معلومة

قضايا التدفق الخلوي

قضايا التدفق الخلوي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أواجه مشاكل في تحليل البيانات هنا.

لدي بيانات قياس التدفق الخلوي التي يتم جمعها على Fortessa ، وعندما أقوم باستيرادها إلى FlowJo 8.7 ، تكون جميع قيم التألق الخاصة بي أقل بمقدار 10 مرات مما هي عليه في مقياس الخلايا. ليس لدي فكرة عما يحدث هنا ، أي شخص يمكنه المساعدة؟ إذا كنت تريد لقطات شاشة وصورًا للبيانات ، يسعدني نشرها.


لدي هذه المشكلة أيضًا مع البيانات من Partec PAS III. لا أعتبرها مشكلة ، لأنها في الحقيقة مجرد المحور السيني الذي يزيد بمقدار واحد. في النهاية ، جميع القيم التي تأتي من الجهاز هي قيم عشوائية ، طالما أن التغيير منهجي ، فلا توجد مشكلة.


الجواب الذي توصلت إليه هو الفرق بين ملفات FCS2.0 و FCS3.0. يختلف نمط binning ، وبالتالي خفضت ملفات FCS2.0 بشكل تعسفي قيم التدفق الخلوي مقارنة بما رأيته في برنامج FACS DiVa.

في النهاية ، كان التصدير باستخدام FCS3.0 هو السبيل للذهاب. إذا كان برنامجك يدعم هذا ، فإنني أوصي بشدة بالقيام بذلك!


قضايا قياس التدفق الخلوي - علم الأحياء

وصف المرفق
مرفق FACS
يقع مرفق التدفق الخلوي في طابق Nineth ، الجناح الشرقي لمبنى Hunter North. يمكن أن يوفر هذا المرفق تحليلات لما يصل إلى 7 معلمات في مجموعات الخلايا حقيقية النواة وفرز الخلايا في ظل ظروف معقمة. يمكن استخدام هذه التحليلات لتحديد وعزل مجموعات الخلايا النادرة ، وتحديد الصبغيات الصبغي في الخلايا الفردية ، ودراسة موت الخلايا المبرمج ، ودراسة إشارات الخلايا ، من بين تطبيقات أخرى.

يتوفر تدريب المستخدم لـ FACSCalibur (Becton-Dickinson Biosciences) والمساعدة في تشغيله ، عن طريق التعيين ، من خلال مدير المنشأة. يتم أيضًا توفير تدريب دوري للمستخدم على FACSCalibur من خلال الندوات المتخصصة.

يتم تشغيل FACSVantage (Becton-Dickinson Biosciences) فقط من قبل مدير المنشأة. المدير ومدير المشروع متاحان لمناقشة المشاريع وتقديم المشورة للمحققين بشأن التطبيقات ذات الصلة بمشروعهم.

الادوات

FACSCalibur Flow Cytometer

FACSCalibur هو محلل أعلى مقعد يتكون من الأرجون ، ليزر مبرد بالهواء ينبعث منه 488 نانومتر و 633 نانومتر ليزر ديود. يمكن أن يوفر تحليلات تصل إلى 6 معلمات وما يصل إلى 4 ألوان.

مقياس التدفق الخلوي FACSVantage

FACSVantage عبارة عن فارز يتكون من ليزر هيليوم نيون (HeNe) المبرد بالهواء الذي ينبعث منه 633 نانومتر و Enterprise II ، ليزر مبرد بالماء ينبعث منه 488 نانومتر والأشعة فوق البنفسجية (UV). يمكن أن يوفر تحليلات تصل إلى 7 معلمات وما يصل إلى 5 ألوان.

قواعد العمليات
القواعد و القوانين التنظيمية

1. حدد موعدًا لاستخدام الجهاز قبل أسبوع على الأقل.

2. يقتصر استخدام المعدات على ساعتين لكل مختبر في اليوم الواحد ما لم يُسمح بترتيبات خاصة. يجب على المستخدمين إخطار المنشأة بأي إلغاء قبل 6 ساعات على الأقل. بالنسبة لـ FACSVantage ، سيتم فرض رسوم الإعداد على الموعد الفائت.

3. وقّع على دفتر السجل الموجود بجوار جميع الأدوات.

4. بعد كل جلسة على FACSCalibur ، اتبع إجراءات تنظيف الجهاز.

5. سيكون الباحث الرئيسي في كل مختبر مسؤولاً عن العاملين في المختبر.

6. الإبلاغ عن أي مشاكل إلى المدير في أقرب وقت ممكن.

احتياطات السلامة
أمان

1. الليزر

أ. تم تجهيز FACSCaliubr بليزر الأرجون المبرد بالهواء الذي ينبعث منه عند 488 نانومتر ويصدر ليزر ديود عند 633 نانومتر. على الرغم من أن الليزر مغلق ، فقد يكون الضوء مرئيًا (بصعوبة) إذا كان الغطاء مفتوحًا. لا تنظر إلى ضوء الليزر. يمكن أن يضر عينيك.

ب. تم تجهيز FACSVantage بأجهزة ليزر Enterprise و HeNe مبردة بالماء ، والتي يمكن رؤيتها عند تشغيل الجهاز. لا يُسمح لأي شخص بدخول الغرفة دون حضور مدير المنشأة أثناء تشغيل الجهاز.


2. العينات: اعتمادًا على عينات المحقق ، يحتاج المرء إلى ارتداء ملابس واقية مناسبة (قفازات اللاتكس ، معاطف المختبر ، درع الوجه ، إلخ). يجب عدم إحضار أي مواد تتطلب BL2 إلى المرفق. يجب استخدام قفازات اللاتكس عند تغيير السوائل في FACSCalibur.


جداول الخدمة والنماذج المطلوبة
رسوم خدمة مرفق FACS

استخدام FACSCalibur: 10.00 دولارات للساعة

(الحد الأدنى للرسوم 10 دولارات لكل استخدام)

استخدام FACSVantage: 20.00 دولارًا للساعة + رسوم الإعداد 20.00 دولارًا (في اليوم) (1/2 ساعة كحد أدنى)


مشاكل قياس التدفق الخلوي مع تكتلات / تكتل الخلايا عند استخدام الخلايا التائية

أستخدم بشكل روتيني قياس التدفق الخلوي مع أنواع مختلفة من الخلايا ، لكنني استخدمت في الغالب الخلايا الملتصقة حتى وقت قريب. مع الخلايا الملتصقة ، لا بد لي من التعامل مع EDTA أو Trypsin-EDTA لفصل الخلايا قبل تلطيخها / إصلاحها على أي حال ، لذلك ينتهي بهم الأمر عادةً كتعليق خلية واحدة نظيفة إلى حد ما ، خاصةً إذا قمت بالمص بقوة أو مررت الخلايا عبر شبكة نايلون منقي. بعد أن بدأت مؤخرًا في استخدام الخلايا التي تنمو في التعليق ، مثل الخلايا التائية (CEM-ss و SupT1 و PBMCs) ، لاحظت أنها أكثر عرضة لتكوين الكتل ، مما يتداخل مع مقايستي.

من المهم للغاية معرفة أن لدي بالتأكيد تعليق خلية واحدة ، ولا توجد أزواج ، لأنني أبحث عن تكوين المخلوقات ، والتي تظهر على مقياس التدفق الخلوي مع ملف تعريف FSC / SSC مشابه جدًا لمضاعفات ، أي أنها كبيرة ( عالية FSC-A) ولديها أشكال غير عادية (عالية FSC-W) ودقة (عالية SSC) التي عادة ما يخرج معظم الناس من تحليلهم - أحتاج في الواقع للاحتفاظ بأحداث FSC / SSC غير العادية في تحليلي ، لكني بحاجة إلى استبعاد الثنائيات أو الثلاثة توائم ، لذلك لا يمكن أن يتم ذلك ببساطة عن طريق بوابات FSC / SSC. أحاول تحسين تحكمي السلبي (حيث لا توجد مخلوقات خلوية) حتى أحصل على إشارة نظيفة يمكنني من خلالها اكتشاف الخلايا المخلوية من خلال البحث عن خلايا ذات FSC / SSC عالية ، أو من خلال وجود مجموعتين من الخلايا ذات تصنيف مختلف. صبغات حشوية اللون وتبحث عن خلايا موجبة مزدوجة. من الواضح أن مجاميع الخلايا تتداخل مع هذين المقياسين ومن المهم حقًا أن أمتلك تحكمًا سلبيًا نظيفًا.

فقط لشرح الإجراء بسرعة ، أقوم بنقل الخلايا التائية (التي تنمو في RPMI 1640 بنسبة 10 ٪ FBS) إلى 5 مل من أنابيب FACS ذات القاعدة المستديرة. أنا أطردهم لمدة 5 دقائق عند 500 جم ، وصب المادة الطافية ، وأعد التعليق في 200 ul من RPMI الخالية من المصل المحتوية على DNase. بعد 10 دقائق @ RT (وبعض التحريض اللطيف) ، أضف 200 ul PBS / 8٪ PFA (4٪ نهائي) للإصلاح. بعد 10 دقائق ، أضف 1.5 مل PBS / 1٪ BSA ، جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1500 جم ، صب المادة الطافية ، وأعد التعليق في PBS قبل التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. (في بعض الحالات ، توجد بعض خطوات وضع العلامات على الأجسام المضادة بعد ذلك ، لكنني قررت أن الركام موجود فورًا بعد التثبيت أو حتى قبل ذلك ، لذلك لا أعتقد أن هذه الخطوات مناسبة).

إليك الأشياء التي & # x27ve جربتها ، وكيف تحولت:

Trypsin-EDTA: بعد أول عملية طرد مركزي ، قبل خطوة DNase ، تعاملت مع Trypsin-EDTA (الحل النموذجي الذي ستستخدمه لفصل الخلايا الملتصقة) ، يحدث شيء غريب حقًا: الخلايا على الفور (بالثواني) تتجمع في أحد الركام الضخم ، والذي يستحيل بعد ذلك تفريقه عن طريق سحب العينات بقوة. إذا قمت بعد ذلك بإلغاء التنشيط باستخدام RPMI / FBS ، وأجهزة الطرد المركزي ، واستمرت في علاج DNase ، فإن الكتلة لا تزال موجودة. لقد حاولت أيضًا إعادة تعليق الخلايا في وسائط الاستزراع الخالية من المصل قبل إضافة التربسين (حتى لا أقوم بإضافتها إلى حبيبات الخلية وبالتالي يتم تخفيفها 1: 1) ، لكنها لا تزال تتكتل. أنا بصراحة لا أفهم هذا على الإطلاق ولا أحد هنا لديه أي فكرة عن سبب حدوث ذلك لأنك تتوقع عادةً أن ينفصل التربسين ، وليس الخلايا المتكتلة. لقد وجدت حتى أوراقًا تشير إلى استخدام التربسين للتخلص من المضاعفات في نفس الاختبار الذي أقوم به بالضبط (أي البحث عن المخلوقات في الخلايا التائية) ، ولم يذكروا أي شيء عن التكتل ، أو أي خطوات أخرى قبل أو بعد التربسين الذي أقوم به & # x27m لا تفعل بالفعل.

فقط EDTA بدون التربسين: لقد مر وقت طويل منذ أن جربت هذا ، لكنني أعلم أنه لا يسبب هذا التكتل الشديد الذي أحصل عليه عندما أستخدم التربسين- EDTA. ومع ذلك ، فإن الزوجين موجودان في سيطرتي السلبية.

مرشح شبكة النايلون: بعد خطوة DNase ، وقبل إضافة المثبت ، حاولت أيضًا تمرير الخلايا عبر شبكة نايلون 50 ميكرون. في حين أن هذا قلل بالتأكيد من عدد المضاعفات / المجاميع التي تظهر على مقياس التدفق الخلوي (تحت سيطرتي مع عدم وجود خلوي) ، إلا أنها لا تزال موجودة. علاوة على ذلك ، نظرًا لأن syncytia التي أتوقع رؤيتها يمكن أن يكون قطرها 50 ميكرون أو أكثر بسهولة ، فأنا لا أريد استبعادها بواسطة المرشح أو أن يتم التخلص منها. يؤدي استخدام خطوة ترشيح ذات حجم محدد بشكل أساسي إلى تحيز تجربتي وأنا أفضل تجنبها (إلى جانب حقيقة أنها لا تتخلص تمامًا من الركام).

في هذه المرحلة تنفد من الأفكار. لقد طلبت للتو عينة من Accutase لتجربتها ، لكن أظن أنها ستعمل بشكل مشابه تمامًا للتريبسين لأنه في الحقيقة مجرد بروتياز (ما لم يكن لدى أي شخص خبرة في استخدامه لتفكيك تكتلات الخلايا التائية؟). أشك في أن المجاميع لا تتشكل بسبب روابط الخلايا الخلوية القائمة على البروتين (وهو ما يعتبر التربسين و EDTA جيدًا ضدهما) ، وليس بسبب الحمض النووي خارج الخلية (منذ أن ألغيت ذلك باستخدام DNase) ولكن بسبب السكريات على سطح الخلية (جليكانات). لست على علم بأي طرق روتينية لتحييد أو إزالة الجليكانات ، رغم ذلك.

TLDR: الخلايا التائية لزجة جدًا وهو أمر سيء بالنسبة للمقايسة القائمة على التدفق لاكتشاف الأشياء التي تبدو مثل المجاميع ولكنها ليست كذلك. يجعل التربسين الأمر أسوأ. يساعد.


MIFlowCyt-EV: إطار عمل للإبلاغ المعياري عن تجارب قياس التدفق الخلوي خارج الخلية

الحويصلات خارج الخلية (EVs) صغيرة وغير متجانسة ويصعب قياسها. يعد قياس التدفق الخلوي (FC) تقنية أساسية لقياس الجسيمات الفردية ، ولكن تطبيقه على تحليل المركبات الكهربائية والجسيمات الفرعية الأخرى قد طرح العديد من التحديات وأنتج عددًا من النتائج المثيرة للجدل ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى قيود اكتشاف الأجهزة ، الافتقار إلى الأساليب القوية والغموض في كيفية تفسير البيانات. تتفاقم هذه المضاعفات بسبب افتقار الحقل إلى إطار عمل قوي لإعداد التقارير ، وتتضمن العديد من مخطوطات EV-FC أوصافًا غير كاملة للطرق والنتائج ، وتحتوي على مصنوعات ناتجة عن حساسية غير كافية للأداة وتصميم تجريبي غير مناسب وتفتقر إلى المعايرة والتوحيد المناسبين. لمعالجة هذه القضايا ، عملت مجموعة عمل (WG) من باحثي EV-FC من ISEV و ISAC و ISTH معًا كمجموعة عمل EV-FC ووضعت إطارًا إجماعيًا للحد الأدنى من المعلومات التي يجب توفيرها بخصوص EV-FC. يتضمن هذا الإطار الحد الأدنى من المعلومات الحالية لدراسات إرشادات المركبات الكهربائية (MISEV) والحد الأدنى من المعلومات حول معيار تجربة FC (MIFlowCyt) في إطار عمل إعداد التقارير الخاص بـ EV-FC (MIFlowCyt-EV) الذي يدعم الإبلاغ عن المعلومات الهامة المتعلقة بتلطيخ العينة ، كشف وقياس المركبات الكهربائية والتصميم التجريبي في المخطوطات التي تُبلغ عن بيانات EV-FC. يوفر MIFlowCyt-EV هيكلًا لمشاركة نتائج EV-FC ، لكنه لا يصف بروتوكولات محددة ، حيث سيستمر التطور السريع للأدوات والطرق في المستقبل المنظور. تستوعب MIFlowCyt-EV هذا التطور ، مع توفير المعلومات اللازمة لتقييم ومقارنة الأساليب المختلفة. نظرًا لأن MIFlowCyt-EV سيضمن الاتساق في طريقة الإبلاغ عن دراسات EV-FC ، فإننا نتوقع بمرور الوقت أن اعتماد MIFlowCyt-EV كمعيار للإبلاغ عن دراسات EV-FC سيحسن القدرة على المقارنة الكمية للنتائج من المختبرات المختلفة و دعم تطوير أدوات ومقايسات جديدة لتحسين قياس المركبات الكهربائية.

الكلمات الدالة: حويصلات خارج الخلية إطار قياس التدفق الخلوي للإبلاغ عن التقييس.

© 2020 المؤلف (ق). تم النشر بواسطة Informa UK Limited ، والتي تعمل تحت اسم مجموعة Taylor & Francis نيابة عن الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية.

الأرقام

نظرة عامة على MIFlowCyt EV ...

نظرة عامة على إطار عمل تقارير MIFlowCyt EV. يُظهر العمود الأيمن كل فئة ...

نظرة عامة على MIFlowCyt EV ...

نظرة عامة على إطار عمل تقارير MIFlowCyt EV. يظهر العمود الأيمن كل فئة ...

ملخص لاستطلاع رأي حول ماهية قياس التدفق الخلوي للحويصلات خارج الخلية (FCM) الذي يعمل ...

ملخص لاستطلاع رأي حول ماهية قياس التدفق الخلوي للحويصلات خارج الخلية (FCM) الذي يعمل ...

(أ) مثال على الرسم البياني للإبلاغ ...

(أ) مخطط مثال للإبلاغ عن بيانات التخفيف التسلسلي ، مع عدد الأحداث في الثانية ...

(أ) مثال على الرسم البياني للإبلاغ ...

(أ) مخطط مثال للإبلاغ عن بيانات التخفيف التسلسلي ، مع عدد الأحداث في الثانية ...


أفضل الممارسات لقياس التدفق الخلوي متعدد المعايير

قياس التدفق الخلوي هو تقنية كمية أنيقة تسمح باستجواب الخلايا المفردة بين عشرات الآلاف أو حتى ملايين الخلايا في دقائق. تشمل مزايا قياس التدفق الخلوي متعدد العوامل القدرة على فحص الخلايا المفردة بعلامات وظيفية متعددة ، لربط مستويات تعبير البروتين باستخدام أجسام مضادة متعددة ، وفي النهاية تحديد مجموعات الخلايا بدقة أكبر. ومع ذلك ، فإن زيادة عدد الأهداف وفلوروفورز يزيد أيضًا من تعقيد التجربة ويتطلب مزيدًا من الاهتمام بتحسين الكاشف وتصميم اللوحة وعناصر التحكم وتفاصيل الإعداد الأخرى. نحن هنا نصف بعض أفضل الممارسات لتصميم تجربة قياس التدفق الخلوي متعدد العوامل. على الرغم من أنها ليست شاملة ، إلا أنها تشتمل على بعض أهم ميزات الإعداد التجريبي الجيد وتصميم اللوحة [1،2].

مشي الجهد للحصول على بيانات عالية الجودة

يوفر مصنعو أجهزة قياس الخلايا اختبار أداء يشهد أن الجهاز يعمل على النحو الأمثل فيما يتعلق بمجموعة محددة من المواصفات. يأخذ تحسين الكاشف هذه العملية خطوة إلى الأمام ، مما يتيح الحصول على بيانات عالية الجودة في كل قناة قياس التدفق الخلوي. لكل كاشف ، يجب أن يوفر الجهد (أو الكسب) المختار أفضل فصل بين الإشارات الإيجابية والسلبية ويضمن أن تكون جميع القياسات ضمن النطاق الخطي للكاشف. عادة ، طريقة سير الجهد (شكل 1) لتحديد الحد الأدنى من متطلبات الجهد (MVR) الذي يسمح باستبانة واضحة لإشارات الفلورسنت الخافتة من ضوضاء الخلفية للأداة. في هذه الطريقة ، يتم تشغيل خرز الفلورسنت الخافت باستخدام سلسلة من إعدادات الجهد المتزايدة ، ويتم رسم انتشار الإشارة (أو معامل الاختلاف ، CV) مقابل الفولتية. يمكن أن يؤدي تقليل الجهد الكهربي للكاشف إلى ما دون MVR إلى فقدان دقة التجمعات الخافتة ، وزيادة الجهد فوق MVR لا يعطي أي ميزة لتحليل السكان. نظرًا لأن هذه الطريقة لا تضمن أن الإشارات الأكثر سطوعًا لا تتجاوز الحد الأعلى لنطاق الكاشف ، فقد تم تطوير طرق بديلة يتم فيها استخدام خرز أو خلايا غير ملطخة أو ملطخة بألوان زاهية لتحديد MVR [3،4].

الشكل 1. تحديد الإعداد الأمثل للجهد لكاشف مقياس التدفق الخلوي باستخدام مشي الجهد. تستخدم طريقة سير الجهد الموضحة حبة فلورية واحدة مصبوغة بشكل خافت. يتم الحصول على البيانات عند كل زيادة في ضبط الجهد في كاشف معين ، ويتم تصدير معامل التباين القوي (٪ rCV) والانحراف المعياري القوي (rSD) وتخطيطهما مقابل الجهد لتصور نقطة الانعطاف. يجب استخدام أدنى جهد على منحنى٪ rCV قبل الزيادة في rSD للكاشف. في هذا المثال ، تم تحديد MVR ليكون 300 مللي فولت (السهم).

معايرة الجسم المضاد في تصميم اللوحة

تعد معايرة الجسم المضاد أيضًا تقنية تحسين مهمة لقياس التدفق الخلوي متعدد العوامل وهي أفضل طريقة لتقليل الارتباط غير المحدد وزيادة اكتشاف الإشارة. يمكن استخدامه أيضًا لتقليل الانتشار غير المباشر ، والذي يحدث عندما يتم التقاط إشارة من الأصباغ التي تنبعث من الفلورة على نطاق واسع من الأطوال الموجية في أجهزة كشف متعددة ، مما يعقد تفسير البيانات. لإجراء معايرة بسيطة للجسم المضاد ، ابدأ بالتركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة ، وقم بإجراء تخفيفات متسلسلة ثنائية الشقين ، وقم برسم مؤشر البقعة (SI) ، وهو مقياس للسطوع النسبي لجسم مضاد مترافق مع فلوروفور [5]. سيساعد SI لجسم مضاد محدد - اتحاد الصبغة وانتشاره غير المباشر في تحديد ما إذا كان تركيز الفصل (حيث تظهر الخلايا السالبة والموجبة أكبر فرق في التألق) ، أو تركيز التشبع (الذي يشبع فيه الجسم المضاد مولد الضد المتاح في الخلايا) من الجسم المضاد (الشكل 2). يوفر تركيز الفصل فصلًا جيدًا للخلايا المصنفة مقابل الخلايا غير المصنفة (على سبيل المثال ، عند تحديد السكان الموجودين في المائة في تجارب التنميط المناعي) ، ويقلل من خطأ الانتشار ، ويحافظ على الجسم المضاد. يمكن أن تؤدي تركيزات الأجسام المضادة المشبعة - المطلوبة أحيانًا للكشف عن المستضدات منخفضة الوفرة - إلى زيادة انتشار الامتداد وصعوبة اكتشاف الإشارات الخافتة في أجهزة الكشف الأخرى.

الشكل 2. مثال معايرة الأجسام المضادة.(أ) تم تحضين الخلايا باستخدام التخفيفات التسلسلية لجسم مضاد لـ CD8 مترافق مع الماوس APC ، وتشغيلها على مقياس التدفق الخلوي Invitrogen Attune NxT ، وتحليلها باستخدام برنامج FlowJo. يتم عرض البيانات على رسم بياني واحد لتسهيل المقارنة. لاحظ أن العينة الموضحة في المربع 1 هي تركيز تشبع الجسم المضاد ، بينما عينة المربع 2 هي تركيز الفصل. (ب) تم حساب مؤشر البقعة (SI) للبيانات الموجودة في (A) باستخدام المعادلة: (المتوسط ​​(الخلايا الإيجابية) - المتوسط ​​(الخلايا السالبة)) / (2 × SD (الخلايا السالبة)) ، وتم رسمها كدالة لـ تخفيف الجسم المضاد.

اختيار وتخصيص الفلوروفور

يتمثل أحد أكبر التحديات في قياس التدفق الخلوي متعدد العوامل في اختيار مجموعات الفلوروفورات وتقارن الأجسام المضادة التي تقلل من الحاجة إلى التعويض والتعديلات غير المباشرة دون المساس بجودة البيانات. كلما زاد عدد الأصباغ المضمنة في لوحة قياس التدفق الخلوي ، زادت احتمالية أن يؤدي الانتشار غير المباشر إلى تقليل القدرة على تمييز الإشارة المحددة لأحد حاملي الفلور في وجود الآخرين. عند اختيار ملصقات الفلورسنت:

  • استخدم الفلوروفور الساطع مع الأجسام المضادة للأهداف منخفضة الوفرة والفلوروفور الخافت مع الأجسام المضادة لمستضدات عالية التعبير
  • تقليل التداخل الطيفي للفلور لتقليل التداخل
  • استخدم الفلوروفورات المميزة طيفيًا لاكتشاف العلامات المتزامنة
  • استخدم الفلوروفورات المتشابهة طيفياً لمجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا التي سيتم إغلاقها بشكل منفصل

الشكل 3 يُظهر طريقة لتصور خطأ الانتشار غير المباشر بسبب التداخل الطيفي. على الرغم من أنه شائع الاستخدام ، فإن الفلوروفور الترادفي PE-Cy®7 يُظهر انتشارًا كبيرًا بسبب الفوتونات منخفضة الطاقة (الطول الموجي الطويل) ، والتي بدورها تؤثر سلبًا على دقة ملصقات الفلورسنت في القنوات الأخرى ، خاصة تلك المرتبطة بمستضدات معبرة بشكل سيئ. يعد استخدام مصفوفة الانتشار غير المباشرة طريقة أخرى لتصور الانتشار في جميع أجهزة الكشف الأخرى لحامل فلور معين [6].

الشكل 3. نشر تصور الخطأ. تم تشغيل العينات أحادية اللون على مقياس التدفق الخلوي Invitrogen Attune NxT وتحليلها باستخدام برنامج FlowJo. تم دمج البيانات من كل كاشف في قطعة واحدة. (أ) يظهر تلطيخ مع اتحاد الأجسام المضادة FITC قويًا عند تحليله في كاشف FITC ، لوحظ الحد الأدنى من خطأ الانتشار في القنوات الأخرى. (ب) يساهم التلوين باستخدام PerCP-Cy®5.5 في حدوث خطأ انتشار كبير في قنوات PE و BV711. (ج) يساهم التلوين باستخدام BD Horizon Brilliant Violet 711 (BV711) في انتشار ملحوظ في قنوات PerCP-Cy®5.5 و APC و PE. (د) يوضح التلوين باستخدام PE-Cy®7 خطأ انتشار واسع النطاق في قنوات متعددة. * أصباغ BD Horizon Brilliant Violet (بكتون وديكنسون وشركاه).

الضوابط والضوابط والضوابط

تعتبر عناصر التحكم - على سبيل المثال ، ضوابط الفلورة مطروحًا منها (FMO) ، وضوابط التعويض ، وضوابط الجدوى - ضرورية لتقييم بيانات قياس التدفق الخلوي متعدد العوامل. ضوابط FMO مطلوبة لضبط البوابات عند استخدام العديد من الفلوروفورات معًا وعندما يتم التعبير عن العلامات في سلسلة متصلة. إنها تساعد في حساب الإشارة المقدمة من جميع ملصقات الفلورسنت الأخرى في القناة التي يتم فتحها. يمكن أن توفر عناصر تحكم FMO ، التي تحتوي على جميع الواسمات باستثناء تلك ذات الأهمية ، الوضوح للمجموعات منخفضة الكثافة أو الملطخة ويمكن أن تساعد في تحديد مجموعتين لم يتم حلهما بسهولة. مطلوب أيضًا في كل لوحة قياس تدفق خلوي متعدد العوامل هو التحكم في الجدوى ، وهو مسبار فلوري يحدد الخلايا الميتة على وجه التحديد بحيث يمكن استبعادها بشكل صحيح من تحليل البيانات [7]. الخلايا الميتة لزجة ويمكن أن تربط الأجسام المضادة والتحقيقات الأخرى بشكل غير محدد ، مما يعقد التحليل (الشكل 4).

الشكل 4. آثار بوابة الجدوى على إحصاءات السكان. يمكن أن يؤثر إدراج صبغة الجدوى أو استبعادها بشكل كبير على إحصاءات السكان التي تم الحصول عليها من التجربة ، ويمكن أن يكون التمييز بين الخلايا الحية والميتة باستخدام معلمات التشتت فقط أمرًا شخصيًا وغير دقيق [7]. في هذا المثال من Perfetto et al. [7] ، بعد تطبيق بوابة الخلايا الليمفاوية (مبعثر أمامي مقابل مبعثر جانبي) ، تم التمييز بين الخلايا الحية والميتة باستخدام Invitrogen LIVE / DEAD Fixable Violet Dead Cell ، لاحظ العدد الكبير من الخلايا الميتة على الرغم من بوابة مبعثرة. يُظهر التحليل اللاحق للخلايا الحية والخلايا الميتة الاختلاف الكبير في الأنماط الظاهرية بين مجموعتي الخلايا. أعيد طبعه من Perfetto SP ، Chattopadhyay PK ، Lamoreaux L Nguyen R ، Ambrozak D ، Koup RA ، Roederer M (2006) طرق J Immunol 313: 199 - 208 بإذن من إلسفير.

مبادئ توجيهية لقياس التدفق الخلوي

اتبع أفضل الممارسات التالية لقياس التدفق الخلوي متعدد العوامل:

  • تحسين إعدادات الجهد لكل كاشف مقياس التدفق الخلوي
  • عاير كل جسم مضاد لتحقيق الأداء الأمثل في اللوحة
  • ضع في اعتبارك بعناية إقران الأصباغ بالأهداف وتقليل انتشار الانتشار
  • استخدم FMO وضوابط الجدوى لضبط البوابات بشكل صحيح

تصميم اللوحة هو عملية تكرارية تتطلب اختبار جميع التوليفات ومراجعة مصفوفة الانتشار غير المباشر في كل تكرار. تتوفر الموارد - مثل الندوات عبر الإنترنت ودورات التعلم الإلكتروني ومعلومات الأداة ومكتبة ملاحظات وبروتوكولات التطبيق - في مركز التعلم Flow Cytometry. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير منشئ لوحة قياس التدفق الخلوي Invitrogen Flow Cytometry Panel Builder (الشكل 5) ، والذي يوجهك خلال تصميم لوحة التدفق الخلوي ، مما يوفر تجربة مبسطة وقابلة للتخصيص لتناسب احتياجاتك.

الشكل 5. منشئ لوحة قياس التدفق الخلوي - أداة لجميع خبراء قياس التدفق الخلوي. سواء كنت مبتدئًا أو خبيرًا ، فإن تصميم لوحة لقياس التدفق الخلوي هي عملية معقدة للغاية. إذا كنت مبتدئًا ، فدع Invitrogen Flow Cytometry Panel Builder يقلل من قلقك بشأن بناء اللوحة من خلال جعل الاقتران بين العلامات والفلوروفور سريعًا وبسيطًا باستخدام تنسيق مرئي للغاية. هل انت خبير؟ ثم ستقدر استخدام Flow Cytometry Panel Builder لمراجعة الإشارات الطيفية والمرشحات بسهولة لكل خط ليزر والتحقق من قيم انتشار الفلوروفور لكل قناة. من خلال الوصول إلى معلومات حول أكثر من 13000 جسم مضاد لقياس التدفق الخلوي ، تتيح هذه الأداة الاختيار السريع للأجسام المضادة لألواح قياس التدفق الخلوي.


اعتبارات العينة الرئيسية لتلطيخ قياس التدفق الخلوي

شكل 1. استخدام علامات النسب للمساعدة في تحديد مجموعة نادرة من السكان.
أ) تلطيخ أسلاف المكونة للدم باستخدام كوكتيل نسب الفأر BioLegend (CD3 ، GR1 ، CD11b ، B220 ، Ter119) والأجسام المضادة CD34 المضادة للفأر في نخاع عظم الفأر ب) بوابات خلايا DC البشرية باستخدام كوكتيل النسب البشري BioLegend (CD3 ، CD14 ، CD19 ، CD20 ، CD56) والأجسام المضادة HLA-DR المضادة للإنسان.


حاول استخدام الرسوم البيانية ثنائية المتغير (الرسم النقطي أو الرسم البياني pseudocolor) بدلاً من المدرج التكراري عند تحديد المجموعات السكانية التي تعبر عن العلامات الموجودة في أنواع الخلايا الأخرى. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 2 الفرق بين استراتيجية البوابات للخلايا المتغصنة بالماوس باستخدام علامة شجرية واحدة CD11c على الرسم البياني أو اثنتين من علامات الخلايا المتفرعة ، CD11c و MHC Class II ، على مخطط pseudocolor. استنادًا إلى المؤامرة ثنائية المتغير ، فإن النسبة المئوية لمراكز DC الحقيقية (CD11 int MHCII +) هي 1.2٪ وليست 4.5٪ DC كما هو موضح في الرسم البياني. الفرق في النسبة المئوية بين مؤامرة pseudocolor والمدرج التكراري هو نتيجة لبوابة غير دقيقة للقيم المتطرفة (CD11c int MHCII +/-) في الرسم البياني. لمعرفة المزيد حول الخيارات المختلفة لتخطيط البيانات ، اقرأ مدونتنا تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي 1: ما يمكن أن تخبرك به المؤامرات المختلفة.

الشكل 2. بوابات الخلايا التغصنية باستخدام الرسم البياني والمؤامرات ثنائية المتغير

  • تعبر الخلايا النخاعية (الخلايا الوحيدة ، الضامة ، الخلايا المتغصنة والخلايا الحبيبية) عن مستقبلات Fcγ التي يمكن أن ترتبط بمنطقة Fc من الأجسام المضادة مما يؤدي إلى تلطيخ غير محدد. لتقليل هذا التلوين غير المحدد ، قم بتضمين مانع FcR في تلطيخك عند العمل مع العينات المخصبة في الخلايا النخاعية (مثل نخاع العظام أو الدم أو الطحال أو ثقافات التمايز في المختبر للخلايا النخاعية).
  • يمكن لبعض الأصباغ الترادفية ، بما في ذلك PE / Dazzle ™ 594 و APC / Fire ™ 750 و PE / Cy7 و PE / Cy5 و PerCP / Cy5.5 وخاصة APC / Cy7 ، الارتباط بشكل غير محدد بالخلايا الأحادية والضامة بشكل مستقل عن مستقبلات Fc. يمكن أن يساعد استخدام True-Stain Monocyte Blocker ™ في تلطيخ قياس التدفق الخلوي في تقليل الارتباط غير المحدد. تعلم المزيد مع الملصق العلمي لدينا.

الشكل 3. لوحظ تألق ذاتي لمجموعات الكريات البيض في قناة FITC. على اليسار ، استراتيجية البوابات لمجموعات فرعية من كريات الدم البيضاء في الدم المحيطي غير المصبوغة على أساس الانتثار الأمامي والجانبي. على اليمين ، تراكب الرسم البياني للتألق الذاتي بين الخلايا الليمفاوية (أحمر) ، وحيدات (أخضر) ، العدلات (الأزرق) ، والحمضات (الأرجواني).


مناقشة

قياس أحداث CFSE + كاستراتيجية لتقييم نقاء العينة

لا يزال عدم وجود توافق في الآراء بشأن طرق تنقية المركبات الكهربائية يمثل تحديًا ، خاصةً عندما تكون قابلية التكاثر بين طرائق العزل المختلفة مرغوبة. هذا يحد من استخدام المركبات الكهربائية في التطبيقات السريرية ويزداد تعقيدًا بسبب عدم كفاية الوسائل لقياس نقاء العينة ، لا سيما في العينات البيولوجية المعقدة التي تحتوي على خليط من الجسيمات الحويصلية وغير الحويصلية ، مثل البلازما. تم اقتراح استراتيجيات متعددة ، مثل قياس البروتين: نسبة الجسيمات (Webber and Clayton ، 2013 Maiolo et al. ، 2015) والألبومين (Baranyai et al. ، 2015 Veremeyko et al. ، 2018) ، كمعلمات لمراقبة الجودة لـ تحضير المركبات الكهربائية ، خاصة عند استخدام طرق عزل منخفضة الجودة (Th & # x00E9ry et al. ، 2019). ومع ذلك ، نظرًا لفشلها في توفير المعلومات السكانية ، لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه المقاييس يمكن أن تعكس بدقة نقاء استعدادات المركبات الكهربائية.

تم استخدام CFSE حتى الآن بشكل متكرر كإستراتيجية لتصنيف المركبات الكهربائية لتطبيقات FC (Pospichalova et al.، 2015 Morales-Kastresana et al.، 2017 Mastoridis et al.، 2018 Morales-Kastresana et al.، 2019). تم بالفعل تناول مدى ملاءمة الأصباغ المختلفة لتلطيخ وتحديد المركبات الكهربائية بكفاءة من قبل مجموعة Jennifer Jones (Morales-Kastresana et al. ، 2017). في عمل نُشر في عام 2017 ، اختبرت مجموعة Jones & # x2019 العديد من الأصباغ ، بما في ذلك CFSE و PHK26. بينما ثبت أن PKH26 ينتج 100 & # x2013400 نانومتر أو مجاميع في وجود المركبات الكهربائية أو بمفرده في المحلول ، لم يشكل CFSE وحده مثل هذه المجاميع. وبالتالي ، مع أخذ ذلك في الاعتبار ، تم تصنيف المركبات الكهربائية في عملنا بـ CFSE. تدعم البيانات المقدمة هنا التوسيم الحويصلي باستخدام CFSE كوسيلة لتحديد مراقبة الجودة لبروتوكولات تنقية المركبات الكهربائية. كما هو موضح ، كانت غالبية الجسيمات الموجودة في العينات التي تم تنقيتها بطرق عالية الخصوصية هي CFSE +. أدى استخدام ExoQuick & # x00AE أو الطرد المركزي الفائق لإثراء المركبات الكهربائية قبل SEC إلى تقليل نسبة جسيمات CFSE & # x2013. بالإضافة إلى ذلك ، أدى تحلل المركبات الكهربائية باستخدام المنظف NP-40 إلى تقليل 90٪ من أحداث CFSE +. تدعم هذه النتائج معًا فائدة CFSE كأداة لتحديد الجزيئات الحويصلية في السوائل الحيوية ، وبالتالي ملاءمة إستراتيجية FC الخاصة بنا لمراقبة الجودة والمقارنة الكمية لعزلات المركبات الكهربائية التي تم إعدادها بواسطة بروتوكولات مختلفة.

تم استخدام نفس النهج للتحقق من استنفاد المركبات الكهربائية من FBS المستخدم في منطقتنا في المختبر دراسات. تشير التقارير السابقة إلى أن آثار المركبات الكهربائية البقرية قد تستمر في طاف FBS بعد خطوات النضوب (Shelke et al. ، 2014) ، والتي يمكن أن تتداخل في تحليل المركبات الكهربائية من الوسط المكيف. ومع ذلك ، أظهرت المقارنة بين الوسط الخالي من المصل والمتوسط ​​المحتوي على 10٪ من FBS المستنفدة للمركبات الكهربائية نسبة منخفضة بشكل متساوٍ من أحداث CFSE +. يشير هذا إلى أن المركبات الكهربائية المتبقية المشتقة من FBS لم تكن عالية بما يكفي للتأثير على تحليلنا. ومع ذلك ، فإن الدراسات المستقبلية التي تستخدم استراتيجيتنا لتحليل المركبات الكهربائية في الوسط المكيف ستحتاج إلى مراعاة أحداث الخلفية على أساس كل حالة على حدة ، خاصة عند استخدام أرقام الخلايا المنخفضة و / أو وقت التكييف القصير و / أو الخلايا التي تنتج مستويات منخفضة من المركبات الكهربائية.

تشير النتائج التي قدمها آخرون إلى أن تلطيخ CFSE لا يمكنه تسمية 100٪ من المركبات الكهربائية (van der Vlist et al. ، 2012 Pospichalova et al. ، 2015 de Rond et al. ، 2018). وبالتالي ، فقد استنتجنا أن بعض أحداث CFSE & # x2013 التي لوحظت في تجاربنا يمكن أن تتوافق مع EVs غير الملطخة. ومع ذلك ، على عكس النتائج المقدمة هنا ، في هذه الدراسات السابقة ، تم إجراء تلطيخ CFSE في الخلايا من قبل (van der Vlist et al. ، 2012) أو أثناء التكييف المتوسط ​​(Pospichalova et al. ، 2015) ، وكانت تركيزات CFSE 1.6 & # x201316 مرات أقل (van der Vlist et al. ، 2012 Pospichalova et al. ، 2015 de Rond et al. ، 2018) من تلك التي استخدمناها. بالإضافة إلى ذلك ، فقط & # x223C15٪ من الأحداث في العينات التي تمت تنقيتها عن طريق التنبيذ الفائق التفاضلي المقترن بوسادة السكروز (UC-I) كانت CFSE- ، وتسبب علاج المركبات الكهربائية باستخدام المنظف NP-40 في تقليل 90٪ من أحداث CFSE + ، مما يشير إلى أن هذه الصبغة تصنف غالبية المركبات الكهربائية في إعداداتنا التجريبية. في حين أن هذا قد لا يزال يشير إلى أن CFSE غير قادر على تلطيخ جميع المركبات الكهربائية الموجودة في العينة ، إلا أنه لا يزال من غير الواضح إلى أي مدى قد توفر حتى طرق العزل عالية النقاء مستحضرات نقية بنسبة 100 ٪ من المركبات الكهربائية. على الرغم من أنه غير مرغوب فيه ، قد يكون تراكم البروتين موجودًا في مستحضرات الجسم المضاد. ويرجع ذلك أساسًا إلى ظروف المحلول ، مثل القوة الأيونية ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، والضغط والسواغات (مانينغ وآخرون ، 1995) ، والخصائص الجوهرية للأجسام المضادة ، مثل التسلسل الأولي ، والبنية الثالثة ، والكره للماء غير المتماثل وتوزيع الشحنة (ليو وآخرون ، 2005 روبرتس ، 2007 نيشي وآخرون ، 2010). لذلك ، تم اختبار المساهمة المحتملة لمجموعات الأجسام المضادة غير المنضمة في أحداث CFSE & # x2013 الأجسام المضادة +. معظم أحداث CFSE & # x2013 CD9 + لم & # x2019t تتوافق مع الأجسام المضادة غير المقيدة ، وتم تقليلها عن طريق تنقية المركبات الكهربائية (الشكل التكميلي S5). تشير هذه النتائج إلى أن أحداث CFSE & # x2013 التي لوحظت في تحليل التعداد السكاني CD9 + تتوافق مع جزيئات غير حويصلية ذات تركيبة جزيئية محددة ذات حجم مماثل مقارنة بالمركبات الكهربائية. ستكون الدراسات المستقبلية ، بما في ذلك تحليل التركيب والتشكيل المفصل ، ضرورية لتعريف هذه الجسيمات غير الحويصلية CFSE & # x2013.

مقارنة بين طرق تنقية المركبات الكهربائية بواسطة FC

In spite of being considered a high-recovery and low-specificity method (Théry et al., 2019), isolation based on precipitation polymers such as ExoQuick ® resulted in a high proportion of CFSE + EVs. This agrees with studies suggesting that EVs prepared by ultracentrifugation or precipitation polymers are comparable (Helwa et al., 2017 Prendergast et al., 2018). In samples prepared by ExoQuick ® , however, we found that the proportion of CD9 + CFSE + events was reduced when compared to NP and other isolation methods. This suggests that, despite providing a high yield of EVs, ExoQuick ® may insert EV population bias. Also of concern, precipitating agents have previously been linked to potential loss of biological activity (Paolini et al., 2016) and structure (Gamez-Valero et al., 2016) of EVs. Thus, our data adds yet another parameter that should be carefully considered before selecting ExoQuick ® as a method of choice for the isolation of EVs.

SEC is the technique of choice for many groups interested in studying the composition and biological activity of vesicles, as it allows simple, fast and affordable isolation of EVs. As SEC is a key component of our FC strategy, the proportion of CFSE + particles in our preparations was measured to access the isolation efficacy of EVs by SEC. In our experimental settings, this preparation is referred to as NP (non-purified), since SEC is used after staining, and not before as a traditional isolation method. Although considered a low recovery, high specificity method (Théry et al., 2019), conditioned medium processed by SEC contained less than 40% of CFSE + vesicular particles. This was also the case for more complex samples, such as plasma and vitreous humor, in which the percentage of CFSE + particles after SEC processing were, respectively, �% and �%. These findings agree with recent studies using comparative transmission electron microscopy, in which SEC-derived preparations displayed a lower proportion of structures resembling EVs when compared to samples derived from differential ultracentrifugation (Takov et al., 2019).

Differential ultracentrifugation is one of the most commonly used EV purification methods. To improve EV purity, most researchers combine ultracentrifugation with additional techniques following the primary step, such as the use of washing steps with saline as well as the use of density gradients (Thery et al., 2018). We found that the proportion of CFSE + events and CD9 + events within the CFSE + gate did not differ in the absence (UC-III) or presence (UC-II and UC-IV) of washing steps with PBS or when a sucrose cushion step was used (UC-I). Our results suggest that these additional steps have no major impact in sample purity. However, a more detailed characterization of the potential impact of these washing and/or separation steps in the selection of populations of EVs with specific composition (protein, sugar, lipid, and nucleic acids) will be necessary in future studies.

Our FC strategy allows for faster processing times and also substantially decreases the sample volume requirements compared to conventional EVs isolation protocols (Table 1). Thus, we consider ours to be a consistent approach to be applied to control the quality of preparations of EVs.

While we used CFSE as a general EV marker, our experimental setup was performed having CD9 not only as an illustration of the capabilities of the method, but also as an analyte of interest. Our side-by-side comparison of CFSE + CD9 + events in samples submitted (UC-I) or not (NP) to isolation by ultracentrifugation showed that both strategies are comparable when analyzing CD9 + EVs populations (Figures 4C,D). However, although this equivalence was true for CD9 + EVs, we cannot discard the possibility that other populations of EVs behave differently, specially while probably there is no validated universal EV marker that can be used as an experimental control. Every method, including differential ultracentrifugation, potentially inserts population isolation bias to EVs (as illustrated in Figure 3C). Such isolation bias, if existent, has yet to be studied and understood. Be it for future studies in the field of population of EVs, or be it for studies involving other vesicular molecules, we believe and strongly suggest that side-by-side validation of non-purified versus purified samples (as in Figures 4C,D) should be performed as a pre-validation of our approach. Thus, for every EV molecule of interest, the approach presented in our work that relies on the use of NP samples in different contexts should first be validated by a comparison study similar to the one presented in Figures 4C,D.

Longitudinal Study of EVs in Plasma by FC

Longitudinal composition analyses can provide precious temporal information on the dynamics of EVs in physiological and pathological settings (Eitan et al., 2017 Menon et al., 2018 Wu et al., 2018). However, these studies are often difficult in microvolumes of samples, mainly due to the limited number of EVs that can be harvested in these experimental conditions (Théry et al., 2019). This constraint frequently leads to insufficient recovery of EVs (Clayton et al., 2018), unless small volume samples are pooled from multiple individuals or collections. Moreover, in studies involving small animals, the requirement for lethal bleeding in order to collect enough plasma for the effective isolation of EVs complicates the performance of longitudinal studies and increases the demand for animals, leading to higher costs, higher sample processing complexity and potential bioethical issues. By not requiring isolation of EVs prior to staining, our FC strategy allows for the analysis of both intra- and inter-individual heterogeneity in the population of interest throughout an experiment. In our studies, the proportion of CFSE + EVs and of CD9 + events within CFSE + EVs increased in the plasma of mice bearing liver metastatic pancreatic cancer lesions. Based on these results, we are currently studying the potential use of these readouts for follow-up studies of pancreatic cancer patients in the metastatic phase.

Study of EVs in Vitreous Humor by FC

The vitreous humor is a small-volume biofluid that contains low protein content, ranging from 120 to 500 ng/μL (Chowdhury et al., 2010), which is frequently considered to arise from filtration of plasma through fenestrated capillaries of the ciliary body stroma via the iris root (Freddo et al., 1990). Besides the quantitative differences in protein content, a comparison of vitreous humor and plasma proteome revealed that only 58% of the vitreous humor proteins have also been identified in human plasma (Chowdhury et al., 2010). Consistent with this, our analysis revealed that vitreous fluid contains three times more CFSE + vesicular structures when compared to plasma. Furthermore, it contained insignificant levels of CD9 + events, comparable to those found in control solutions with only CFSE and anti-CD9. These results are consistent with the previously reported absence of CD9 in EVs from vitreous humor (Murthy et al., 2014 Skeie et al., 2015 Zhao et al., 2018). However, it is still unknown whether the absence of CD9 + vesicles is a result of the filtration that occurs during the production of vitreous humor, uptake and degradation of this vesicle population by ocular cells, higher prevalence of non-endosomal EVs and/or other mechanisms. Although it is unclear to which extend ocular cells contribute to the collection of EVs found in vitreous humor, our FC strategy can be potentially used to study these vesicles both in pre-clinical and clinical settings as potential biomarkers and biological mediators of eye diseases.


ملاحظات ختامية

In conclusion, as you continue to optimize your flow cytometry experiments, take some time to focus on the blocking of the cells to minimize FcR mediated binding. This can be done with inexpensive human IgG serum quite easily. You can add the blocking reagent, incubate the cells for some period of time before adding the labeling reagents, and don’t have to do an extra wash, just some recalculating of the volumes.

More importantly, if you encounter some unusual staining patterns, the cause may be worth exploring. It could be the cells binding the fluorochrome, or it could be an antibody binding a fluorochrome- as shown in the PD-L1 example. Fortunately, there is a simple workaround to this, and that’s to add a second blocking reagent to minimize this effect.

It is important in the optimization phase to be extremely critical of any issues or differences you see, as you don’t want to carry something through to your production panel that could have been addressed in the optimization. Blocking is a necessary step, but often overlooked and based on lab tradition. Armed with this new knowledge, go forth and block better.

To learn more about important control measures for your flow cytometry lab, and to get access to all of our advanced materials including 20 training videos, presentations, workbooks, and private group membership, get on the Flow Cytometry Mastery Class wait list.

Tim Bushnell holds a PhD in Biology from the Rensselaer Polytechnic Institute. He is a co-founder of—and didactic mind behind—ExCyte, the world’s leading flow cytometry training company, which organization boasts a veritable library of in-the-lab resources on sequencing, microscopy, and related topics in the life sciences.


1 المقدمة

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the accumulation of malignant B cells. The disease generally affects elderly people and shows an indolent clinical course. 1 Despite encouraging therapeutic advances, CLL still is considered an incurable disease. 2 A number of prognostic markers such as IGHV mutational status, expression of ZAP-70, CD38, and β2-microglobulin as well as certain cytogenetic abnormalities (e.g., del17p) have been described. 3 More recent studies have presented a new prognostic score (CLL-IPI) and novel genetic markers (e.g., NOTCH1 and TP53 mutations). 4 ، 5

While immunochemotherapy has been the standard first-line treatment of CLL for many years, novel therapies targeting B cell receptor (BCR) signaling such as ibrutinib and idelalisib play an increasingly important role. 6 Along these lines, several recent studies have focused on altered signal transduction through the BCR and consecutively impaired calcium flux in CLL. Le Roy et al. demonstrated that in vitro stimulation of the BCR results in calcium flux and nuclear factor of activated T cells (NFAT) activation and could show that DNA binding capacity of NFAT2 correlates with clinical outcome. 7 Another study has recently demonstrated that surface IgM expression and intracellular calcium mobilization are dependent on IGHV mutational status and DNA methylation. 8 Multiple laboratories have furthermore characterized anergy, a state of BCR unresponsiveness and impaired calcium mobilization, as a hallmark of indolent CLL with favorable outcome. 9, 10 Previous studies have primarily analyzed calcium mobilization in PBMCs without gating for CLL cells or required a time-consuming isolation of CLL cells before the measurements. Furthermore, ratiometrics with FuraRed by calculation of the ratio between bound and unbound calcium has been established for PBMCs 11 and provides several advantages, although has not been used in the context of CLL. 12

In the current study, we have established a flow cytometry-based assay to evaluate intracellular calcium flux capabilities in primary CLL cells employing a cohort of 25 patients. The degree of calcium flux was subsequently correlated with well-established prognostic parameters and clinical outcome. Using a receiver operating characteristics (ROC) analysis, we defined a cutoff value to discriminate a responder from a nonresponder population with significant differences in progression-free survival (PFS). In summary, we provide a novel assay to quickly and reliably assess BCR signaling in CLL cells as a means to predict clinical outcome.


Flow Cytometry: Going with the Flow

Sara Bowen, PhD, is a biochemist with what can only be described as a giddy excitement for her job. She runs the flow cytometry facility at St. Joseph’s Hospital and Barrow Neurological Institute in Arizona, and she positively lights up when talking about “flow” and her lasers.

Dr. Sara Bowen. Photo by Cathy Seiler.

An analogy to understand flow cytometry is to think about a stream filled with lots of different fish: big fish and small fish, black fish and white fish. To better understand the characteristics of the fish in the stream, you could direct each fish into a small channel in the stream where they can pass through in single file. From looking at them one at a time, you can note if the fish is big or small or black or white. Flow cytometry is بالضبط مثله. Instead of fish, Sara is looking at hundreds of thousands of cells. Instead of a stream and a small channel, she is using a flow cytometry machine. And instead of her eyes and a notebook, she’s using lasers and flow cytometry software. And yes, her job really is that cool.

We had a chance to talk with Sara about being a scientist, how she got interested in flow cytometry, why flow is so important, and why she’s so obsessed with lasers.

Cathy Seiler: You have your PhD in biochemistry, but not all biochemists do the same thing. What does being a biochemist mean to you?

Dr. Sara Bowen: When I think of biochemists, I sort us into two main buckets. Some are trying to understand parts of a picture. They are looking at a very specific piece of biology and trying to figure out how it does what it does. For example: How does the shape of a hemoglobin protein affect its ability to hold on to and release oxygen? Biochemists in the other bucket are asking questions about the picture as a whole. They want to know how the parts fit together to make biological processes work. For example, what hormones are released when you eat a tangelo, and how do they help you digest it? But zoomed in or zoomed out, all biochemists are trying to understand how biology works, be it human, penguin, jellyfish, or tulip tree biology.

Seiler: How did you first become interested in flow cytometry?

Flow cytometry image of blood cells detecting two different markers (CD3 and CD19) that light up different colors using different color lasers. This experiment separated different types of blood cells called T cells and B cells. Credit: Sara Bowen.

Bowen: Ever had to give a book report? Well, that doesn’t stop when you get to graduate school. I had to read a scientific paper about flow cytometry and explain it to my classmates, and at the time, I had never even heard of flow. When I was getting started, all I could think about was that the data looked like someone had sneezed on a page. How does anybody make sense of all those dots?! But in the process of learning about flow well enough to explain it to my classmates, I realized that it is a powerful tool for scientists. And when it hit me that the whole thing is possible because of all the colors in the rainbow, I was in love.

Seiler: What is with your obsession with lasers?

Bowen: Did I mention that I like colors? Each of my lasers is a specific color: violet, blue, or red. The cells (or molecules that are attached to the cells) that I’m looking at interact with different colors of light differently depending on the cells’ or molecules’ physical properties. That sounds complicated, so think of it this way. Your boss comes in and says, “What is going on in here?” Depending on the tone of voice, you will probably react differently. If your boss sounds angry, you might react defensively. If your boss is laughing, you might laugh back. If your boss is clearly talking to himself as he or she wanders by, you might not react at all. A big part of my job is figuring out how to combine laser color and cells or molecules so that I can gauge the “reactions” of the cells or molecules in a way that I can understand. My job is a game, and lasers make it possible to play.

[Cathy’s note: If you think of the fish analogy above, the lasers are what detect the color of the fish in the stream.]

Also, just say out loud: “I work with lasers.” Sounds impressive, right?

Seiler: How can flow cytometry and your work help people?

Bowen: I think a good way to start answering this question is by listing some of the things flow cytometry has already done for people:

  • It was crucial for understanding and diagnosing HIV/AIDS.
  • It was instrumental during the Human Genome Program.
  • It has been critical in understanding, diagnosing, and treating leukemia and lymphoma.

All three of those contributions are massively important to humankind. In my work, I’m helping other scientists use flow to combat serious health issues including stroke, Multiple Sclerosis, brain cancer, and transplant rejection.

Seiler: What is one thing you really want readers to know about you, flow cytometry, or science in general?

Bowen: Scientists are just regular people. Most of us aren’t particularly brilliant, but we نكون persistent. We’re all trying to understand things that have never been explained before. We do that by building on what’s already known and testing all the possibilities that قد add knowledge. That means most days science is more tedious than exciting.

Seiler: What advice would you give to someone who is interested in pursuing a career like yours?

Bowen: Be persistent. Sometimes (or a lot of times) you will fail, and that’s OK. It might feel like you are the only one struggling, but I promise you’re not.

-الدكتور. Cathy Seiler is the manager of the Biobank Core Facility at Barrow Neurological Institute and St. Joseph’s Hospital. She received her bachelor’s degree in biochemistry and molecular biology at Boston University and her PhD at the Watson School of Biological Sciences at Cold Spring Harbor Laboratory, studying cancer. In her spare time, Cathy is the editor for ISBER News and writes about science and the life of a scientist on her blog Things I Tell My Mom .


شاهد الفيديو: ب د. مها خلف م التدفق الخلوي (شهر نوفمبر 2022).