن GO ومشتقاتها ليس لها أي تأثير على دقة Pfu البوليميراز (الشكل S13). تشير النتائج كذلك إلى أن خصوصية PCR تم تحسينها وإخلاصها Pfu البوليميراز مضمون في وجود مشتقات GO.

التطبيق في العينات السريرية

أخيرًا ، تم استخدام مشتقات GO أيضًا لتعزيز خصوصية PCR لتضخيم عينات العيادة المعقدة. تم استخدام الحمض النووي الجيني لدم الإنسان كقالب. تم تضخيم جزء 324 نقطة أساس من الحمض النووي للميتوكوندريا. في الجولة الأولى والثانية من PCRs ، لم يتم ملاحظة أي نطاقات تشويه لجميع العينات ، ولكن النطاق المستهدف أضعف في الجولة الثانية من PCR بدون مشتق GO من العينة التي تحتوي على مشتقات GO (الشكل 7). في الجولة الثالثة PCR ، يوجد شريط تشويه قوي لـ PCR بدون مشتق GO ويصبح النطاق المستهدف ضئيلًا. ومع ذلك ، لا تزال النطاقات المستهدفة ملحوظة مع انخفاض المنتجات غير المحددة في وجود مشتقات GO. لذلك ، تعزز مشتقات GO خصوصية PCR لتضخيم عينات العيادة المعقدة. تشير النتائج إلى أن مشتقات GO قد يكون لها تطبيقات محتملة في التشخيص الجزيئي السريري.

الشكل 7 تطبيق مشتقات GO لتضخيم عينات العيادة.
ملحوظات: القالب هو الحمض النووي للميتوكوندريا من الحمض النووي الجيني لدم الإنسان المأخوذ من عينات العيادة. M: علامة الحمض النووي 1: الجولة الأولى PCR 2: الجولة الثانية PCR 3: الجولة الثالثة PCR C: تجارب التحكم بدون مشتقات GO. تركيزات GO-PAA و GO-PAM و GO-PEG و GO-pSB هي 0.6 & # 956g mL & # 87221، 2.4 & # 956g mL & # 87221، 4.8 & # 956g mL & # 87221 and 19.2 & # 956g مل & # 87221 ، على التوالي.
الاختصارات: GO ، أكسيد الجرافين PAA ، حمض البولي أكريليك PAM ، بولي أكريلاميد PCR ، تفاعل البوليميراز المتسلسل PEG ، البولي إيثيلين جلايكول pSB ، بولي (سلفوبيتين).

محاكاة التفاعل بين البوليميراز والبوليمر

من الصعب للغاية محاكاة التفاعل بين البوليميراز و GO المعدل بالبوليمر. وبالتالي ، تم استخدام محاكاة الديناميات الجزيئية والالتحام الجزيئي لدراسة التفاعل المحتمل بين البوليمر و Pfu البوليميراز عندما تم إهمال GO للتبسيط. Pfu يحتوي البوليميراز على المجالات الخمسة التالية: N-terminal (البقايا 1 & # 8211130 و 327 & # 8211368) ، نوكلياز خارجي (131 & # 8211326) ، النخيل (369 & # 8211450 و 501 & # 8211588) ، والأصابع (451 & # 8211500) ومجالات الإبهام ( 589 & # 8211775) (الشكل S14). يتم تنسيق آلية التدقيق والبلمرة من التفاعلات بين الحلقة (144 & # 8211158) لمجال نوكلياز خارجي والحافة الموجبة الشحنة لمجال الإبهام. أظهر الالتحام الجزيئي 48 أن مواقع ربط البوليمرات كانت موجودة في مجال نوكلياز خارجي ، إبهام ، كف ، وأصابع عن طريق حسابات الالتحام (الشكل S14). انخفضت تقاربات الربط بالترتيب التالي: PAA & # 62 PAM & # 62 PEG & # 62 pSB (الجدول S8). تقلبت طاقات Coul قصيرة المدى على نطاق واسع على مدار 10 نانوثانية موازنة ، ووصلت إلى ثبات بعد & # 1264 نانوثانية (الشكل S15A و ​​B). يشير تحليل طاقة Coul قصير المدى إلى وجود تفاعل إلكتروستاتيكي قوي بين PAA و Pfu (& # 87222248 & # 177203 كيلوجول مول & # 87221). طاقة Coul قصيرة المدى لـ Pfu-PAM هو & # 8722959 & # 177107 kJ mol & # 87221 ، في حين أن PEG و pSB ليس لهما تفاعل إلكتروستاتيكي تقريبًا مع Pfu (الجدول S9). يتوافق هذا الترتيب مع نتائج PCR (الشكل S11). مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيب (SASA) هي مساحة سطح جزيء حيوي يمكن للمذيب الوصول إليه. SASA من Pfu-PEG و Pfu-pSB تكافئ تقريبًا في 10 نانوثانية (الشكل S15C) ، مما يشير إلى أن PEG و pSB لهما تأثير مماثل على ارتباط الركيزة الإنزيم & # 8211. الحد الأدنى للمسافة من PEG و Pfu يتقلب في نطاق واسع ، مما يشير إلى مرونة أعلى في PEG من pSB (الشكل S15D).يوضح توزيع المذيبات التراكمي أن منطقة ثنائي القطب لجزيء المذيب حول PEG أكبر بكثير من منطقة pSB (الشكل S15E و F) ، مما يشير إلى أن PEG و pSB يؤثران على المذيب والبروتين في مستويات مختلفة. أظهرت محاكاة الديناميكيات الجزيئية أن Pfu& # 8211PAA معقدة (PAA: الشريط البني أدناه Pfu) أقوى تفاعل تلاه Pfu& # 8211PAM complex (PAM: الشريط الأزرق أدناه Pfu) (الشكل 8 أ و ب). سيكون التفاعل عبارة عن تفاعلات كهروستاتيكية وكارهة للماء وقوة van der Waals & # 8217. من الواضح أنه لا يوجد تفاعل مباشر بين Pfu بوليميراز و PEG و Pfu البوليميراز و pSB (الشكل 8C و D). تتوافق هذه النتائج مع تحليل الطاقة قصير المدى Coul. تعتبر نتائج محاكاة الديناميات الجزيئية والالتحام الجزيئي معقولة لأن PEG يمكن أن تقلل من امتصاص البروتين ، وللبوليمر zwitterionic قدرة أفضل على تقليل امتصاص البروتين مقارنة بـ PEG. 50 تقاربات ملزمة من البوليمرات مع Pfu كما يدعم البوليميراز (الجدول S8) النتيجة.

الشكل 8 محاكاة MD لتفاعل Pfu بوليميراز مع PAA (أ) ، بام (ب) ، ربط (ج) و pSB (د).
الاختصارات: MD ، الديناميكيات الجزيئية PAA ، حمض البولي أكريليك PAM ، بولي أكريلاميد PEG ، البولي إيثيلين جلايكول pSB ، بولي (سلفوبيتين).

إلى جانب التفاعل بين Pfu بوليميراز وبوليمر ، GO سالب الشحنة وشحنة موجبة Pfu يحتوي البوليميراز أيضًا على تفاعلات تكديس إلكتروستاتيكية قوية وكارهة للماء و & # 960 & # 8211 & # 960. سيقلل PEG و pSB من هذه التفاعلات بسبب تقليل امتصاص Pfu بوليميراز. وبالتالي ، لا يمنع GO-PEG و GO-pSB PCR في نطاق تركيز أوسع من GO-PAA و GO-PAM ، وهو ما يتوافق مع النتائج التجريبية (الشكل 4). كمية قليلة من موجب الشحنة Pfu لا يزال يتم امتصاص البوليميراز بواسطة GO سالب الشحنة في GO-PEG و GO-pSB ، على الرغم من أن PEG و pSB سيقللان من امتصاصه. وبالتالي ، يتم أيضًا تحسين خصوصية PCR بواسطة PCR بمساعدة مشتق GO. لذلك ، تؤكد هذه النتائج أيضًا أن مشتقات GO هذه يمكن أن تعزز خصوصية PCR.

لقد درسنا تأثير GO بأحجام مختلفة ودرجات اختزال وتعديلات سطحية على خصوصية PCR. تشير النتائج إلى أن L-GO و RGO متفوقان على S-GO وغير RGO في تعزيز خصوصية PCR. بالنسبة لمشتقات GO ، تزداد القدرة على تحسين خصوصية PCR بالترتيب التالي: GO-PAA & # 60 GO-PAM & # 60 GO-PEG & # 60 GO-pSB. توضح دراستنا أن كلا من GO وخصائص سطحه تؤثر على خصوصية PCR. يمكن استخدام مشتقات GO كإضافات فعالة لتعزيز خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل في التشخيص الجزيئي السريري.

هذه الدراسة مدعومة من قبل مشروع National Basic Research 973 (2014CB932004) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في جمهورية الصين (31371005 و 81571764 و 81171453). نشكر البروفيسور Zhiliang Ji من مختبر مفتاح الدولة لبيولوجيا الإجهاد الخلوي ، كلية علوم الحياة ، جامعة شيامن ، لاقتراحه في المحاكاة. نشكر الدكتور يوآف فالج من معهد وايزمان للعلوم بإسرائيل على مشورته الكريمة ومراجعته للغة. كما نشكر الأستاذ Chuanliu Wu وطالب الدكتوراه الخاص به Yaqi Chen على مساعدتهما الطيبة في جميع قياسات مركز التجارة الدولية.

ساهم جميع المؤلفين في تحليل البيانات وصياغة الورقة ومراجعتها بشكل نقدي ويوافقون على أن يكونوا مسؤولين عن جميع جوانب العمل.

الكتاب تقرير لا تضارب في المصالح في هذا العمل.

Saiki RK ، Scharf S ، Faloona F ، et al. التضخيم الأنزيمي للتسلسل الجيني B-globin وتحليل موقع التقييد لتشخيص فقر الدم المنجلي. علم. 1985230(4732):1350�.

Markus R و Robert Q و Hans-J & # 246rg W و Hans L و Marie-Laure Y و Sylvia K. مزيج محسن اقتصادي وفعال لـ PCR. Biochem Biophys Res Commun. 2006347(3):747�.

Zhang L، Cui XF، Schmitt K، Hubert R، Navidi W، Arnheim N. تضخيم الجينوم الكامل من خلية واحدة: الآثار المترتبة على التحليل الجيني. Proc Natl Acad Sci U S A. 199289(13):5847�.

مايكل آر جي ، جوزيف س. الفصل السابع: تفاعل البلمرة المتسلسل. الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل. الطبعة الرابعة. Michael RG، Joseph S، editors New York، NY: Cold Spring Harbour 2012: 455 & # 8211469.

Saiki RK ، و Gelfand DH ، و Stoffel S ، وآخرون. التضخيم الأنزيمي الموجه التمهيدي للحمض النووي. علم. 1988239(4839):487�.

تشاكرابارتي آر ، شوت سي. تعزيز تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة السلفونات منخفضة الوزن الجزيئي. الجين. 2001274(1𔃀):293�.

إيلي J ، ريفز دانيال أ ، كامبل إم ، كامبل إم إل ، كوهلر إس ، ستون دبليو إتش. تأثير تركيز أيون المغنيسيوم وظروف تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل على تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر الأنواع. التقنيات الحيوية. 199825(1):38󈞖.

Henke W ، Herdel K ، Jung K ، Schnorret D ، Loening SA. يحسن البيتين تضخيم PCR لتسلسل الحمض النووي الغني بالـ GC. الدقة الأحماض النووية. 199725(19):3957�.

Li H ، Huang J ، Lv J ، وآخرون. PCR الجسيمات النانوية: PCR بمساعدة النانو مع خصوصية معززة. Angew Chem Int إد إنجل. 200544(32):5100�.

خالق A ، Sonawane PJ ، Sasi BK ، وآخرون. تحسين كفاءة تفاعل البلمرة المتسلسل بواسطة TiO22 الجسيمات النانوية: دور حاسم في تحسين التوصيل الحراري. تقنية النانو. 201021(25):255704.

Nie L ، Gao L ، Yan X ، Wang T. هياكل نانوية ZnO وظيفية تشبه رباعي الأرجل لتنقية DNA البلازميد ، تفاعل البلمرة المتسلسل والتسليم. تقنية النانو. 200618(1):015101.

تشانغ ZZ ، وانغ MC ، An HJ. يعزز التعليق المائي لمسحوق الكربون النانوي كفاءة تفاعل البلمرة المتسلسل. تقنية النانو. 200718(35):355706.

عبد القادر ، كفافي ر ، حمزة MS ، وليد ف ف. تعزيز كفاءة تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام رقائق الجرافين النانوية. تقنية النانو. 201223(45):455106.

Wang L و Zhu Y و Jiang Y وآخرون. تأثيرات النقاط الكمومية في تفاعل البلمرة المتسلسل. J فيز تشيم ب. 2009113(21):7637�.

Chen J و Cao X و Guo R et al. مُحسِّن فعال للغاية لتفاعل البوليميراز المتسلسل يعتمد على جزيئات الذهب النانوية المتشعبة. المحلل. 2012137(1):223�.

وانغ ح ، وانغ ل ، يوان ل ، يانغ دبليو ، براش جيه إل ، تشن هـ. التأثير التثبيطي لأسلاك السيليكون النانوية على تفاعل البوليميراز المتسلسل. تقنية النانو. 201223(36):365101.

Yang W ، Shen C ، Ji Q ، وآخرون. تتداخل جزيئات الفضة النانوية في مواد تخزين الطعام مع دقة تكرار الحمض النووي وترتبط بالحمض النووي. تقنية النانو. 200920(8):085102.

دينغ ك ، وانغ إن ، يان س ، غوان دبليو تأثير المواد النانوية # 8217s على تفاعل البلمرة المتسلسل. النانو بالعملة. 20139(3):415�.

Jia J، Sun LP، Hu N، Huang GM، Weng J. الجرافين يعزز خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل. صغير. 20128(13):2011�.

Pan D ، Mi L ، Huang Q ، Hu J ، Fan C. التحليل الجيني باستخدام نانو PCR. إنتجر بيول. 20124(10):1155�.

Ma L، He S، Huang J، Cao L، Yang F، Li L. تعظيم خصوصية وإنتاجية تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة النقطة الكمومية نفسها بدلاً من خاصية سطح النقطة الكمومية. بيوكيمي. 200991(8):969�.

Bai Y، Cui Y، Paoli GC، Shi C، Wang D، Shi X. تؤثر الجسيمات النانوية على تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل أساسي من خلال التفاعلات السطحية مع مكونات PCR: باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية المطلية بالسيليكا المعدلة أمينيًا كنموذج رئيسي. واجهات ACS Appl Mater. 20157(24):13142�.

Cao X، Shen M، Zhang X، Hu J، Wang J، Shi X. تأثير المجموعات الوظيفية السطحية لجسيمات الذهب النانوية المغطاة بالشجيرات على تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل. الكهربائي. 201233(16):2598�.

Cao X، Chen J، Wen S، Peng C، Shen M، Shi X. تأثير الشحنة السطحية للأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران المعدلة بالبولي إيثيلين أمين على تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل. مقياس النانو. 20113:1741�.

تونج دبليو ، كاو إكس ، وين إس ، إت آل. تعزيز خصوصية وكفاءة تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام المشتقات القائمة على البولي إيثيلين أمين والمركبات النانوية الهجينة. Int ياء طب النانو. 20127:1069�.

Kuila T ، Bose S ، Mishra AK ، Khanraa P ، Kimc NH ، Lee JH. التفعيل الكيميائي للجرافين وتطبيقاته. بروغ ماتر سسي. 201257(7):1061�.

Li C ، Yang Y ، Wu D ، Li T ، Yin Y ، Li G. تحسين مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم للكشف متعدد الألوان عن المؤشرات الحيوية. علم العلوم. 20167:3011�.

Huang Y ، Li H ، Fan Q ، Wang L ، Wang Y ، Li G. الكشف الفائق الحساسية القائم على الحفاز النانوي متعدد الوظائف عن ترانسجلوتاميناز الأنسجة البشرية 2. بيوسنس بيوإلكترون. 201683(15):85󈟆.

Gao T و Yang D و Ning L و Lei L و Ye Z و Li G. بلورات نانوية فضية متناهية الصغر ومشتتة جيدًا على صفائح نانوية ثنائية الأبعاد: التوليف والتطبيق كمواد متعددة الوظائف للتحفيز الكهروكيميائي والاستشعار الحيوي. مقياس النانو. 20146(24):14828�.

Gao T ، Liu F ، Yang D ، Yu Y ، Wang Z ، Li G. تجميع سطح المحاكاة الحيوية الانتقائي على سطح قطب كهربائي: تصميم واجهة nano & # 8211bio للاستشعار الحيوي. الشرج تشيم. 201587(11):5683�.

Chen H ، Ruckenstein E. غشاء نانوي يحتوي على ثقب نانوي في محلول إلكتروليت: نهج الديناميكيات الجزيئية. J فيز تشيم ليت. 20145(17):2979�.

Yang Q ، Wang Z ، Weng J. التجميع الذاتي للجلوتاثيون ثلاثي الببتيد الطبيعي الناتج عن أكسيد الجرافين. مادة ناعمة. 20128:9855�.

Dong J، Weng J، Dai L، Dong J، Weng J، Dai L. تأثير الجرافين على درجة حرارة المحلول الحرجة المنخفضة للبولي (ن-ايزوبروبيل أكريلاميد). الكربون N Y. 201352:326�.

خان يو ، O & # 8217 نيل أ ، بوروال إتش ، بيتر م ، نواز ك ، كولمان ج. اختيار حجم رقائق الجرافين المشتتة والمقشرة عن طريق الطرد المركزي المتحكم فيه. الكربون N Y. 201250(2):470�.

Dong J ، Ding J ، Weng J ، Dai L. يعزز الجرافين ذاكرة الشكل للبولي (حمض أكريلاميد-أكريليك) المطعمة على الجرافين. ماكرومول السريع كومون. 201334(8):659�.

Liu Z ، Robinson JT ، Sun X ، Dai H. أكسيد النانوغرافين المخصب لتوصيل أدوية السرطان غير القابلة للذوبان في الماء. شركة J Am Chem Soc. 2008130(33):10876�.

Boehm HP، Diehl E، Heck W، Sappok R. أكاسيد الكربون السطحية. Angew Chem Int إد إنجل. 19643(10):669�.

فان دير سبويل د ، ليندال إي ، هيس ب ، جروينهوف جي ، مارك إيه إي ، بيرندسن إتش جيه سي. GROMACS: سريع ومرن ومجاني. J كمبوت تشيم. 200526(16):1701�.

هوانغ جيه ، ماكريل أد. CHARMM36 مجال قوة البروتين المضاف لجميع الذرات: التحقق من الصحة على أساس المقارنة مع بيانات الرنين المغناطيسي النووي. J كمبوت تشيم. 201334(25):2135�.

Vilar S و Cozza G و Moro S. الكيمياء الطبية وبيئة التشغيل الجزيئي (MOE): تطبيق QSAR والالتحام الجزيئي لاكتشاف الأدوية. Curr Top Med Chem. 20088(18):1555�.

تروت يا ، أولسون أ. AutoDock Vina: تحسين سرعة ودقة الإرساء باستخدام وظيفة تسجيل جديدة وتحسين فعال وتعدد مؤشرات الترابط. J كمبوت تشيم. 201031(2):455�.

Lu C ، Yang H ، Zhu C ، Chen X ، Chen G. منصة الجرافين لاستشعار الجزيئات الحيوية. انجيو كيم. 2009121(26):4879�.

Pan J ، Li H ، Cao X ، وآخرون. تفاعل البلمرة المتسلسل متعدد الجولات بمساعدة النانو (PCR). ياء نانوسسي نانوتكنول. 20077(12):4428�.

Guan G و Zhang S و Liu S et al. يحفز البروتين تقشير طبقة تلو الأخرى لثنائي كالكوجينيدات المعادن الانتقالية. شركة J Am Chem Soc. 2015137(19):6152�.

Zhang Y، Zhang J، Huang X، Zhou X، Wu H، Guo S. تجميع أكسيد الجرافين & # 8211 إنزيم متقارن من خلال تفاعل مسعور. صغير. 20128(1):154�.

Chervenak MC ، Toone EJ. تحليل كالوريمتر لربط الليكتين مع خصائص ترابط رابطة الكربوهيدرات المتداخلة. الكيمياء الحيوية. 199534(16):5685�.

كوبر أ. تأثيرات السعة الحرارية في طي البروتين وربط الترابط: إعادة تقييم دور الماء في الديناميكا الحرارية الجزيئية الحيوية. بيوفيس كيم. 2005115(2𔃁):89󈟍.

Kim S، Kim D، Kim J، Kangd L، Cho H. هيكل الكريستال Pfu، بوليميراز DNA عالي الدقة من Pyrococcus furiosus. إنت J بيول ماكرومول. 200842(4):356�.

Gooth NW، Hlady V. اثنان من التدرجات السطحية من البولي إيثيلين جلايكول لتقليل امتصاص البروتين. تصفح إنوف. 20153(3):172�.

كيفي أج ، جيانغ سي. توفر اقترانات البروتينات المتعددة (zwitterionic) مزيدًا من الاستقرار دون التضحية بتقارب الارتباط أو النشاط الحيوي. نات تشيم. 20124(1):59󈞫.

/> تم نشر هذا العمل وترخيصه بواسطة Dove Medical Press Limited. تتوفر الشروط الكاملة لهذا الترخيص على https://www.dovepress.com/terms.php وتتضمن ترخيص Creative Commons Attribution - Non Commercial (unported، v3.0). من خلال الوصول إلى العمل ، فإنك توافق بموجب هذا على الشروط. يُسمح بالاستخدامات غير التجارية للعمل دون أي إذن آخر من Dove Medical Press Limited ، بشرط إسناد العمل بشكل صحيح. للحصول على إذن للاستخدام التجاري لهذا العمل ، يرجى الاطلاع على الفقرتين 4.2 و 5 من شروطنا.

& نسخ حقوق الطبع والنشر 2021 &ثور دوف بريس ليمتد & bull تطوير برمجيات maffey.com & bull Web Design by Adhesion

الآراء المعبر عنها في جميع المقالات المنشورة هنا هي آراء المؤلف (المؤلفين) المحدد ، ولا تعكس بالضرورة آراء شركة Dove Medical Press Ltd أو أي من موظفيها.

دوف ميديكال برس هي جزء من مجموعة تايلور وفرانسيس ، قسم النشر الأكاديمي في Informa PLC
حقوق الطبع والنشر 2017 Informa PLC. كل الحقوق محفوظة. هذا الموقع مملوك ومدار من قبل Informa PLC ("Informa") التي يقع مكتبها المسجل في 5 Howick Place، London SW1P 1WG. مسجلة في إنجلترا وويلز. رقم 3099067. مجموعة ضريبة القيمة المضافة في المملكة المتحدة: GB 365 4626 36

من أجل تزويد زوار موقعنا الإلكتروني والمستخدمين المسجلين بخدمة مصممة خصيصًا لتفضيلاتهم الفردية ، نستخدم ملفات تعريف الارتباط لتحليل حركة الزوار وتخصيص المحتوى. يمكنك التعرف على استخدامنا لملفات تعريف الارتباط من خلال قراءة سياسة الخصوصية الخاصة بنا. نحتفظ أيضًا بالبيانات المتعلقة بزوارنا والمستخدمين المسجلين لدينا لأغراض داخلية ولمشاركة المعلومات مع شركائنا في العمل. يمكنك التعرف على بياناتك التي نحتفظ بها وكيفية معالجتها ومع من تتم مشاركتها وحقك في حذف بياناتك من خلال قراءة سياسة الخصوصية الخاصة بنا.

إذا كنت توافق على استخدامنا لملفات تعريف الارتباط ومحتويات سياسة الخصوصية الخاصة بنا ، فيرجى النقر فوق "قبول".


محتويات

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو تقنية بيولوجيا جزيئية تستخدم لتضخيم أجزاء معينة من الحمض النووي بعدة أوامر من حيث الحجم. يتم تضخيم الأجزاء المحددة من الحمض النووي عبر ثلاث عمليات ، التمسخ ، التلدين ، والتمديد - حيث يتم فصل خيوط الحمض النووي عن طريق رفع درجة الحرارة إلى درجة الحرارة المثلى من درجة حرارة الغرفة قبل أن تترابط البادئات ويحاذا البوليميراز النيوكليوتيدات مع حبلا القالب. يستخدم بوليميراز الحمض النووي ، وهو نشط قليلاً في درجات حرارة منخفضة. [1] في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ، يكتمل خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة ، وبسبب نشاط بوليميراز الدنا ، قد تشكل البادئات ثنائيات أولية أو تصلب إلى DNA بشكل غير محدد. أثناء إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يقوم بوليميراز الحمض النووي بتمديد أي قطعة من الحمض النووي باستخدام بادئات مرتبطة ، مما ينتج عنه منتجات مستهدفة ولكن أيضًا منتجات غير محددة تقلل من المحصول. في بداية PCR الساخنة ، يتم الاحتفاظ ببعض الكواشف منفصلة حتى يتم تسخين الخليط إلى درجة حرارة التلدين المحددة. هذا يقلل من وقت التلدين ، والذي بدوره يقلل من احتمال امتداد الحمض النووي غير المحدد وتأثير الارتباط التمهيدي غير المحدد قبل التمسخ. [6] [5]

في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ، تؤدي درجات الحرارة المنخفضة التي تقل عن درجة حرارة التلدين المثلى (50-65 درجة مئوية) إلى تعديلات خارج الهدف مثل التضخيم غير المحدد حيث ترتبط البادئات بشكل غير محدد بالحمض النووي. [5] هذه المركبات الأولية غير المحددة ، والتي تكون زائدة في الخليط ، هي السبب وراء تخليق المنتجات الثانوية مثل ديمر التمهيدي والتهيئة الخاطئة. [10] يعيق التهيئة الخاطئة بشكل كبير ويقلل من كفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال التنافس النشط مع التسلسلات المستهدفة للتضخيم. وبالمثل ، فإن ثنائيات التمهيدي تشكل معقدات تقلل من كمية تضخمات رقم النسخ التي تم الحصول عليها. [10] يمكن التحكم في ذلك عن طريق تنفيذ PCR بدء التشغيل الساخن والذي يسمح بسد امتدادات التمهيدي حتى يتم تلبية درجات الحرارة المثلى. [2]

في بداية PCR الساخنة ، يتم منع الكواشف المهمة (مثل بوليميريز الحمض النووي والعوامل المساعدة للمغنيسيوم) من التفاعل في خليط PCR حتى يتم الوفاء بدرجات الحرارة المثلى من خلال الفصل الفيزيائي أو التعديلات الكيميائية. [5] [2] يمكن أن يحدث تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الساخن أيضًا عندما يتم تثبيط / تعطيل بوليميراز Taq أو تأخير إضافته حتى درجات حرارة التلدين المثلى ، من خلال تعديلات ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد أو عن طريق تعديل البادئات من خلال التلاعب بالهيكل الثانوي.

غالبًا ما يكون تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (Hot start PCR) أسلوبًا أفضل مقابل تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي في الظروف التي يوجد فيها نقص في الحمض النووي في مزيج التفاعل (& gt10 4 نسخ) ، أو يكون قالب الحمض النووي شديد التعقيد أو إذا كان هناك عدة أزواج من بادئات قليل النوكليوتيد في تفاعل البوليميراز المتسلسل. [3]

بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل الساخن هو طريقة تمنع امتداد بوليميريز الحمض النووي عند درجة حرارة منخفضة لمنع الارتباط غير المحدد لتقليل فقد المحصول. يقلل بدء PCR الساخن من كمية الارتباط غير المحدد من خلال الكواشف المحددة حتى خطوات التسخين لـ PCR - الحد من التفاعل مبكرًا عن طريق الحد من بوليميريز DNA Taq في التفاعل. غالبًا ما يؤدي الارتباط غير المحدد إلى ثنائيات أولية وأهداف معدة بشكل خاطئ / خاطئ. [11] يمكن تصحيح ذلك من خلال طرق معدلة مثل:

تعطيل / تثبيط تحرير بوليميراز DNA Taq

الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم / بوليميراز DNA Taq المركب بأجسام مضادة لـ Taq DNA polymerase:

تعمل الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم على تعطيل بوليميراز Taq DNA. ترتبط الأجسام المضادة بالبوليميراز وترتبط بها ، مما يمنع تضخيم الحمض النووي المبكر الذي يمكن أن يحدث في درجات حرارة منخفضة. بمجرد استيفاء درجة حرارة التلدين المثلى ، ستبدأ الأجسام المضادة في التحلل والتفكك ، مما يؤدي إلى إطلاق بوليميريز DNA Taq في التفاعل والسماح ببدء عملية التضخيم. [2] [12] إن بوليميراز DNA البلاتيني Taq و AccuStart Taq DNA polymerase (كلاهما طور بواسطة أيوب راشتشيان في Life Technologies و Quanta BioSciences ، على التوالي) هما أمثلة على الأجسام المضادة المتاحة تجاريًا على أساس البدء الساخن لبوليميراز DNA Taq. يتم تجميع بوليميراز DNA Taq مسبقًا بمزيج من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بـ Taq DNA polymerase. [13]

يتم إنشاء حاجز مادي بين بوليميراز DNA Taq وبقية مكونات PCR بواسطة حبات الشمع التي تعتمد على درجة الحرارة. بمجرد أن ترتفع درجة الحرارة إلى أكثر من 70 درجة مئوية ، أثناء خطوة التمسخ في الدورة الأولى ، تذوب حبة الشمع ، مما يسمح لـ Taq DNA polymerase بالهروب عبر الحاجز وإطلاقه في التفاعل - بدء عملية التضخيم. تنتقل طبقة الشمع بعد ذلك إلى أعلى خليط التفاعل أثناء مرحلة التضخيم لتعمل لاحقًا كحاجز بخار. [2]

قليل النوكليوتيدات عالية النوعية:

قليل النوكليوتيدات عبارة عن بوليمرات قصيرة من الحمض النووي ترتبط بسهولة. ترتبط oligonucleotides عالية النوعية ، مثل aptamers ، ببوليميراز Taq DNA عند درجات حرارة منخفضة مما يجعلها غير نشطة في الخليط. فقط في درجات حرارة أعلى ، تنفصل قليل النوكليوتيدات عن Taq مما يسمح لها بالتفاعل. [5]

هذه هي أكثر الطرق فعالية لبداية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، والأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم وطرق قليلة النوكليوتيدات شديدة التحديد هي الأكثر ملاءمة أثناء الإجراءات التي تتطلب وقتًا أقصر من التعطيل. [14] ومع ذلك ، من المعروف أن طرقًا أخرى يتم تنفيذها مثل:

الإضافة المتأخرة لـ Taq DNA polymerase Edit

يتم تسخين آلة PCR مسبقًا بينما يتم خلط المكونات فوق الثلج ثم يتم وضعها على الفور في آلة PCR بمجرد وصولها إلى درجة الحرارة المثلى. سيؤدي ذلك إلى القضاء على عملية الإحماء المطلوبة ، وتقليل التلدين غير المحدد للبادئات ويضمن فصل أي بادئات افتراضية مقترنة في الخليط. [15]

يعمل التجميد كشكل من أشكال الفصل الجسدي مثل حبات الشمع. يتم تجميد خليط التفاعل الذي يحتوي على مواد أولية ، وخيط القالب ، وماء ، وثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد (dNTP) قبل Taq polymerase وتضاف مكونات PCR المتبقية فوق الخليط المجمد. يعمل هذا على منع الارتباط غير المحدد. [15]

يتم تحضير مكونات PCR في خليط التفاعل وتسخينها بدون إضافة Taq. يتم إدخال Taq لاحقًا في الخليط بمجرد الوصول إلى درجة الحرارة المثلى. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة هي الأقل موثوقية وقد تؤدي إلى تلوث المكونات. [15]

هناك طريقة أخرى من خلال بدء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الساخن بوساطة ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد والذي يعدل قواعد النوكليوتيدات من خلال مجموعة الحماية.

تعديل تعديلات Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP)

يمكن تعديل البدء الساخن dNTP كيميائيًا ليشمل مجموعة حماية حساسة للحرارة عند الطرف الثالث الأساسي. سيمنع هذا التعديل النيوكليوتيدات من التفاعل مع بوليميراز Taq للارتباط بحبلا القالب حتى يتم الوصول إلى درجات الحرارة المثلى لذلك ، ستتم إزالة مجموعة الحماية أثناء خطوة تنشيط الحرارة. تحل البداية الساخنة dNTP و dA و dT و dC و dG محل النيوكليوتيدات الطبيعية. [16] [17] يوصى باستخدام كل النيوكليوتيدات الأربعة المعدلة ، ومع ذلك ، تُظهر الأبحاث السابقة أنه من خلال استبدال واحد أو اثنين من النيوكليوتيدات الطبيعية بـ dNTPs المعدلة سيكون كافياً لضمان عدم حدوث تضخيم غير محدد. [16] [17] هناك تعديل كيميائي آخر للحمض النووي يتم من خلال التعديل التساهمي القابل للانعكاس للحرارة والذي يعمل على إعاقة تهجين المواد الأولية إلى القالب محل الاهتمام. تتفاعل مجموعة amino guanosine مع الجليوكسال لتشكيل dG. [18]

تعديل الاشعال تعديل

قد تعيق بنية ثانوية معينة وظائف البادئات. على سبيل المثال ، قليل النوكليوتيدات مع هيكل دبوس الشعر لا يمكن أن تعمل بكفاءة كمادة أولية. ومع ذلك ، بعد تسخين مزيج التفاعل إلى درجة حرارة التلدين ، سيخضع التمهيدي لتغيير التشكل مما يسمح للبرايم بتكوين بنية خطية بدلاً من ذلك ، مما يتيح التمهيدي لربط الجزء المستهدف وبدء تفاعل البوليميراز المتسلسل. [19] [20]

أقفاص قابلة للإزالة ضوئيًا:

يتم دمج مجموعة القفص وهي مجموعة حماية قابلة للإزالة كيميائيًا ضوئيًا ، مثل فوسفوراميديت ثيميدين في قفص ، في برايمر قليل النوكليوتيد. هذا يسمح بتنشيط وظيفة التمهيدي وإلغاء تنشيطها من خلال استخدام الإشعاع فوق البنفسجي (365 نانومتر). لذلك ، يمكن تنشيط البادئات بعد الوصول إلى درجة حرارة التلدين. [21]

إضافة مضبوطة لتحرير المغنيسيوم

المغنيسيوم مطلوب في PCR ويعمل كعامل مساعد لأن Taq polymerase يعتمد على المغنيسيوم. [22] تؤدي زيادة تركيز المغنيسيوم والفوسفات إلى الكواشف المعيارية المعيارية إلى ترسيب مغنيسيوم ، مما يوفر بداية ساخنة للتفاعل حيث لا يوجد مغنيسيوم لبوليميراز الحمض النووي حتى أثناء مرحلة التدوير الحراري. أثناء التدوير الحراري ، يذوب المغنيسيوم مرة أخرى في المحلول ويصبح متاحًا للبوليميراز لاستخدامه مما يسمح له بالعمل بشكل طبيعي. [23]

يعد بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل الساخن مفيدًا لأنه يتطلب معالجة أقل ويقلل من خطر التلوث. يمكن تعديل بداية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كيميائيًا أو يعتمد على الجسم المضاد مما يوفر مزايا مختلفة للإجراء. في بداية PCR الساخنة المعدلة كيميائيًا ، يمكن اتخاذ الإجراء تحت درجة حرارة الغرفة ويقلل بشكل كبير من تكوين ثنائيات التمهيدي عن طريق منع الاشعال من الارتباط ببعضها البعض قبل بدء عملية PCR وكذلك الحد من فتيلة غير محددة. وبالمثل ، يمنع تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عند بدء التشغيل السريع ربط البادئات بتسلسلات القالب التي لها تماثل منخفض مما يؤدي إلى الخطأ في التفسير. يمكنه أيضًا تحسين الخصوصية والحساسية ، بسبب الشروط الصارمة ، فضلاً عن زيادة إنتاجية المنتج للجزء المستهدف. [5] في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الذي يعتمد على الجسم المضاد ، يتم تنشيط البوليميراز بعد خطوة التمسخ الأولي أثناء عملية التدوير ، وبالتالي تقليل الوقت المطلوب. هذا يؤدي أيضًا إلى خصوصية عالية. [14]

إلى جانب مزاياها ، فإن بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على الساخن له أيضًا قيود يجب مراعاتها قبل تنفيذ الطريقة. يتطلب بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الساخن إضافة حرارة لفترات زمنية أطول على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ، وبالتالي ، فإن قالب الحمض النووي أكثر عرضة للتلف. يعني وقت التسخين المتزايد أيضًا أن الإجراء غير متوافق مع إجراءات معينة مثل الأنبوب الواحد ، طريقة النسخ العكسي للعازل الفردي- PCR والتي تتطلب درجة حرارة أقل للخضوع لخطوة النسخ العكسي. [12] في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذي البداية الساخنة المعدلة كيميائيًا ، يمكن أن تتأثر عملية تضخيم الحمض النووي بشكل سلبي أولاً بسبب الزيادة الكبيرة في وقت إعادة التنشيط المطلوب لتنشيط البوليميراز وثانيًا إذا كان طول قالب الحمض النووي المستهدف طويلًا جدًا. [14] في الإجراءات المعتمدة على الجسم المضاد ، يتطلب كل إنزيم جسمًا مضادًا مختلفًا ، وبالتالي فإن تكلفة إجراء الإجراء أعلى [15]


مخطط اختيار DNA Polymerase

يسرد الجدول التالي الخصائص التي يجب مراعاتها عند اختيار البوليميراز. نظرًا لأن هذه الخصائص يمكن أن تعتمد على ظروف التفاعل ، يجب استشارة المراجع الأولية قبل استخدامها في تطبيق معين.

بوليميراز PCR 3 & Prime & ndash & gt5 & exonuclease الاخلاص 5 & ​​Prime & ndash & gt3 & Prime Exonuclease نزوح حبلا ترجمة نيك تمديد RNA التمهيدي تمديد من نيك تسامح دو النهايات الناتجة الصيغ الشعبية المتاحة التطبيقات
عالية الدقة PCR
Q5 & reg عالي الدقة بوليميريز DNA ++++ 280 ضعفًا طق لا _ لا لا لا لا صريح Q5 & reg عالي الدقة بوليميريز DNA PCR عالي الدقة ، PCR طويل المدى ، استنساخ من مادة في المختبر لتعبير البروتين أو تحليل الجينات ، تحليل SNP عبر الاستنساخ والتسلسل ، الطفرات الموجهة للموقع
Q5 & reg Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase
Q5 & reg عالي الدقة DNA Polymerase 2x Master Mix
Q5 & reg عالي الدقة Hot Start DNA Polymerase 2x Master Mix
NEBNext & reg Ultra & trade II Q5 & reg Master Mix مكتبة NGS الإعدادية
Q5U & reg Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase ++++ لا _ لا لا لا نعم صريح Q5U & reg Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase استنساخ المستخدم ، تضخيم عالي الدقة لركائز الحمض النووي المحولة أو المنزوعة الأمين ، منع الترحيل
NEBNext Q5U & reg Master Mix
Phusion & reg عالي الدقة DNA بوليميريز * ++++ 39 ب - 50 × ج طق لا _ لا لا لا لا صريح Phusion & reg عالي الدقة DNA Polymerase عالية الدقة PCR ، الاستنساخ
Phusion & reg عالي الدقة PCR Master Mix مع HF Buffer
Phusion & reg عالي الدقة PCR Master Mix مع GC Buffer
Phusion & reg Hot Start Flex DNA Polymerase
Phusion & reg Hot Start Flex 2X Master Mix
PCR الروتيني
واحدطق & ريج DNA Polymerase ++ 2x نعم _ ي نعم لا نعم نعم 3'A / بلانت واحدطق & reg DNA Polymerase PCR الروتيني ، مستعمرة PCR ، فحص النمط الجيني
واحدطق & reg Hot Start DNA Polymerase
واحدطق & ريج وواحدطق & ريج Hot Start 2x Master Mixes
واحدطق & reg سريع التحميل DNA بوليميريز
واحدطق & reg Quick-Load & reg 2X Master Mix
طق بوليميريز الحمض النووي _ 1x نعم _ ي نعم لا نعم نعم 3'A طقبوليميراز الحمض النووي مع المخزن المؤقت Thermopol PCR الروتيني
بداية ساخنة طقبوليميريز الحمض النووي
طق وبداية ساخنة طق 2X ماستر ميكس
تحميل سريع طق 2X ماستر ميكس
Multiplex PCR 5X Master Mix نقطة نهاية الإرسال المتعدد PCR
تخصص PCR
LongAmp & reg طق بوليميريز الحمض النووي ++ 2x نعم _أنا نعم لا نعم نعم 3'A / بلانت LongAmp & reg طق بوليميريز الحمض النووي PCR طويل المدى للقوالب المعقدة والبسيطة
LongAmp & reg Hot Start طق بوليميريز الحمض النووي
LongAmp & reg طق 2X ماستر ميكس
LongAmp & reg Hot Start طق 2X ماستر ميكس
هيمو كلينطق _ لا _ لا لا لا نعم 3'A هيمو كلينطق الدم المباشر PCR
Epimark & ​​reg Hot Start طق بوليميريز الحمض النووي _ نعم _ ي نعم لا نعم نعم 3'A Epimark & ​​reg Hot Start طق بوليميريز الحمض النووي تضخيم الحمض النووي المحول بيسلفيت ، في قوالب غنية
التضخيم متساوي الحرارة وتشريد حبلا 3 & Prime & ndash & gt5 & exonuclease معدل الخطأ (× 10-6)
5 & ​​Prime & ndash & gt3 & Prime Exonuclease نزوح حبلا ترجمة نيك تمديد RNA التمهيدي تمديد من نيك تسامح دو النهايات الناتجة الصيغ الشعبية المتاحة التطبيقات
بيست دي إن إيه بوليميراز ، كامل الطول _ نعم _ ي
نعم نعم نعم نعم 3'A بيست دي إن إيه بوليميراز ، كامل الطول ترجمة نيك
Bst DNA Polymerase ، جزء كبير _ لا ++++ لا نعم نعم نعم 3'A Bst DNA Polymerase ، جزء كبير التضخيم متساوي الحرارة (LAMP ، SDA) التشخيص الجزيئي والتشخيص الميداني
Bst 2.0 DNA Polymerase _ 62 (& plusmn5) هـ لا ++++ لا نعم نعم نعم 3'A Bst 2.0 DNA Polymerase
Bst 2.0 WarmStart & reg DNA Polymerase
تقنية WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix مع UDG
مجموعة مصابيح WarmStart & reg (DNA & amp RNA)
WarmStart & reg Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & amp RNA)
Bst 3.0 DNA Polymerase _ 70 (& plusmn23) هـ لا ++++ لا نعم نعم نعم 3'A Bst 3.0 DNA Polymerase
بوليميراز الحمض النووي Bsu ، جزء كبير _ لا + لا نعم نعم نعم 3'A بوليميراز الحمض النووي Bsu ، جزء كبير التضخيم متساوي الحرارة (RPA ، SDA ، RCA)
phi29 DNA Polymerase ++++ 5 ط لا + لا نعم نعم ك نعم صريح phi29 DNA Polymerase WGA
بوليميراز لمعالجة الحمض النووي 3 & Prime & ndash & gt5 & exonuclease معدل الخطأ (× 10-6) 5 & ​​Prime & ndash & gt3 & Prime Exonuclease نزوح حبلا ترجمة نيك تمديد RNA التمهيدي تمديد من نيك تسامح دو النهايات الناتجة الصيغ الشعبية المتاحة التطبيقات
T7 DNA Polymerase (غير معدل) ++++ 15 ساعة لا _ لا نعم لا صريح T7 DNA Polymerase (غير معدل)
Sulfolobus DNA Polymerase IV _ لا _ لا 3'A Sulfolobus DNA Polymerase IV مجازة الآفة العابرة
ثيرميناتور وتجارة دى ان ايه بوليميراز _ لا + لا نعم نعم نعم 3'A ثيرميناتور وتجارة دى ان ايه بوليميراز فاصل السلسلة
بوليميريز الحمض النووي 1 (E. coli) ++ 9 و نعم _ ي نعم نعم نعم نعم صريح بوليميريز الحمض النووي 1 (E. coli) التوليف الثاني ، ترجمة نيك
بوليميريز الحمض النووي I ، جزء كبير (كلينو) " ++ 18 جرام لا + لا نعم نعم نعم صريح بوليميريز الحمض النووي I ، جزء كبير (كلينو) " التمديد ، التمديد التمهيدي
جزء Klenow (3 & Prime & rarr5 & Prime exo_) _ 100 جرام لا +++ لا نعم نعم نعم 3'A جزء Klenow (3 & Prime & rarr5 & Prime exo_) نفايات ، وضع العلامات العشوائية
T4 DNA Polymerase ++++ & lt1 و لا _ لا نعم لا صريح T4 DNA Polymerase شحوب
تراث بوليميراز 3 & Prime & ndash & gt5 & exonuclease معدل الخطأ (× 10-6) 5 & ​​Prime & ndash & gt3 & Prime Exonuclease نزوح حبلا ترجمة نيك تمديد RNA التمهيدي تمديد من نيك تسامح دو النهايات الناتجة الصيغ الشعبية المتاحة التطبيقات
تنفيس & ريج DNA Polymerase ++ لا + لا لا نعم لا صريح تنفيس & ريج DNA Polymerase
Vent & reg (exo & ndash) DNA Polymerase _ لا +++ لا لا نعم لا 3'A Vent & reg (exo & ndash) DNA Polymerase
تنفيس عميق & ريج DNA بوليميراز +++ لا ++ لا لا نعم لا صريح تنفيس عميق & ريج DNA بوليميراز
تنفيس عميق & reg (exo & ndash) DNA Polymerase _ لا +++ لا لا نعم لا 3'A تنفيس عميق & reg (exo & ndash) DNA Polymerase

Deep Vent & reg و Therminator & trade علامتان تجاريتان لشركة New England Biolabs، Inc.
Q5 & reg، Q5U & reg، LongAmp & reg، Oneطق & reg، Vent & reg هي علامات تجارية مسجلة لشركة New England Biolabs، Inc.

* إشعار للعملاء:
تم تطوير Phusion & reg DNA Polymerase بواسطة Finnzymes Oy ، التي أصبحت الآن جزءًا من Thermo Fisher Scientific. تم تصنيع هذا المنتج من قبل شركة New England Biolabs، Inc. بموجب اتفاقية مع ووفقًا لمواصفات أداء Thermo Fisher Scientific.
Phusion & reg هي علامة تجارية مسجلة ومملوكة لشركة Thermo Fisher Scientific.


شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيًا بتمويل من وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (رقم 2015CB553402 ورقم 2016YFC0206300 إلى TFZ رقم 2017YFA0505200 إلى LL) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (رقم 31470532 ، رقم 91543102 ، ورقم 3111530153 إلى TFZ رقم 21532004 إلى LL) ، برنامج بكين نوفا (رقم Z171100001117011 إلى TFZ) ، برنامج البحث العلمي لمبادرة جامعة تسينغهوا (رقم 20161080152 إلى TFZ) ، مركز جامعة تسينغهوا - بكين لعلوم الحياة (CLS) ، ومركز بكين المتقدم للابتكار في علم الأحياء الإنشائي.


تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR)

في RT-PCR ، يتم تحويل مجموعة RNA إلى cDNA عن طريق النسخ العكسي (RT) ، ثم يتم تضخيم cDNA بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (شكل 1). توفر خطوة تضخيم (كدنا) فرصًا لمزيد من الدراسة لأنواع الحمض النووي الريبي الأصلية ، حتى عندما تكون محدودة الكمية أو يتم التعبير عنها بوفرة منخفضة. تشمل التطبيقات الشائعة لـ RT-PCR الكشف عن الجينات المعبر عنها ، وفحص متغيرات النسخ ، وتوليد قوالب cDNA للاستنساخ والتسلسل.

نظرًا لأن النسخ العكسي يوفر قوالب cDNA لتضخيم PCR وتجارب المصب ، فهي واحدة من أهم الخطوات للنجاح التجريبي. يجب أن يوفر النسخ العكسي المختار أعلى كفاءة حتى مع عينات الحمض النووي الريبي الصعبة ، مثل تلك المتدهورة ، أو التي تحتوي على مثبطات الانتقال ، أو تمتلك درجة عالية من البنية الثانوية. (ورق ابيض:نسخة عكسية هندسية)

عند إجراء RT-PCR ، فإن الطرق ذات الخطوة الواحدة والمكونة من خطوتين هما النهجان الشائعان ، ولكل منهما مزاياه وعيوبه (الشكل 2). كما يوحي الاسم، خطوة واحدة RT-PCR يجمع بين توليف (كدنا) الأول (RT) وما تلاه من تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوب تفاعل واحد. يعمل إعداد التفاعل هذا على تبسيط سير العمل وتقليل التباين وتقليل التلوث المحتمل. يسمح RT-PCR بخطوة واحدة بمعالجة أسهل لعدد كبير من العينات ، مما يجعله قابلاً للتطبيقات عالية الإنتاجية. ومع ذلك ، يستخدم RT-PCR من خطوة واحدة بادئات خاصة بالجينات للتضخيم ، مما يقصر التحليل على عدد قليل من الجينات لكل عينة من الحمض النووي الريبي. نظرًا لأن التفاعل هو حل وسط بين ظروف النسخ العكسي والتضخيم ، يمكن أن يكون RT-PCR من خطوة واحدة أقل حساسية وأقل كفاءة في بعض السيناريوهات. ومع ذلك ، فإن استخدام التمهيدي الخاص بالجينات في RT-PCR يمكن أن يساعد في زيادة إنتاجية (كدنا) الهدف وتقليل تضخيم الخلفية. (ورق ابيض:نظام RT-PCR مُحسَّن بخطوة واحدة)

خطوتين RT-PCR يستلزم تفاعلين منفصلين ، يبدأان بتوليف cDNA الأول (RT) ، متبوعًا بتضخيم جزء من cDNA الناتج بواسطة PCR في أنبوب منفصل. لذلك ، يعتبر RT-PCR من خطوتين مفيدًا للكشف عن جينات متعددة في عينة RNA واحدة. يسمح فصل تفاعلات RT و PCR بتحسين ظروف التفاعل لكل خطوة ، بالإضافة إلى المرونة مع بدء النسخ العكسي (بادئات oligo (dT) ، أو السداسيات العشوائية ، أو البادئات الخاصة بالجينات) وإعداد PCR (على سبيل المثال ، اختيار DNA polymerase ومكونات PCR). مقارنةً بـ RT-PCR من خطوة واحدة ، تشمل عيوب RT-PCR ذات الخطوتين خطوات متعددة لسير عمل ممتد ، ومعالجة ومعالجة إضافية للعينات ، وزيادة فرصة التلوث والتباين في النتائج.

الجدول 1. مقارنة من خطوة واحدة وخطوتين RT-PCR

خطوة واحدة RT-PCRخطوتين RT-PCR
اقامةالتفاعل المشترك في ظل الظروف التي تدعم كلاً من النسخ العكسي و PCRتفاعلات مُحسَّنة منفصلة للنسخ العكسي و PCR
الاشعالبادئات خاصة بالجيناتاختيار oligo (dT) ، أو السداسيات العشوائية ، أو البادئات الخاصة بالجينات
الاستخدام المثاليتحليل منصات عالية الإنتاجية لجين أو اثنينتحليل جينات متعددة
مميزاتمريحة وعالية الإنتاجيةمرن

خطوة واحدة مقابل خطوتين RT-PCR

تعرف على الاختلافات بين خطوة واحدة مقابل خطوتين RT-PCR وكيفية الاختيار بينهما لتطبيقاتك.

كيفية تحقيق نتائج RT-PCR محددة للغاية من خطوة واحدة

تعرف على آلية RT-PCR ذات الخطوة الواحدة وتحدياتها وكيفية التغلب عليها.

يتعلم أكثر

منتجات ذات صله


6.5: تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) - علم الأحياء

مطلوب الاشتراك في J o VE لعرض هذا المحتوى. ستتمكن من رؤية أول 20 ثانية فقط.

يتوافق مشغل الفيديو JoVE مع HTML5 و Adobe Flash. المتصفحات القديمة التي لا تدعم HTML5 وبرنامج ترميز الفيديو H.264 ستظل تستخدم مشغل فيديو يعتمد على Flash. نوصي بتنزيل أحدث إصدار من Flash هنا ، لكننا ندعم جميع الإصدارات 10 وما فوق.

إذا لم يساعد ذلك ، فيرجى إخبارنا بذلك.

الهدف من تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تضخيم التسلسل الجيني. في هذا المثال ، سيتم تضخيم الجين محل الاهتمام من الحمض النووي المنقى. من أجل إجراء التضخيم ، يلزم وجود بوليميراز لتخليق الحمض النووي الجديد.

هناك حاجة أيضًا إلى كتاب تمهيدي ، وهو قطعة قصيرة من الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل والتي تشترك في التماثل مع الجين محل الاهتمام. أخيرًا ، يتم استخدام نيوكليوتيدات مفردة تسمى Deoxynucleoside triphosphates أو dNTPs لصنع الشريط الجديد. الخطوة الأولى في تفاعل البوليميراز المتسلسل هي تسخين الخليط الذي يفسد الحمض النووي.

بعد ذلك ، يتم تبريد التفاعل وستصلب المواد الأولية إلى منطقتها المتجانسة. بمجرد ربط التفاعل يتم تسخينه إلى درجة حرارة مثالية للبوليميراز. يتعرف البوليميراز بعد ذلك على مركب DNA التمهيدي ويبدأ في تركيب الخيط الجديد باستخدام dNTPs في المحلول.

ثم يسخن التفاعل ويستمر كما هو موصوف عبر دورات إضافية. بعد الدورة الثالثة ، هناك ثماني نسخ إجمالية من الجين. بعد الدورة الرابعة 16 نسخة.

والدورة الخامسة 32 نسخة. سيستمر عدد الدورات في النمو أضعافا مضاعفة. بعد 30 دورة ، هناك ما يزيد قليلاً عن مليار نسخة.

15.14: PCR

ملخص

تفاعل البلمرة المتسلسل ، أو PCR ، هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لنسخ أجزاء من الحمض النووي. بسبب التضخيم الأسي ، يمكن أن ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ملايين أو مليارات من نسخ الحمض النووي في غضون ساعات قليلة.في تفاعل PCR ، يقوم إنزيم بوليميريز DNA المقاوم للحرارة بتضخيم الحمض النووي الأصلي من خلال سلسلة من التغيرات في درجة الحرارة داخل آلة مؤتمتة تسمى جهاز التدوير الحراري.

PCR هي طريقة متعددة الاستخدامات أحدثت ثورة في البيولوجيا الجزيئية

طور كاري موليس PCR في عام 1983 ، وحصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993. نظرًا لكونه طريقة سريعة وغير مكلفة ودقيقة نسبيًا لنسخ تسلسل الحمض النووي ، فقد أصبح PCR أداة لا تقدر بثمن للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك الاستنساخ الجزيئي ، والطفرات الجينية ، واكتشاف العوامل الممرضة ، وتحليل التعبير الجيني ، وتقدير وتسلسل الحمض النووي ، وتشخيص الأمراض الوراثية.

دورة تفاعل PCR

يحاكي تفاعل البوليميراز المتسلسل عملية تكرار الحمض النووي الطبيعية التي تحدث في الخلايا. يشتمل خليط التفاعل على تسلسل نموذجي للحمض النووي ليتم نسخه ، وزوجًا من جزيئات الحمض النووي القصيرة تسمى البادئات ، وكتل بناء الحمض النووي الحر تسمى ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs) ، وإنزيم بوليميريز DNA متخصص.

يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل سلسلة من الخطوات عند درجات حرارة عالية ، مما يتطلب إنزيم بوليميريز DNA الذي يعمل في درجات الحرارة هذه. إن بوليميراز الحمض النووي الأكثر استخدامًا هو طق البوليميراز ، سميت بعد Thermus aquaticus، وهي البكتيريا التي تم عزل البوليميراز منها في البداية. بوليميراز الدنا غير قادر على تخليق جزيء DNA من نقطة الصفر أو دي نوفو. بدلاً من ذلك ، يضيف بوليميراز الحمض النووي إلى جزيئات الحمض النووي القصيرة ، المسماة البادئات ، والتي ترتبط بقالب الحمض النووي من خلال الاقتران الأساسي التكميلي. توفر البادئات مجموعة هيدروكسيل 3 & rsquo مجانية والتي يمكن أن يعلق عليها DNA polymerase dNTPs جديدة. هناك أربعة أنواع من dNTPs في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، واحد لكل نوكليوتيد في جزيء الحمض النووي: dATP و dCTP و dGTP و dTTP.

تتكون كل دورة PCR من ثلاث خطوات: تمسخ ، تلدين ، وتخليق DNA.

  1. تمسخ. تبدأ دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل بتسخين خليط التفاعل إلى درجة حرارة عالية ، مما يؤدي إلى فصل اللولب المزدوج للحمض النووي إلى شريطين. عادة ما تحدث هذه العملية عند درجة حرارة 90 درجة مئوية وخجول وخجول & ndash100 & degC.
  2. التلدين. يتم تبريد خليط التفاعل بسرعة (عادة إلى 50 درجة مئوية و ndash65 و degC) ، مما يسمح للاثنين من البادئات بالربط مع تسلسلهما التكميلي على خيوط DNA النموذجية.
  3. توليف الحمض النووي (التمديد التمهيدي). يتم تسخين خليط التفاعل مرة أخرى ، هذه المرة إلى درجة حرارة (عادةً 60 درجة مئوية و ndash75 و degC) تسمح لبوليميراز الحمض النووي بتمديد البادئات عن طريق إضافة dNTPs التي تقترن مع القواعد في حبلا القالب.

يتضمن PCR النموذجي 20-40 دورة متكررة من هذه الخطوات الثلاث ، تحدث في جهاز التدوير الحراري. نظرًا لأن عدد جزيئات الحمض النووي يتضاعف في كل دورة ، يتم تضخيم الحمض النووي بشكل كبير.

حدود PCR

إذا أراد العالم تضخيم امتداد معين للجينوم ، فيجب على العالم أن يعرف على الأقل جزءًا من تسلسل الحمض النووي المستهدف لتصميم البادئات المناسبة. هناك مشكلة أخرى محتملة تتمثل في التلدين غير المحدد للبادئات لتسلسلات DNA المتشابهة جزئيًا ، مما يؤدي إلى تضخيم الحمض النووي غير المستهدف. يمكن التحكم في هذه المشكلة عن طريق تحسين ظروف التفاعل. نظرًا لكونه طريقة كشف شديدة الحساسية ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل معرض أيضًا للتلوث ، وحتى كميات ضئيلة من الحمض النووي الملوث يمكن أن يؤدي إلى نتائج مضللة. يمكن أن تكون بوليمرات الحمض النووي المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل عرضة للأخطاء. إذا حدثت طفرة خلال الدورات القليلة الأولى ، فإن معظم الحمض النووي المتضخم سيحمل الطفرة.

غاريبيان وليليت ونيدهي أفاشيا. & ldquo أصبحت تقنيات البحث بسيطة: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). & rdquo مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية 133 ، لا. 3 (مارس 2013): e6. [مصدر]

صل ، ليزلي أ. & ldquo ثورة التكنولوجيا الحيوية: تفاعل البوليميراز المتسلسل واستخدام النسخ العكسي لاستنساخ الجينات المعبر عنها. & rdquo تعليم الطبيعة 1 ، لا. 1 (2008): 94. [المصدر]


شاهد الفيديو: تفاعل البلمرة المتسلسل PCR (كانون الثاني 2023).