معلومة

ما هو الاختبار البسيط الجيد لجودة مكتبة (كدنا)؟

ما هو الاختبار البسيط الجيد لجودة مكتبة (كدنا)؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كيف أقوم بتقييم جودة مكتبة (كدنا)؟

أريد استنساخ نسخ CDS من الجينات من مكتبة ، لكني لا أعرف ما هو التوقع النموذجي للحصول على نسخة كاملة الطول حتى لجين أقصر (حوالي 1000 نقطة أساس). أعلم أنه لا يجب أن يتكون من cDNA كامل الطول للتسلسل ، لكنني أتخيل أن جودة المواد الأولية مهمة هناك أيضًا.

هل هناك بعض النصوص الشائعة التي يمكنني محاولة الحصول عليها من PCR والتي ستخبرني عن مدى تجزئة التسلسلات الموجودة هناك؟

ما هي النتيجة النموذجية من مكتبة cDNA التجارية - هل هناك أي اختبارات لمراقبة الجودة يتم تشغيلها بسرعة في المختبر؟


الشروع في استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq)

لا تحتفظ الطرق القياسية لإعداد مكتبة الحمض النووي الريبي بالمعلومات عن خيط الحمض النووي الذي تم نسخ خيوط الحمض النووي الريبي منه. تعد القدرة على الحصول على معلومات حول الخيط الأصلي مفيدة لأسباب عديدة بما في ذلك تحديد النصوص المضادة للمعنى ، وتحديد الشريط المنسوخ من RNAs غير المشفر ، وتحديد مستويات التعبير للنصوص المتداخلة المشفرة أو غير المشفرة. بشكل عام ، يمكن أن تؤدي القدرة على تحديد الخيط الأصلي إلى تعزيز قيمة تجربة RNA-seq بشكل كبير.

حتى بعد قرار تنفيذ التوجيه أو إعداد المكتبة غير الاتجاهي ، يمكن استخدام عدة طرق لإنشاء مكتبة RNA-seq ، وتعتمد تفاصيل هذه الأساليب على النظام الأساسي المستخدم للتسلسل عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، هناك خطوات مشتركة.

  • إزالة نسخة وفيرة: غالبية جزيئات الحمض النووي الريبي الموجودة في الخلية هي RNA الريبوزومي (rRNA) ، وبما أن هذه ليست ذات أهمية بشكل عام ، فيجب إزالتها قبل إنشاء مكتبة من RNA ذات الأهمية. وبالمثل ، تتم إزالة globin RNA عمومًا من عينات الدم وغالبًا ما تتم إزالة الحمض النووي الريبي بالبلاستيدات الخضراء من عينات أوراق النبات. هناك خياران شائعان لهذه الخطوة هما:
  • تجزئة: يتم إنشاء شظايا ذات حجم مناسب للتسلسل عن طريق تجزئة الحمض النووي الريبي قبل النسخ العكسي وتوليف (كدنا) ، بدلاً من تجزئة (كدنا).
  • النسخ العكسي وتوليف (كدنا) الثاني: يتم إنشاء الحمض النووي التكميلي (كدنا) من قالب الحمض النووي الريبي بواسطة النسخ العكسي. يتم بعد ذلك جعل هذا الخيط الأول (كدنا) مزدوجًا تقطعت به السبل باستخدام بوليميريز الحمض النووي.
  • إصلاح النهاية ، dA-Tailing وربط المحول: يتبع الإصلاح النهائي لمكتبة ds (كدنا) وخلف dA الاختياري (اعتمادًا على منصة التسلسل المستخدمة) ربط المحولات. تصبح المكتبة بعد ذلك جاهزة للتضخيم والتسلسل.


عوامل مهمة يجب مراعاتها عند إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي
يعد إعداد المكتبة جزءًا مهمًا من سير عمل RNA-seq والطرق المتاحة حاليًا لإعداد المكتبة لـ RNA-seq التي تقدم بروتوكولات مبسطة وعوائد محسّنة. ومع ذلك ، لا تزال الجودة والتقدير الدقيق لمدخلات الحمض النووي الريبي أمرًا بالغ الأهمية لضمان نجاح تخليق (كدنا) والمكتبات. فيما يلي بعض العوامل المهمة التي يجب مراعاتها:


المقدمة

يعد تحديد وعزل مستنسخات (كدنا) أمرًا مهمًا للتفسير والتحقيق الوظيفي للجينومات المتسلسلة. تسهل معلومات تسلسل cDNA تحديد exons وبالتالي تحديد إمكانات الترميز للجينات. توفر مستنسخات (cDNA) تحقيقات لمجموعة متنوعة من دراسات التعبير الجيني ، وتسمح الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على إطارات قراءة مفتوحة كاملة (ORFs) بالتحقيق الوظيفي في منتجاتها البروتينية. تم إنشاء مشروع Mammalian Gene Collection (MGC) كبرنامج للمجال العام بهدف توفير معلومات تسلسل cDNA كاملة الطول والنسخ المادية لجميع الجينات ، بدءًا من جينومات الإنسان والفأر (1). لدى معهد Riken (2) وعدد من مجموعات القطاع الخاص أيضًا برامج رئيسية تهدف إلى جمع الحيوانات المستنسخة كاملة الطول. في البداية ، تم تحضير مكتبات (كدنا) في MGC من مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا والأنسجة. كانت النسخ التي تم اختيارها عشوائيًا من هذه المكتبات متسلسلة نهائية ، وتم تسلسل النسخ الفريدة التي يعتقد أنها تحتوي على ORFs كاملة وإتاحتها للتوزيع العام. لقد كان MGC ناجحًا للغاية. اعتبارًا من أكتوبر 2004 ، تم الإبلاغ عن تسلسل وتوزيع استنساخ كامل الطول يبلغ 00012000 إنسان و 10000 فأر ، وهناك 3000 استنساخ إضافي من كل نوع تم تقييمه على أنه من المحتمل أن يحتوي على ORFs كاملة ، في خط أنابيب التسلسل (3) (http://mgc.nci.nih.gov/). ومع ذلك ، كما كان متوقعًا في البداية ، انخفض إنتاج الحيوانات المستنسخة الجديدة مع تقدم المشروع. قد تحتوي الجينات التي لا يتم تمثيلها بواسطة نسخ مختارة من cDNA على مستويات تعبير منخفضة وبالتالي تكون نسخًا نادرة. يتم استخدام عدة طرق لعزل الحيوانات المستنسخة النادرة. الأول هو توليد وتسلسل عشوائي لمكتبات (كدنا) مطروح. آخر هو التنبؤ بتسلسل mRNA بناءً على التسلسل الجيني ، وتضخيم هذه التسلسلات المحددة من cDNA باستخدام PCR. يعتمد النهج الثالث على الفكرة ، وهي أن النصوص النادرة في مكتبات (كدنا) المحضرة من خطوط الخلايا المتاحة والأنسجة التي يتم الحصول عليها بسهولة ، قد تكون موجودة بكثرة نسبية أكبر بكثير في أنسجة معينة لا يمكن الحصول عليها إلا بكميات صغيرة. في الدماغ ، على سبيل المثال ، هناك حالات معروفة من الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في أعداد صغيرة نسبيًا من الخلايا العصبية في مناطق شديدة الانفصال. على سبيل المثال ، هناك حوالي 10000 خلية تحتوي على فاسوبريسين في نواة الفئران المجاورة للبطين (مقسمة بين نوعين رئيسيين من الخلايا) و 7000 في النواة فوق التصالبية (4 ، 5). مطلوب تشريح مجهري ينتج عنه في النهاية كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي الريبي للحصول على عينة غنية في هذه الخلايا. وبالتالي ، فإن طرق إنتاج مكتبة cDNA التي تكون فعالة بكميات صغيرة جدًا من المواد الأولية مهمة للحصول على مكتبات ذات تمثيل كبير لهذه الأنواع من النصوص النادرة.

تستخدم معظم إجراءات إنشاء مكتبات (كدنا) قليل النوكليوتيد الذي يحتوي على تسلسل بولي قصير (dT) كأساس في تفاعل النسخ العكسي الذي يستخدم الحمض النووي الريبي المنقى متعدد الأدينيل كقالب. بعد تفاعل الاستبدال الثاني ، يتم ربط وصلات أو مهايئات قليلة النوكليوتيد الاصطناعية بـ cDNAs مزدوجة الشريطة. يتم ربط هذه المنتجات ، في كثير من الحالات بعد هضم الإنزيم المقيد ، بناقل مُعد بشكل مناسب. يعد ربط المحول / الرابط عملية ربط غير فعالة ثنائية الجزيئات غير فعالة نسبيًا. يتم إجراؤه باستخدام فائض من المحول / الرابط ، والذي يجب إزالته من poduct (كدنا) قبل إدخاله في المتجه. تؤدي خطوة التنقية هذه إلى فقدان المواد. الارتباط اللاحق لـ cDNA في المتجه ، حتى في حالة إنشاء "نهايات لزجة" ، هو تفاعل ثنائي الجزيء بكفاءة محدودة. إن دمج تسلسل فتيلة oligo-dT في المتجه لإنتاج "ناقل تمهيدي" ، يلغي أحد تفاعلات الربط أو كلاهما وخطوة التنقية. وصف أوكاياما (6) إجراء بناء مكتبة (كدنا) على أساس ناقل تمهيدي عالي الكفاءة في عام 1982. لم يتم اعتماد هذه الطريقة على نطاق واسع ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى أنها تتطلب متطلبات فنية. تم وصف طرق أبسط ناقل - تمهيدي سابقًا (7 ، 8) ، لكنها أيضًا غير مستخدمة على نطاق واسع. ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن بعض القيود التقنية لم تتم معالجتها بشكل كافٍ ، أو أن المجموعات التجارية التي تستخدم طرق تحضير قليل النوكليوتيد أصبحت متاحة على نطاق واسع وسهلة الاستخدام. لقد عدنا إلى طريقة ناقلات التمهيدي لإنشاء مكتبات (كدنا) من كميات صغيرة جدًا من الأنسجة. نقدم الآن تقييم العديد من مكتبات (كدنا) أعدت من كميات ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي.


نصائح للفحص ثنائي الهجين

التقليل من الإيجابيات الكاذبة:

  • تشغيل مكررات التجربة لتقليل احتمالية تنشيط الجينات المراسل العشوائي. كما يوفر تضمين عنصر تحكم فريسة فقط مستوى أساسيًا لتنشيط المراسل.
  • تختلف مستويات التعبير عن بروتينات الطعم والفرائس - يمكن أن يؤدي الإفراط في التعبير إلى تفاعلات خاطئة. ستزيد مستويات التعبير المنخفضة من صرامة الربط الخاص بك.
  • والأهم من ذلك: التحقق بشكل مستقل من صحة شركاء الربط المحددين بتقنيات أخرى!

التقليل من السلبيات الكاذبة:

تعتمد التفاعلات التي تؤدي إلى إشارات مراسلة قابلة للاكتشاف على عدد من العوامل ، بما في ذلك التعبير البروتيني والطي الصحيح ، وتعديل ما بعد الترجمة ، وتدهور البروتين ، والوصول إلى النواة في شاشات حقيقية النواة وتكوين الاندماج. يمكن أن تؤدي احتمالية حدوث مشكلات مع واحد أو أكثر من هذه المعلمات إلى عدد كبير من السلبيات الخاطئة في شاشات Y2H.

  • يعد اختبار نظام المراسل الخاص بك باستخدام زوج من البروتينات المعروف أنها مرتبطة كعنصر تحكم إيجابي جيد لضمان عمل الإعداد الخاص بك. آخر شيء تريده هو تشغيل شاشة مكتبتك الجميلة فقط لتجد أن النظام نفسه لا يعمل لأن بروتين المراسل الخاص بك لا يعمل في الخميرة!
  • تنبع العديد من السلبيات الكاذبة أو تتفاقم بسبب التعبير عن البروتينات المستهدفة في الأنظمة غير المتجانسة (مثل بروتينات الثدييات في S. cerevisiae).
    • في حين أن هذا قد يكون من الصعب حله بالنسبة لمجموعة واسعة من بروتينات الفرائس ، يوجد الآن عدد من الأنظمة ثنائية الهجين المتاحة في الكائنات الحية النموذجية ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات البديلة ( C. البيض ، pC2HB) (7) وخلايا الثدييات.
    • إذا كانت المشكلة هي أن البروتينات الخاصة بك لم يتم تعديلها بعد الترجمة ، فيمكن أن يساعد التعبير المشترك للإنزيم المسؤول عن التعديل في سلالة مضيف الفحص.
    • من أجل تقليل فرصة أن تكوين بروتينات الاندماج الخاص بك يمنع فعليًا مواقع الربط لشريك البروتين أو جين UAS / المراسل ، يمكن فحص مكتبات الطعم والفرائس نفسها باستخدام كل من الاندماج الطرفي N و C لهذه البروتينات . بهذه الطريقة يتم فحص "طرفي" البروتين الخاص بك من أجل الارتباط.
    • يمكن أن يؤدي استخدام مجموعة متنوعة من مستويات وأنظمة التعبير إلى التخفيف من السلبيات الزائفة التي تنشأ من التعبير المنخفض أو الخاطئ عن البروتينات المستهدفة. في الواقع ، تتمثل الإستراتيجية العامة الجيدة لتقليل السلبيات الخاطئة وإنتاج شاشة أكثر قوة في استخدام عدد من نواقل الطُعم والفرائس المختلفة. لقد ثبت أن هذا فعال مثل استخدام خمس طرق مستقلة للكشف عن تفاعل البروتين (6).
    • من أجل ربط الحمض النووي وتنشيط الجين المراسل في الخلايا حقيقية النواة ، يجب أن تتمكن بروتينات الاندماج من الوصول إلى النواة. للتحايل على هذا المطلب لبروتينات الغشاء ، تم وضع نظام تقسيم يوبيكويتين (8).

    1. Casadaban M.J. ، Martinez-Arias A. ، Shapira S.K. ، Chou J. اندماج جينات بيتا جالاكتوزيداز لتحليل التعبير الجيني في الإشريكية القولونية والخميرة. طرق الانزيم. 1983100: 293-308. PubMed PMID: 6312261.

    2. Keegan ، L. ، Gill ، G. ، and Ptashne ، M. فصل ارتباط الحمض النووي عن وظيفة تنشيط النسخ لبروتين تنظيمي حقيقي النواة. علم. 1986 231: 699-704. PubMed PMID: 3080805.

    3. Brent، R.، and Ptashne، M. منشط نسخي حقيقي النواة يحمل خصوصية الحمض النووي لمثبط بدائية النواة. زنزانة. 1985 43: 729-736. PubMed PMID: 3907859.

    4. فيلدز ، س ، سونغ ، أو. نظام وراثي جديد لاكتشاف تفاعلات البروتين والبروتين. طبيعة سجية. 1989 340: 245-246. PubMed PMID: 2547163.

    5. Ozawa، T.، Kaihara، A.، Sato، M.، Tachihara، K.، Umezawa، Y.l. انقسام لوسيفيراز كمسبار ضوئي للكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في خلايا الثدييات على أساس الربط البروتيني. الشرج تشيم. 2001 73: 2516-2521. Pubmed PMID: 11403293.

    6. Chen، Y.C.، Rajagopala S.V.، Stellberger T.، Uetz P. المقارنة المعيارية الشاملة لنظام الخميرة ثنائي الهجين. طرق الطبيعة. 2010 7: 667-668. Pubmed PMID: 20805792.

    7. Stynen B. ، Van Dijck P. ، Tournu H. A CUG codon مكيف نظام ثنائي الهجين للفطر الممرض المبيضات البيض. الدقة الأحماض النووية. 201038 (19): e184. Pubmed PMID: 20719741. Pubmed Central PMCID: PMC2965261.


    ما هو الاختبار البسيط الجيد لجودة مكتبة (كدنا)؟ - مادة الاحياء

    تقدم Illumina ثلاث طرق لمساعدة الباحثين في تحديد تسلسل SARS-CoV-2. يوفر تسلسل الجيل التالي (NGS) طريقة فعالة لفحص العينات وتمييز الفيروسات دون معرفة مسبقة بالعوامل المعدية. مهام سير عمل Illumina SARS-CoV-2 الموضحة أدناه غير مخصصة لأغراض التشخيص (لا تتناول هذه النشرة سير عمل COVIDSeq). يتم تضمين ملاحظات التطبيق التي توفر معلومات مفصلة وأمثلة عن النتائج لكل سير عمل ، أدناه.

    إجمالي تسلسل الحمض النووي الريبي مع سير عمل إعداد مكتبة TruSeq ™ Stranded Total RNA Gold

    • سير عمل شامل لاكتشاف الفيروسات التاجية باستخدام ملاحظة تطبيق أنظمة Illumina الفوقية.
    • سير عمل تحضير العينة:
      • يتم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام QIAGEN QIAmp Viral Mini Kit (رقم الكتالوج 52904).
      • يتم إعداد المكتبات باستخدام مجموعة TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold (Illumina ، طقم مكون من 48 عينة ، رقم الكتالوج 20020598 طقم مكون من 96 عينة ، رقم الكتالوج 20020599).
      • تعد العينات التي يتم تحضيرها مباشرة من المسحات أو مصادر عينات مماثلة أكثر ملاءمة لسلسلة أنظمة NextSeq ™ نظرًا للتوصية بـ 10 ملايين قراءة لكل عينة.
      • تعد المكتبات المعدة من الثقافة الفيروسية باستخدام نفس سير عمل إعداد المكتبة مناسبة تمامًا للأدوات الأخرى التي توضع فوق الطاولة بما في ذلك أنظمة iSeq ™ 100 و MiniSeq ™ و MiSeq ™ نظرًا لانخفاض عدد القراءة الموصى به البالغ 500000 قراءة لكل عينة.
      • يتم إجراء تحليل البيانات المحلية باستخدام وحدة إعادة تسلسل Illumina Local Run Manager (LRM) ، مع الجينوم المرجعي SARS-CoV-2.
      • يمكن إجراء تحليلات المصب باستخدام منصة IDbyDNA Explify (www.idbydna.com/explify-platform).

      التسلسل المستند إلى الإثراء باستخدام Illumina DNA Prep with Enrichment (المعروف سابقًا باسم Nextera ™ Flex for Enrichment) سير عمل إعداد مكتبة

      • سير عمل التخصيب لاكتشاف الفيروسات التاجية باستخدام ملاحظة تطبيق أنظمة Illumina NGS
      • سير عمل تحضير العينة:
        • يتم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام QIAGEN QIAmp Viral Mini Kit (رقم الكتالوج 52904).
        • يتم نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي عكسيًا باستخدام مجموعة التوليف العلمية Maxima H Minus مزدوجة الشرائط (كدنا) من Thermo Fisher (Thermo Scientific ، رقم الكتالوج K2561). قد تكون تدفقات عمل النسخ العكسي الأخرى متوافقة ، بما في ذلك وحدة توليف الشريط الأول ووحدة توليف الشريط الثاني (غير الخيطية) من NEB.
        • يتم استخدام cDNA الفيروسي كمدخل لمجموعة إعداد مكتبة Illumina DNA مع مجموعة إعداد مكتبة الإثراء (المعروفة سابقًا باسم Nextera Flex للتخصيب) ، ومُخصب بلوحة Oligo الفيروسية التنفسية (Illumina ، كتالوج رقم 20042472).
        • يتم إجراء التسلسل على المنضدة iSeq 100 أو MiniSeq أو أنظمة MiSeq المناسبة تمامًا لمتطلبات القراءة المنخفضة لهذه العينات
        • يتم إجراء تحليل البيانات المحلية باستخدام وحدة إعادة تسلسل Illumina Local Run Manager (LRM) ، مع الجينوم المرجعي SARS-CoV-2.
        • يمكن إجراء تحليلات المصب باستخدام منصة IDbyDNA Explify (www.idbydna.com/explify-platform).

        تسلسل Amplicon مع AmpliSeq ™ للوحة أبحاث Illumina SARS-CoV-2

        • AmpliSeq لصفحة منتج لوحة أبحاث Illumina SARS-CoV-2
        • نظرة عامة على اللوحة:
          • تحتوي لوحة مجتمع AmpliSeq هذه (حسب الطلب) على 247 amplicons في مجموعتين تستهدف جينوم SARS-CoV-2. تم تصميم اللوحة لتغطية & gt99٪ من جينوم SARS-CoV-2 (

          • يتم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام QIAGEN QIAmp Viral Mini Kit (رقم الكتالوج 52904).
          • ارجع إلى AmpliSeq الخاص بالدليل المرجعي للوحة مجتمع Illumina ، الفصل 3 ، للحصول على بروتوكول لألواح الحمض النووي الريبي.
          • بعد إعداد المكتبة ، يتم إجراء التسلسل عادةً على أجهزة التسلسل الموجودة على الطاولة ، أو iSeq 100 أو MiSeq أو MiniSeq أو NextSeq 500/550 نظرًا لمتطلبات القراءة المنخفضة لهذه العينات
          • يمكن استخدام تطبيق DNA Amplicon في BaseSpace ™ أو تطبيق DRAGEN ™ Metagenomics لتحليل البيانات.

          هذه اللوحة مخصصة للاستخدام البحثي فقط (RUO) ، وليس للاستخدام في إجراءات التشخيص.


          ما هو الاختبار البسيط الجيد لجودة مكتبة (كدنا)؟ - مادة الاحياء

          مركز الطب الجزيئي وعلم الوراثة
          كلية الطب بجامعة واين ستيت
          540 إي. كانفيلد
          ديترويت ، ميشيغان 48201

          فحص وظيفة شبكات البروتينات والبروتينات باستخدام نظام الخميرة ثنائي الهجين

          يوفر نظام الخميرة ثنائي الهجين نهجًا مباشرًا نسبيًا لفهم وظيفة البروتين. يوضح القسم الثاني المكونات الأساسية لمصيدة التفاعل ، وهو نظام خميرة ثنائي الهجين تم تطويره في مختبر برنت (جيوريس وآخرون ، 1993). يمكن الحصول على معلومات أساسية أكثر تفصيلاً في عدد من المراجعات الحديثة (Ausubel et al.، 1987-1996 Finley and Brent، 1995 Mendelsohn and Brent، 1994). يحتوي القسم الثالث على بروتوكول البحث عن التفاعل ، وهو نسخة مكثفة ومحدثة من البروتوكول الأصلي الذي نشرناه لأول مرة على الإنترنت في عام 1992 وتم تحديثه لاحقًا (Finley and Brent ، 1995 Finley et al. ، 1997). الإصدار المقدم هنا هو الإصدار الذي نستخدمه حاليًا في مختبرنا ويمثل محاولاتنا لتبسيط هذه التقنيات وتوسيع نطاقها لتسهيل توصيف الشبكات الكبيرة للبروتينات المتفاعلة. كما أنه مفيد للصيد الفردي. يناقش القسم الرابع الأساليب البديلة المصممة خصيصًا للنظر في شبكات البروتين الكبيرة ، والهدف النهائي من تطوير هذه الأساليب والمقاربات ذات الصلة هو تحديد جميع التفاعلات المشفرة بواسطة الجينوم في نهاية المطاف. يناقش القسم الخامس بإيجاز النهجين الهجينين لفهم وظائف تفاعلات البروتين الفردية.

          تم تطوير عدة أنظمة مختلفة ثنائية الهجين لدراسة وظيفة البروتين. إن تطبيق الحديقة المتنوعة هو التعرف على وظيفة بروتين معين عن طريق عزل البروتينات التي تتفاعل معه ، عادةً عن طريق فحص مكتبة cDNA. لإجراء مثل هذا البحث عن المتفاعل ، يتم التعبير عن البروتين في الخميرة على أنه اندماج في مجال ربط الحمض النووي لعامل النسخ الذي يفتقر إلى مجال تنشيط النسخ. يُطلق على بروتين الاندماج المرتبط بالحمض النووي اسم الطُعم. تحتوي سلالة الخميرة أيضًا على جين مراسل واحد أو أكثر مع مواقع ربط لمجال ربط الحمض النووي. لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع الطُعم ، يتم إدخال مكتبة البلازميد التي تعبر عن البروتينات المشفرة (كدنا) المدمجة في مجال تنشيط النسخ في السلالة. يؤدي تفاعل البروتين المشفر (كدنا) مع الطعم إلى تنشيط جينات المراسل ، مما يسمح بتحديد الخلايا التي تحتوي على المتفاعلات.

          النظام ثنائي الهجين الذي تم تطويره في مختبر برنت (مصيدة التفاعل) يستخدم بروتين الإشريكية القولونية LexA كمجال ربط الحمض النووي وبروتين مشفر بواسطة متواليات الإشريكية القولونية العشوائية ، B42 "النقطة الحمضية" ، كتنشيط النسخ نطاق. يتم التعبير عن كلا البروتينين من البلازميدات متعددة النسخ (2 & # 181) ، يتم التعبير عن اندماج LexA ، أو الطعم ، من بلازميد يحتوي على علامة HIS3 ، ويتم التعبير عن البروتين المندمج في مجال التنشيط ، والذي يُطلق عليه أحيانًا الفريسة ، من بلازميد يحتوي على علامة TRP1 . في بلازميد الطعم الأكثر شيوعًا ، pEG202 ، يتم التعبير عن الطُعم من الخميرة التأسيسية ADH1 المروج. تتوفر بلازميدات الطعم ذات الصلة التي تعبر عن الطعم المندمج في إشارة توطين نووي. يعبر بلازميد الفريسة الأكثر شيوعًا ، pJG4-5 ، عن البروتينات المندمجة في مجال التنشيط B42 ، وإشارة التوطين النووي SV40 ، وعلامة حاتمة مشتقة من Hemagglutinin ، وكلها مدفوعة بمروج الخميرة GAL1 الذي ينشط فقط في الخميرة المزروعة على الجالاكتوز . يسمح استخدام محفز GAL1 للتعبير عن الفريسة بالتعبير عن البروتينات السامة بشكل عابر ويساعد في القضاء على العديد من الإيجابيات الخاطئة في عمليات البحث عن التفاعل. تستخدم مصيدة التفاعل جينين للمراسل يحملان مواقع أو مشغلي ربط LexA المنبع: LEU2 و lacZ. يتم دمج مراسلي LEU2 في جينوم الخميرة ، حيث يقيم مراسلو lacZ عادةً على 2 & # 181 بلازميدات تحمل علامة URA3 ، على الرغم من توفر الإصدارات المتكاملة أيضًا. توجد عدة إصدارات من مراسلي LEU2 و lacZ التي لديها مجموعة من الحساسيات بناءً على عدد مشغلي LexA المنبعين. بشكل عام ، يكون مراسلي LEU2 أكثر حساسية لزوج معين من البروتينات المتفاعلة من مراسلي lacZ (Estojak et al. ، 1995) ، ومع ذلك ، تم استخدام مراسلي lacZ عالي الحساسية الذي يحتوي على العديد من مشغلي LexA وتسلسلات إنهاء النسخ في اتجاه مجرى جين lacZ (S. Hanes اتصال شخصي).

          يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول السلالات المختلفة والبلازميدات المتاحة لمصيدة التفاعل في مكان آخر (Ausubel et al. ، 1987-1996 Brent et al. ، 1997 Estojak et al. ، 1995 Finley and Brent ، 1994 Finley and Brent ، 1995 Finley et آل ، 1997 جيوريس وآخرون ، 1993)

          ثالثا. بروتوكول مطاردة المفاعل

          فيما يلي أشير إلى السلالات النموذجية والمراسلين اللازمين للبحث عن المتفاعل. وتشمل هذه سلالة مراسل LEU2 الحساسة EGY48 ، ومراسل lacZ الحساس البلازميد pSH18-34 ، والبلازميد للتعبير عن اندماج LexA مثل pEG202 ، ومكتبة البلازميد pJG4-5. ما يلي هو نسخة مختصرة من بروتوكول منشور سابقًا (Finley and Brent ، 1995). الغرض منه هو توضيح وتوسيع بعض النقاط المهمة في البروتوكول الأصلي. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل على مواقع الويب (Brent et al. ، 1997 Finley et al. ، 1997)

          أ. اختبار الطعوم الجزء 1: هل الطعم ينشط النسخ؟

          قبل إجراء بحث عن المتفاعلات ، من المهم جدًا معرفة مستوى تنشيط الخلفية بواسطة بروتين الطُعم نفسه. تقريبا كل اندماج LexA سيعمل على تنشيط مراسل LEU2 في EGY48 إلى حد ما من تلقاء نفسه. يحدد مقدار التنشيط بواسطة الطُعم كيفية إجراء البحث التفاعلي ، وما إذا كان يتم إجراء البحث التفاعلي. الطريقة الأكثر فائدة لقياس مستوى التنشيط هي تحديد جزء الخلايا الحية القادرة على النمو في غياب الليوسين (على الصفائح البيضاء). على الرغم من أنه ليس من الواضح على الفور سبب سماح الطُعم المنشط بقوة لجزء أكبر من خلايا EGY48 بالنمو في غياب الليوسين ، فإن تحديد هذا الجزء ضروري لإجراء عملية صيد المتفاعل. يمكن تمثيل الكسر على أنه عدد المستعمرات التي تنمو على صفيحة بيضاء (Leu + مستعمرات) لكل خلية خميرة حية مطلية. يتم تحديد عدد الخلايا الحية ، أو وحدات تكوين المستعمرات (CFU) ، في قسمة من الخلايا عن طريق تخفيف الطلاء على الألواح التي تحتوي على الليوسين. وبالتالي ، فإن تواتر مستعمرات Leu + (أو Leu + / CFU) هو نسبة عدد المستعمرات التي تتشكل على الصفائح فوق العدد الذي يتكون على الصفائح التي تحتوي على الليوسين. يتم إجراء الاختبار باستخدام سلالة التحديد (السلالة التي تحتوي بالفعل على مراسل lacZ وبلازميدات الطعم) والتي يتم تحويلها باستخدام بلازميد المكتبة الفارغ ، pJG4-5 وهذا يحاكي عن كثب الظروف التي سيتم بموجبها إجراء اختيار المتفاعلات في النهاية. بالنسبة للطُعم غير القادر فعليًا على تنشيط جين LEU2 بمفرده ، فإن تواتر مستعمرات Leu + في الاختبار سيكون أقل من 10 -6 (على سبيل المثال ، سيتشكل أقل من 1 Leu + مستعمرة عندما يتم طلاء 10 6 CFU على leu- لوحات). الطعوم التي تنشط مستوى معتدل من النسخ ستنتج مستعمرات Leu + بترددات من 10 -4 إلى 10 -5.

          من المهم وضع 10 6 CFU على الأقل على اللوح الأبيض عند اختبار طعم لتفعيل LEU2. لفحص مكتبة نموذجية من 10 6 وحدات cDNA فردية ، سيكون من الضروري وضع أكثر من 10 6 CFU من سلالة التحديد المحولة بالمكتبة على لوحات leu- لوحات لاختيار المتفاعلات. إذا تم اختبار تنشيط الخلفية بواسطة الطُعم عن طريق طلاء 10 3 أو 10 4 CFU فقط على صفائح بيضاء ، وتشكلت مستعمرة واحدة أو عدد قليل من مستعمرات Leu + ، فسيكون من المغري استنتاج أن الطُعم ينشط LEU2 عند مستوى منخفض بدرجة كافية تستخدم للبحث عن المتفاعل. ومع ذلك ، إذا حاول المرء بعد ذلك فحص مكتبة مكونة من 3 × 10 6 (كدنا) فردية عن طريق طلاء أكثر من 3 × 10 6 كفو على لوحات الاختيار ، فإن 3000 مستعمرة على الأقل ستشكل كل هذه المستعمرات من المتوقع أن تكون إيجابية كاذبة (على سبيل المثال ، تكونت بسبب التنشيط بواسطة الطُعم وليس بسبب تفاعل الطُعم مع البروتينات المشفرة بـ cDNA). كما نوقش أدناه ، فإن معرفة تواتر مستعمرات Leu + التي تنشأ من التنشيط بواسطة الطُعم نفسه ستكون مهمة أيضًا في تحديد عدد مستعمرات Leu + لاختيارها لمزيد من التحليل أثناء مطاردة المتفاعل.

          الاختبار الثاني المهم لإمكانات التنشيط للطعم هو قدرته على تنشيط مراسل lacZ. بشكل عام ، أكثر مراسلي lacZ حساسية (على سبيل المثال ، pSH18-34 البلازميد) ليسوا حساسين مثل مراسلي LEU2. في معظم الحالات ، فإن الطعم الذي ينتج مستعمرات Leu + بتردد أقل من 10-4 لن ينشط جين lacZ ، كما تم قياسه من خلال قدرة المستعمرة على التحول إلى اللون الأزرق على لوحة X-Gal. ومع ذلك ، في حالات نادرة ولأسباب غير معروفة ، فإن الطعم الذي ينشط مستوى منخفض جدًا من مراسل LEU2 سوف ينشط مراسل lacZ إلى مستوى كبير. وبالتالي ، من الضروري اختبار تنشيط مراسل lacZ عند وصف الطعم.

          بروتوكول 1 اختبار ما إذا كان الطعم ينشط النسخ

          • يمكن العثور على وصفات الوسائط على موقع الويب (Finley et al. ، 1997) وفي أماكن أخرى (Ausubel et al. ، 1987-1996 Finley and Brent ، 1995 Guthrie and Fink ، 1991).
          • وسائط YPD السائلة
          • وسائط التسرب السائل (Glu ura- ، Glu ura-his-)
          • لوحات التسرب (Glu ura- ، Glu ura-his- ، Glu ura-his- trp- ، Gal / Raf ura-his- trp- ، Gal / Raf ura-his- trp-leu-)
          • لوحات X-Gal (Gal / Raf ura-his- trp- X-Gal)
          • سلالة الخميرة EGY48 (MAT & # 181 ura3 his3 trp1 3LexAop- LEU2 :: leu2) أو أحد سلالات مراسل LEU2 الأقل حساسية EGY191 أو EGY189 (MAT & # 181 ura3 his3 trp1 1LexAop- LEU2 :: leu2) (Estojak et al. ، 1995)
          • URA3 2 & # 181 lacZ مراسل بلازميد pSH18-34 ، أو مراسل lacZ أقل حساسية (Finley and Brent ، 1995)
          • HIS3 2 & # 181 طعم بلازميد (على سبيل المثال ، مشتق من pEG202) يعبر عن بروتين الطعم الخاص بك المدمج في LexA
          • طعمان للتحكم: أحدهما يشفر LexA مدمجًا في منشط مثل Gal4 كما هو الحال في pSH17-4 البلازميد ، والآخر يشفر طعمًا خاملًا مثل LexA-Max (Zervos et al. ، 1993)
          • مكتبة بلازميد TRP1 2 & # 181 ، pJG4-5 ، تفتقر إلى (كدنا)
          • انظر بروتوكول التحويل المرفق للكواشف الإضافية

          1. قم ببناء سلالة التحديد إما عن طريق التحويل التسلسلي لـ EGY48 مع pSH18-34 متبوعًا ببلازميد الطعم الخاص بك ، أو عن طريق التحويل المشترك لـ EGY48 مع بلازميد الطعم و pSH18-34. يجب أن تزرع سلالة الاختيار (EGY48 / pSH18-34 / bait plasmid) على وسط ura-his- في جميع الخطوات اللاحقة للحفاظ على اختيار الطعم والبلازميدات المراسل lacZ. اختر ثلاث مستعمرات محولة فردية وانطلق إلى لوحة Glu ura-his- أخرى للتخزين والانتعاش لاحقًا. يجب أن يتصرف الثلاثة بشكل متماثل في الاختبارات أدناه ، وفي هذه الحالة سيكون أي شخص بمثابة إجهاد الاختيار الذي سيتم تقديم المكتبة فيه.

          2. قم بتحويل إجهاد التحديد باستخدام pJG4-5 وحدد المحولات على ألواح Glu ura-his-trp. اغتنم هذه الفرصة لممارسة تحويل إجهاد الاختيار بكفاءة عالية سيكون ذلك ضروريًا للتحول باستخدام DNA للمكتبة (البروتوكول 3).

          3. اختر مستعمرتين أو ثلاث مستعمرات محولة وقم بتلقيح 10 مل سائل Glu ura-his-trp- وسط (مرة أخرى ، يجب أن تتصرف جميع المستعمرات بالطريقة نفسها ، ولكن إجراء الاختبار على أكثر من واحدة يمكن أن يساعد في ضمان أن النتائج ليست بسبب بعض الخميرة الطافرة المارقة أو الملوثات). تنمو الثقافات السائلة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز إلى OD600 = 1.0 (يقابل حوالي 107 خلية / مل). هذه مرحلة منتصف اللوغاريتم ، بشرط أن تبدأ الثقافة عند OD600 & lt0.2. إذا نمت الثقافات بين عشية وضحاها إلى كثافة أكبر من OD600 = 1.0 ، خفف إلى أقل من OD600 = 0.2 ثم ​​تنمو إلى OD600 = 1.0 بحيث تكون الخلايا في منتصف مرحلة السجل عند حصادها.

          4. عمل تخفيفات متسلسلة من 10-1 إلى 10-6 من كل مزرعة في ماء معقم.

          5. صفيحة 100 م لتر من المزرعة و 100 م لتر من كل تخفيف على لوحين (أ):

          6. رصد ظهور المستعمرات خلال الأيام العديدة القادمة. احسب عدد CFU التي تم طلاءها على كل لوحة Gal / Raf ura-his- trp-leu- بإحصاء عدد المستعمرات التي تتشكل على لوحات Gal / Raf ura-his-trp. احسب عدد Leu + المستعمرات / CFU. يجدر أيضًا ملاحظة حجم المستعمرات بعد يومين و 3 و 4 أيام (انظر أدناه).

          7. اختبار التعبير lacZ. تتمثل إحدى طرق القيام بذلك ببساطة في ترقيع المحولات الفردية من الخطوة 2 إلى ألواح Gal / Raf ura-his- trp- X-Gal (بقع حوالي 1 سم × 1 سم) واحتضانها عند 30 درجة مئوية. يجب أن تتحول الخميرة مع عنصر تحكم اندماج LexA-Activator إلى اللون الأزرق بين عشية وضحاها بينما تلك التي تفتقر إلى LexA أو التي تحتوي على طعم خامل نسبيًا ستظل بيضاء إلى أجل غير مسمى. بدلاً من ذلك ، إذا كان تكرار Leu + / CFU أعلى من 10-4 ، فقد يكون من المفيد نسخ لوحة طبق الأصل من إحدى لوحات Gal / Raf ura-his- trp-leu (واحدة بها 200-500 مستعمرة) إلى Gal / راف اوره- ترب- اكس-غال. سيكشف هذا عن تواتر المستعمرات الزرقاء بين مستعمرات Leu + ، وهو رقم قد يكون مفيدًا في تحديد استراتيجيات الصيد (انظر أدناه).

          يتم استخدام الجالاكتوز في الوسط لأن الاختيار الفعلي سيتم في النهاية على ألواح الجالاكتوز للحث على التعبير عن بروتين cDNA الموسوم بالتنشيط. يضاف رافينوز للمساعدة في نمو الخميرة ، فهو يوفر مصدرًا أفضل للكربون مقارنة بالجالاكتوز وحده ، ولكنه لا يمنع قدرة الجالاكتوز على تحفيز محفز GAL1.

          ب. اختبار الطعوم الجزء 2: هل يدخل بروتين الطعم إلى النواة ويرتبط بمشغلي LexA في المراسلين ، وهل بروتين الانصهار كامل الطول مصنوع؟

          هناك تقارير نادرة عن الطعوم التي تم استبعادها من نواة الخميرة ، وعادة ما يكون من الممكن إجبارها على النواة عن طريق تضمين مجال التوطين النووي N-terminal إلى LexA. يمكن اعتبار أي مستوى صغير من تنشيط النسخ بواسطة الطُعم بمثابة مؤشر على دخول بروتين الطُعم إلى نواة الخميرة. ومع ذلك ، فإن الطُعم المثالي لا ينشط النسخ ، لذلك هناك حاجة إلى اختبار آخر لإثبات أنه يمكن أن يشغل العاملين في نواة الخميرة. اختبار واحد بسيط هو اختبار القمع. يعتمد هذا الاختبار على قدرة معظم عمليات اندماج LexA الخاملة نسبيًا على منع النسخ عند الارتباط بمشغلي LexA الواقعين بين صندوق TATA وتسلسل تنشيط المنبع (UAS) الخاص بالمراسل. المراسل المستخدم لهذا الاختبار هو مراسل lacZ في البلازميد pJK101. يختلف بلازميد URA3 2 & # 181 هذا عن pSH18-34 في أن GAL1 UAS يقع في الجزء العلوي من مشغلي LexA. ينشط GAL1 UAS مراسل lacZ على مستوى عالٍ في وجود الجالاكتوز ، وبالنسبة لهذا المشتق المعين ، فإنه ينشط أيضًا عند مستوى منخفض في الخميرة المزروعة على الجلوكوز. أي قدر من قمع GAL UAS بواسطة الطعم ، سواء في الجالاكتوز أو الجلوكوز ، يشير إلى أن الطعم يدخل النواة ويحتل مشغلي LexA.

          بروتوكول 2 مقايسة القمع

          • وسائط YPD السائلة
          • وسائط التسرب السائل (Glu ura- ، Glu ura-his-)
          • ألواح التسرب (Glu ura- ، Glu ura-his-)
          • لوحات X-Gal (Glu ura-his- X-Gal ، Gal / Raf ura-his- X-Gal)
          • سلالة الخميرة EGY48 أو سلالة ذات صلة
          • URA3 2 & # 181 lacZ اختبار قمع مراسل البلازميد pJK101
          • HIS3 2 & # 181 طعم بلازميد يعبر عن بروتين الطعم الخاص بك مدمجًا في LexA
          • اثنان من بلازميدات الطعم للتحكم HIS3 2 & # 181: أحدهما يشفر LexA مدمجًا في بروتين خامل نسبيًا ، مثل Bicoid في pRFHM1 ، أو LexA-Max (Zervos et al. ، 1993) ، والآخر لا يشفر LexA ، على سبيل المثال pRFHM0.

          1. قم بتحويل EGY48 باستخدام pJK101 وحدد المحولات على ألواح Glu ura.

          2. اجمع ثلاث مستعمرات من هذه الصفائح وقم بتحويلها باستخدام بلازميد الطعم HIS3 (وبلازميدات التحكم HIS3). Select transformants on Glu ura-his- plates.

          3. Pick four individual colonies from each transformation and streak a patch of them onto Glu ura-his- and Gal/Raf ura-his- plates containing X-Gal. Incubate at 30oC.

          4. Examine the X-Gal plates after 1, 2, and 3 days. Yeast lacking LexA will begin to turn blue on the Gal/Raf plates after one day and will appear light blue on the glucose plates after two or more days. Yeast containing a bait that enters the nucleus and binds operators will turn blue more slowly than the yeast lacking LexA.

          5. Baits that repress transcription of lacZ in pJK101 by 2-fold or less may not cause a visible reduction in blue on X-Gal plates. If no repression is observed on the X-Gal plates, perform the more sensitive liquid ß-galactosidase assays with transformants from step 2. Grow the transformants in 5 ml Glu ura-his- and Gal/Raf ura-his- liquid media, or on Glu ura-his- and Gal/Raf ura-his- plates for 2 days, before doing ß-galactosidase assays (Miller, 1972).

          An ideal bait protein for an interactor hunt is one that does not itself activate transcription but does repress in the repression assay. It is also useful to verify that the full-length fusion protein is made. In some instances, proteases in yeast will cleave specific portions of a bait, leaving a truncated LexA fusion that still binds to operators. To demonstrate that the full-length bait protein is made one can perform a Western blot on extracts from yeast cells that harbor the bait plasmid, immunoblotting with either an antibody to LexA or one specific to the protein fused to LexA. The simplest way to do this is to prepare yeast cell extracts by growing yeast in liquid culture (lacking histidine to maintain selection for the bait plasmid) to OD 600 = 0.5, spinning 1 ml of the

          culture to pellet the cells, and resuspending the cells in 50 m l of 2X Laemmli sample buffer (Laemmli, 1970). The cells can then be broken by freezing on dry ice followed by boiling for 5 min prior to loading on an SDS polyacrylamide gel (about 15 m l/lane). The proteins can then be transferred to a filter and blotted with standard immunoblotting (Western) methods (Ausubel et al., 1987-1996 Harlow and Lane, 1988).

          C. Screening a library for interactors

          Most cDNA libraries available for the Brent lab version of the yeast two-hybrid system contain over 10 6 individual cDNAs (in plasmid pJG4-5). In theory, a library with 10 6 individual cDNAs includes cDNAs for messages that were more frequent than 1 in 10 6 mRNA molecules in the mRNA population used to make the library. To have a chance at isolating the rarest cDNAs in a library, it is important to collect more yeast transformants than there are individual cDNAs in the library. Thus, for a library with 10 6 individual cDNAs, one might try to obtain 2-3 x 10 6 yeast transformants. With the most common yeast two-hybrid strains one can obtain up to 10 5 transformants per µg of library plasmid DNA using the attached transformation protocol.

          A pilot transformation should be performed with the selection strain to determine the transformation efficiency that can be obtained. This allows one to calculate how many individual transformations to set up to obtain the desired number of total transformants. The transformation mixes are plated onto 22cm x 22cm Glu ura-his-trp- plates, attempting to get 1-2 x 10 5 transformants/plate. Again, the number of individual transformation mixes to put on each plate is calculated from the expected transformation efficiency derived from pilot experiments. The transformants are collected and stored frozen. Aliquots are then plated to ura-his-trp-leu- Gal/Raf plates to select interactors.

          Protocol 3 Transforming the selection strain and selecting potential interactors

          • Liquid dropout media (Glu ura-his-, Gal/Raf ura-his-trp-)
          • Dropout plates (Glu ura-his-trp-, Gal/Raf ura-his-trp-leu-, Glu ura-his-trp-leu-)
          • X-Gal plates (Glu ura-his-trp- X-Gal, Gal/Raf ura-his-trp- X-Gal)
          • Sterile water
          • Sterile glycerol solution (65% (v/v) glycerol, 0.1 M MgSO4, 25 mM Tris-HCl 7.4).
          • Glass beads (4 mm diameter Fisher Scientific), sterilized by autoclaving.
          • Sterile 50 ml Falcon tubes
          • Sterile 50 ml round-bottom polypropylene centrifuge tubes

          1. Using the selection strain prepared in Protocol 1, perform pilot transformations (as suggested in Protocol 1 step 2) to determine transformation efficiency.

          2. Based on your transformation efficiency, calculate the number of transformations to obtain the desired number of total transformants (i.e., each transformation = 1 µg library DNA/50 µl of cells as described in the transformation protocol). Also, calculate the number of transformations to be plated on each 22cm x 22cm Glu ura-his-trp- plate to get 1-2 x 10 5 transformants/plate (e.g., if your efficiency in pilot experiments is 5 x 10 4 transformants/µg you should set up 2 transformations for each 22cm x 22cm plate).

          3. Based on the above calculations, grow the appropriate amount of the selection strain in liquid Glu ura-his- medium and set up the necessary number of transformations (see attached transformation protocol).

          4. After the heat shock, invert the tubes several times to mix - gently. Remove 10 µl from several of the transformation mixes and make three dilutions (10 -1 , 10 -2 and 10 -3 ) each in sterile water. Plate 100 m l of each dilution onto 100 mm diameter Glu ura-his-trp- plates and incubate at 30oC. This will allow the total number of transformants to be calculated.

          5. Plate the remainder of the transformation mixes (less then 2 ml total/plate) onto 24cm X 24cm Glu ura-his-trp- plate. There is no need to spin the cells or remove the PEG. The medium in these plates should be at least 0.6 cm thick, level, and free of bubbles. To achieve an even distribution of cells, pour about 100 sterile glass beads (4 mm diameter) onto the plate with the cells. Gently roll the beads around the plate to distribute the transformation mix, then pour the beads off, or onto the next plate. This technique works best when the surface of the plates is not too wet so that the medium absorbs the transformation mix. To achieve this moisture content, put newly solidified plates into a laminar flow hood with the lids ajar for about 1 h before plating.

          6. Incubate the plates at 30oC. Colonies should appear after about 24 h. Continue incubation until colonies are 1 - 2 mm in diameter, which should take a total of approximately 2 days.

          7. Place the plates at 4oC for 2 - 4 hours to harden the agar. Using the long edge of a sterile 75mm x 50mm glass microscope slide (and sterile technique!), scrape the yeast from the plate. Try not to scrape any agar as this will interfere with pipetting. Collect the yeast from the glass slide by wiping it on the lip of a sterile 50 ml Falcon tube.

          8. Wash the cells twice with 2 or 3 volumes of sterile TE. It may be necessary to split into two or more tubes to effectively pellet. It is best to pellet the cells each time in a sterile round bottom polypropylene tube at 2000 g for 4 min so they may be easily resuspended. The pellet volume for 500,000 transformants will be about 8 ml.

          9. Resuspend the cells thoroughly by swirling in 1 pellet volume of sterile glycerol solution. Mix well by vortexing on low speed. Freeze 1 ml aliquots at -70oC.

          10. Determine the plating efficiency by thawing an aliquot of library transformants and making serial dilutions in sterile water. Plate 100 m l of each dilution onto 100 mm diameter Gal/Raf ura-his-trp- plates. Count the colonies that grow after 2 - 3 days at 30oC. Represent the plating efficiency in c olony f orming u nits (CFU) per unit volume of frozen cells. Note: to save time one can estimate the plating efficiency as

          108 CFU/100 m l, and immediately proceed to steps 11 and 12. Once the actual plating efficiency is known, calculate the number of CFU that were actually plated in steps 11 and 12.

          11. Thaw a 1 ml aliquot of transformed yeast and dilute 10-fold into 9 ml Gal/Raf ura-his-trp- liquid medium. Incubate at 30oC with shaking for 6 to 8 h to induce the GAL1 promoter and expression of the library encoded proteins. Pellet the cells by centrifugation at 2000 g for 4 min at 20 - 25oC and resuspend in 10 ml sterile water.

          13. Plate less than 106 CFU (determined from the plating efficiency test in step 10) onto each 100 mm diameter Gal/Raf ura-his-trp-leu- plates. To avoid overcrowding of Leu+ colonies, do not plate more CFU than are expected to produce

          20 background Leu+/plate (as determined in Protocol 1). Incubate the selection plates at 30oC. Colonies should appear in 2 - 5 days. To keep the plates from drying out after two days, it may be helpful to put them in plastic bags or containers, or put parafilm around each plate.

          14. Pick colonies (see discussion below for number to pick) with sterile toothpicks or applicator sticks and patch, or streak for single colonies, onto another Gal/Raf ura-his-trp-leu- plate. If the Leu+ colonies are closely spaced it will be necessary to streak purify to single colonies to separate the different Leu+ clones. Ideally the Leu+ yeast should be streaked for single colonies to isolate them from contaminating Leu- yeast. However, when there are large numbers of Leu+ colonies to pick, it may be inconvenient to streak purify every one in this case, growing patches on a second selection plate will at least enrich for the Leu+ cells.

          15. To show that the Leu+ phenotype is galactose-dependent, patch (or replica plate) the Leu+ yeast onto Glu ura-his-trp- master plates to turn off the GAL1 promoter and stop expression of the activation-tagged cDNA protein. Grow at 30oC for about 24 h.

          16. Replica the master plates to the following five plates, in order: 1. Gal/Raf ura-his-trp- X-Gal 2. Glu ura-his-trp- X-Gal 3. Glu ura-his-trp-leu- 4. Gal/Raf ura-his-trp-leu- 5. Glu ura-his-trp-. Incubate at 30oC and examine the results after 1, 2, and 3 days.

          17. Pick only those yeast that are Leu+ on galactose but not glucose. Keep in mind that if Leu+ clones were not purified in step 14, some patches may be contaminated with background Leu+ yeast, which will not be galactose-dependent. The galactose-dependent Leu+ phenotype indicates that reporter activation depends on expression of the library protein. Further characterize these by isolating the library plasmid and determining the interaction specificity.

          Alternate protocol - liquid selection and amplification of Trp+ library transformants. We have had some success at selecting and amplifying library transformants in liquid culture (M. Kolonin and R. Finley, unpublished). To do this, we dilute individual transformation mixes after heat shock (from Protocol 3 step 4) 50-fold into liquid Glu ura-his-trp- medium and grow shaking at 30 o C until the OD 600 is

          2.0 The OD 600 of this culture begins at less than 0.2 and usually takes 30-48 hours to reach 2.0. We then harvest the cells and proceed as in Protocol 3 step 8. By removing aliquots immediately after dilution and before harvesting and plating on Gal/Raf-ura-his-trp- we have estimated that transformants are amplified approximately 100-fold in this procedure. This approach eliminates the cost and inconvenience of selecting transformants on plates. The disadvantage is that there is no reliable way to verify that library transformants are evenly amplified.

          How many Leu+ colonies should be picked? When considering how many Leu+ colonies to pick at step 14 of Protocol 3, it is important to take into account the background frequency of Leu+ colonies that the bait itself produces (represented as Leu+ colonies/CFU), as determined in Protocol 1, and the total number of library transformants obtained. To completely screen all of the library transformants, the minimum number of Leu+ colonies one would need to pick and characterize can be estimated by:

          # to pick > (# Leu+ colonies/CFU) X (total # of library transformants)

          If, for example, the background for a given bait were 10 -5 Leu+ colonies/CFU, one would need to pick and characterize at least 10 colonies to screen through 10 6 library transformants. More to the point, the first 10 colonies picked would be expected to be background, so to get an interactor that is rare in the library one might need to pick and characterize 20 or 30 Leu+ colonies.

          Should galactose-dependent Leu+ colonies that do not turn blue on the X-Gal plates be further characterized? نعم فعلا. Of the galactose-dependent positives, several different classes of Leu and lacZ phenotype are possible. على سبيل المثال:

          Class I. galactose-dependent Leu+ galactose-dependent dark blue on X-Gal

          الفئة الثانية. galactose-dependent Leu+ galactose-dependent light blue on X-Gal

          الفئة الثالثة. galactose-dependent Leu+ white on X-Gal

          Many hunts will yield Leu+ colonies from each class. Often this indicates that at least three different interactors are represented among the positives. A common mistake is to concentrate on only the "strongest" class (Class I above) and ignore the "weaker" class (Class III) which can include biologically significant interactors (Finley et al., 1996).

          The next step for the galactose-dependent positives is to isolate the library plasmid from each and re-introduce it into the selection strain to show that the putative interaction phenotype depends on the library plasmid and not on mutations in the yeast or reporter genes. This test can often be performed at the same time as the specificity test described below. If the library has been properly screened to exhaustion, each interactor cDNA should be represented more than once in the putative positives. cDNAs corresponding to abundant messages may have been isolated many times. To reduce the amount of work in subsequent steps it is useful to determine which yeast contain identical cDNAs. This can be easily done by performing PCR with primers flanking the cDNA insertion site using DNA template from a quick yeast miniprep (Finley and Brent, 1995). PCR products can be digested with HaeIII and AluI and run on an agarose gel to reveal unique restriction fragment patterns for each cDNA (Finley and Brent, 1995). One or two of each unique library plasmid can then be rescued in E.coli and used in the specificity test.

          D. Determining the specificity of interactors

          Many of the proteins identified in interactor hunts are non-specific interactors: they appear to interact with a number of different unrelated LexA fusions. Non-specific interactors are frequently isolated in hunts using unrelated baits. They can be identified and discarded by testing the ability of the cDNA-encoded proteins to interact with a handful of bait proteins unrelated to the original bait. cDNA-encoded proteins that interact only with the original bait and not with unrelated baits are considered true specific interactors. The specificity test can be performed by introducing rescued library plasmids into different selection strains that each harbor a different bait plasmid. Transformants are picked and patched onto a Glu ura-his-trp- plate and then replica plated to indicator plates as in Protocol 2 steps 15 and 16. This method of testing specificity can be somewhat cumbersome if a large number of different library plasmids were isolated, and if these are to be tested for interaction with several different baits. For this reason we use the interaction mating assay (Finley and Brent, 1994) to perform the specificity test, as described in Protocol 3.

          Interestingly, the commonly isolated non-specific interactors, which include heat shock proteins, ribosomal proteins, proteasome subunits, and other proteins, are not isolated in every interactor hunt, and in fact do not appear to interact with every bait. This highlights the importance of using several different bait proteins to test the specificity of an interactor. For example, frequently a non-specific interactor will interact with just 30% of the bait proteins tested. If only one or a few bait proteins are tested, a non-specific interactor could appear to be specific.

          Protocol 4 The interaction mating assay

          • Rescued library plasmid DNA
          • Liquid YPD medium
          • Liquid dropout media (Glu ura-)
          • YPD plates
          • Dropout plates (Glu trp-, Glu ura-his-, Glu ura-his-trp-, Gal/Raf ura-his-trp-leu-, Glu ura-his-trp-leu-)
          • X-Gal plates (Glu ura-his-trp- X-Gal, Gal/Raf ura-his-trp- X-Gal)
          • Applicator sticks (e.g. FisherBrand 01-340), or toothpicks, sterilized by autoclaving.
          • Replica plating apparatus and sterile velvets or filters.
          • Yeast strain RFY231 (MAT a ura3his3 leu2 ::3LexAop- LEU2 trp1::hisG LYS2) or EGY48. Note: RFY231 is EGY48 with the trp1-1 allele deleted (R. Finley, unpublished).
          • Bait strains: S. cerevisiae strain RFY206 (MATa ura3-52 his3Æ200 leu2-3 lys2Æ201 trp1::hisG ) transformed with a URA3 plasmid containing a lacZ reporter, such as pSH18-34, and various HIS3 bait plasmids, such as derivatives of pEG202 that produce different LexA fusions. Each bait strain will contain a different bait plasmid. One strain should contain the original bait used in the interactor hunt.

          1. Transform yeast strain RFY231 with the rescued TRP1 library plasmids and select transformants on Glu trp- plates (if EGY48 is substituted for RFY231, more than one Trp+ transformant should be analyzed to ensure than a trp1-1 revertant has not been selected). As a control, transform RFY231 with a library plasmid pJG4-5 that has no cDNA insert.

          2. Use sterile applicator sticks or toothpicks to streak individual RFY231 transformants onto standard 100 mm Glu trp- plates in parallel lines (see Figure 1). Streaks should be at least 3 mm wide and at least 5 mm apart, with the first streak starting about 15 mm from the edge of the plate. A 100 mm plate will hold up to 8 different bait strains. Include at least one streak of the transformants with the control plasmid (no cDNA). Create a duplicate plate of streaked RFY231 transformants for each plate of bait strains to be used.

          3. Likewise, streak different bait strains in vertical parallel stripes on a Glu ura-his- plate. Create a duplicate plate of bait strains for each different plate of prey strains to be used. Incubate both sets of plates at 30oC until growth is heavy. When taken from reasonably fresh cultures (for example, plates that have been stored at 4oC for less than a month) streaked RFY206-derived bait strains take about 48 hours to grow and RFY231-derived strains take about 24 hours.

          4. Print the RFY231 derivatives and the RFY206 derivatives onto the same replica filter or velvet so that the streaks from the two plates are perpendicular to each other (see Figure 1).

          5. Lift the print of the two strains from the filter or velvet with a YPD plate. Incubate the YPD plate at 30oC overnight. Diploids will form where the two strains intersect. One strain may grow more rapidly than the other during this time but this does not hinder formation of diploids in the intersections.

          6. Replica from the YPD plate to the following indicator plates, in order: 1. Gal/Raf ura-his-trp- X-Gal 2. Glu ura-his-trp- X-Gal 3. Glu ura-his-trp-leu- 4. Gal/Raf ura-his-trp-leu- 5. Glu ura-his-trp-. Incubate at 30oC and examine the results after 1, 2, and 3 days. Only diploids will grow on the X-Gal plates and only interactors will grow on galactose plates lacking leucine (Figure 1).

          What next? Although the methods described above allow several types of false positive to be eliminated, they do not address the biological significance of the interactions observed. In some instances the sequence of a specific interactor will suggest that its interaction with the bait may have a real in vivo function. However, two-hybrid interactions can occur between proteins that normally do not interact (for example, because they are never expressed at the same time or in the same tissue or subcellular compartment). A good first step to show biological significance is to verify the interaction by a different, biochemical technique, preferably co-precipitation from a cell in which both proteins are expressed. Ideally, the next step would involve a functional assay for the new protein, to show, for example, that the new protein is involved in the same biological process as the bait protein. The following two sections include a few additional ways to address function.

          رابعا. TWO-HYBRID METHODS TO STUDY LARGE SETS OF PROTEINS AND PROTEIN NETWORKS

          Finding interacting partners can reveal much about the function of a protein. Most regulatory proteins, for example, appear to function by contacting other proteins. This is true for proteins that regulate many different cellular processes, including transcription, translation, DNA replication, signal transduction, cell cycling, differentiation, and programmed cell death. All of the proteins involved in a given process together can be thought of as a network of interacting proteins. The members of each interacting network are linked through protein-protein contacts. A complete understanding of any given process can only be achieved when all of the components of the protein network regulating it are identified. Yeast two-hybrid systems offer approaches to characterizing individual interactions and whole networks of proteins.

          Isolating a new interacting protein can reveal information about function if the sequence of the new interactor indicates similarity or identity with a protein whose function has been at least partially characterized. However, it is still often the case that the sequence of a interacting protein reveals little about its function. Another approach is to assume that the new protein functions in the same network as the original bait protein and to use the new protein as a bait to identify other members of the network. Repeating this process increases the chances of isolating a previously characterized protein, or one whose sequence provides clues to function. In principle, this approach could be used repeatedly to isolate all of the components of a regulatory network. Because some regulatory proteins may be shared by different cellular processes (e.g. regulation of cell cycle and DNA replication by p21 CIP1 (Li et al., 1994)), and networks for many different processes may be connected (e.g. a signal transduction pathway and the activation of gene transcription), this approach could identify many expressed genes from a small number of starting points.

          An approach complementary to performing sequential hunts is to use the interaction mating assay to look for interactions between increasingly large sets of proteins (Bartel et al., 1996 Finley and Brent, 1996). In one variation of this approach, large panels of baits are collected in baits strains placed on plates in grids (e.g., in the standard 96-well format). The grids can then be screened simultaneously for interactions with individual prey proteins. Bait strains can be created as described in Protocol 4 using bait plasmids that express various proteins of known and unknown function. Large panels of bait strains can be collected and stored frozen indefinitely and then screened against any number of prey strains.

          One such collection contains over 700 different bait proteins from our own work and from numerous other labs that use the interaction trap. Screening a protein against such a panel enables one to quickly test its ability to interact with a large number of known proteins, most of which have been characterized to some extent, and have been chosen for study because of their known or suspected involvement in some biological process. Thus, finding an interaction between a tested protein and a member of the panel often gives an immediate clue about the biological function of both proteins. While the number of proteins in any such panel is far less than the number of proteins in a good library, this approach does offer the advantage of screening the test protein against a set of proteins enriched for those of current interest to the biological community. More restricted panels of bait proteins, for example those known or suspected to function in a particular pathway, or those isolated in sequential interactor hunts, can provide a useful resource for characterizing new proteins. Such a panel may also be useful to characterize differences in the patterns of interactions made by wild-type and mutant variants of proteins such as those created in vitro or associated with particular diseases or other phenotypes.

          For some proteins, this approach offers additional advantages over screening a library using a traditional two-hybrid scheme. Proteins that activate transcription when fused to LexA or another DNA-binding domain can be difficult to use in conventional interactor hunts. Though methods are available to reduce the sensitivity of the reporter genes (Durfee et al., 1993 Estojak et al., 1995) it is not always possible to reduce the reporter sensitivity below the threshold of activation for some baits. Moreover, reduction in reporter sensitivity carries with it the risk that the reporters will not detect weakly interacting proteins. Thus, an alternative for proteins that activate transcription as baits, is to use them as preys to screen existing panels of baits, or even libraries of baits. Interaction mating approaches also have clear advantages for proteins that are somewhat toxic to yeast the prey vector allows conditional expression of toxic proteins in the presence of a bait, and often the interaction can be observed because the reporters are activated even if the cells subsequently become inviable.

          V. TESTING THE FUNCTION OF INDIVIDUAL INTERACTIONS

          Finding the position of a protein within a network of interacting proteins can provide information about the function of the protein and the network. However, ultimately, the nature of each individual protein-protein contact must be understood. Several two-hybrid methods allow the significance of individual protein interactions to be analyzed.

          A. Mapping interaction domains

          Determining the domains within a protein that are responsible for its interaction with other proteins can provide a valuable insight into the way a protein functions. Several approaches are available to map interaction domains with yeast two-hybrid methods. All start with a bait protein and prey protein that interact and activate the reporter genes. Derivatives of one of these proteins are constructed and tested for interaction with the other. We usually make derivatives of the prey protein because derivatives of the bait protein may differ in their ability to activate the reporters by themselves, which complicates interpretation of the results. Derivatives of the prey protein can be made and tested for interaction with the bait in several ways. In any approach it is important to keep in mind that the prey is a fusion to an N-terminal activation domain and must be maintained in the correct reading frame. One approach is to subclone restriction fragments encoding parts of the prey fusion protein into the prey vector (i.e., pJG4-5 or derivative) and introduce the resulting vectors individually into selection strains harboring the bait vector or control vectors. Alternatively, derivatives can be tested for interaction using the mating assay as described in Protocol 4. A second approach is to make N-terminal or C-terminal deletion derivatives of the prey fusion protein and test them for interaction with the bait, again by individual transformation into selection strains or by the mating assay. Deletion derivatives can be constructed in a cloning vector (Ausubel et al., 1987-1996), and then subcloned into the prey vector, pJG4-5. Alternatively, the deletion derivatives can be constructed directly in a derivative of the prey vector. For example, pZP4-5o and pJF3 are derivatives of pJG4-5 that have unique, rare restriction sites downstream of the cDNA cloning sites which allow C-terminal deletions to be constructed by unidirectional exonuclease III digestion from the 3' end of the insert (R. Finley, Z. Paroush, and J. Fonfara, unpublished). Similarly, pJF2 contains unique 5' restriction sites that allow N-terminal deletions to be constructed. A third approach is to make random DNA fragments encoding parts of the prey protein, for example by sonication (e.g., ref. (Stagljar et al., 1996), and insert these into the prey vector. Finally, a variety of techniques are available to make single and multiple point mutations of one interactor, which can then be inserted into the prey vector to test for interaction with a bait.

          B. Construction of dominant negative mutants

          A powerful approach to understanding protein function is to create and express dominant negative forms of the protein that inactivate the function of the wild-type version (Herskowitz, 1987). The yeast two-hybrid system provides a method to design and assay potential dominant negatives. One type of dominant negative is a protein mutated so that it still interacts with one of its protein partners but lacks other functional domains. In this case the "partner" could be another protein or the same protein if it forms homodimers. Expression of the mutant form of the protein might be expected to bind to the partner protein and make it inaccessible to the wild-type version. One way to create such a mutant is to isolate the minimal domain of a protein that will interact with another protein partner as described in the previous section. If the interacting domain is just a fraction of the protein it would be expected to lack other functional domains, and would therefore be a candidate dominant negative. A related but more precise approach could be used for proteins that have at least two different known partners. For example, if protein A interacts with both proteins B and C, mutant varieties of protein A could be constructed and tested in the two-hybrid assay for their ability to interact with just protein B but not protein C. In this case, we would have precise knowledge of the function missing in the dominant negative (interaction with protein C).

          It is worth noting that, while the dominant negative effect is frequently open to multiple interpretations (Herskowitz, 1987), functional inferences from the type of dominant negatives referred to here may be less uncertain. This is because we know that the dominant negative interferes with a specific protein interaction we have designed it that way and tested it in the two-hybrid system.

          C. Disrupting protein interactions

          The yeast two-hybrid system provides an assay to develop reagents that disrupt protein interactions. Such reagents can be used in vivo to probe the function of individual protein interactions. Frequently a protein makes functional contacts with several other proteins. For example, the catalytic subunit of a protein kinase may interact with one or more regulatory subunits and with substrates. Deletion of the gene encoding the kinase could provide information about the function of the protein as a whole, but would not provide information about the individual interactions that it makes with other proteins. As mentioned in the previous section, certain types of dominant negative mutants may be created that interfere with specific interactions made by a wild-type protein. In the kinase example, a dominant negative kinase might be created that interacts with its regulatory subunit but not its substrate such a mutant would be expected to compete with the wild-type kinase for regulatory subunits.

          Another type of potential disrupter of protein interactions that can be identified with the two-hybrid system is a peptide that interacts tightly and specifically with one of a pair of interacting proteins. Such peptides have been isolated from a random peptide library using the interaction trap yeast two-hybrid system as described by Colas et al. (Colas et al., 1996). These authors created a peptide library using a plasmid related to pJG4-5 that expressed random peptides fused to an activation domain and an inert platform molecule, E.coli thioredoxin. To find peptides that interact specifically with a bait protein an interactor hunt is performed as described in Protocol 2. Some of the specific peptides, called aptamers , would be expected to interact with surfaces of the bait that are required for interactions with other proteins. These are potential disrupters of specific protein interactions.

          A two-hybrid assay can also be used to show that a potential disrupter can interfere with a protein-protein interaction. The two proteins can be expressed, one as a bait and one as a prey, and then the potential disrupter can be expressed to see if it reduces the ability of the bait and prey to interact and activate a reporter. We developed a method to test whether an interacting domain or a peptide aptamer can disrupt specific interactions (M. Kolonin and R. Finley, unpublished). A potential disrupter is first isolated as an interactor. The library plasmid expressing the potential disrupter is isolated and used to transform RFY231, and these transformants are mated with a special bait-prey interaction strain as described in Protocol 4. In this case, however, the bait strain expresses the original bait as a prey (activation domain fusion) from plasmid pMK1, and a protein that interacts with it as a bait. Disruption of the interaction results in loss of LEU2 transcription and inability to grow on leu- plates.

          The methods outlined here present an integrated approach to understanding the function of proteins, protein interactions, and networks of proteins. First, all of the potential partners of a protein thought to be involved in a particular biological process can be identified. Second, many additional members of the same regulatory network can be identified in successive interactor hunts. Third, interaction domains can be mapped. Fourth, mutants incapable of specific interactions can be identified, and in many cases these mutants can be expressed in vivo to provide functional information. Finally, reagents can readily be developed that disrupt specific protein interactions, and then can be used to probe the function of these interactions in vivo .

          I thank Mikhail Kolonin, Jennifer Fonfara, and Catherine Nelson, for providing comments, and Mikhail Kolonin and members of the Finley lab for contributions to the protocols. I also thank the members of the Brent lab for their many contributions to the protocols. I especially thank Roger Brent who co-wrote previous versions of the interactor hunt protocols.

          Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Morre, D., Seidman, J. G., and Struhl, K. (1987-1996). Current protocols in molecular biology (New York: Greene and Wiley-interscience).

          Bartel, P. L., Roecklein, J. A., SenGupta, D., and Fields, S. (1996). A protein linkage map of Escherichia coli bacteriophage T7. Nature Genetics 12 , 72-77.

          Brent, R., and al., e. (1997). http://xanadu.mgh.harvard.edu/brentlabhomepage4.html. web site.

          Colas, P., Cohen, B., Jessen, T., Grishina, I., McCoy, J., and Brent, R. (1996). Genetic selection of peptide aptamers that recognize and inhibit cyclin- dependent kinase 2. Nature 380 , 548-550.

          Durfee, T., Becherer, K., Chen, P.-L., Yeh, S.-H., Yang, Y., Kilburn, A. E., Lee, W.-H., and Elledge, S. J. (1993). The retinoblastoma protein associates with the protein phophatase type 1 catalytic subunit. Genes and Dev. 7 , 555-569.

          Estojak, J., Brent, R., and Golemis, E. A. (1995). Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Mol Cell Biol 15 , 5820-5829.

          Finley, R. L., Jr., and Brent, R. (1994). Interaction mating reveals binary and ternary connections between Drosophila cell cycle regulators. Proc Natl Acad Sci U S A 91 , 12980-12984.

          Finley, R. L., Jr., and Brent, R. (1995). Interaction trap cloning with yeast. In DNA Cloning, Expression Systems: A Practical Approach, B. D. Hames and D. M. Glover, eds. (Oxford: Oxford University Press), pp. 169-203.

          Finley, R. L., Jr., and Brent, R. (1996). Two-hybrid analysis of genetic regulatory networks. In The yeast two-hybrid system, P. L. Bartel and S. Fields, eds. (أوكسفورد: مطبعة جامعة أكسفورد).

          Finley, R. L., Jr., Thomas, B. J., Zipursky, S. L., and Brent, R. (1996). Isolation of Drosophila cyclin D, a protein expressed in the morphogenetic furrow before entry into S phase. بروك. ناتل. أكاد. علوم. USA 93 , 3011-3015.

          Finley, R. L. J., and al., e. (1997). http://cmmg.biosci.wayne.edu/rfinley/finlab/finlab-home.html. web site.

          Guthrie, C., and Fink, G. R. (1991). Guide to yeast genetics and molecular biology. In Methods in enzymology (Boston: Academic Press, Inc.).

          Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H., and Brent, R. (1993). Cdi1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75 , 791-803.

          Harlow, E., and Lane, D. (1988). Immunoblotting. In Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory), pp. 471-510.

          Herskowitz, I. (1987). Functional inactivation of genes by dominant negative mutations. Nature 329 , 219-22.

          Laemmli, U. K. (1970). انقسام البروتينات الهيكلية أثناء تجميع رأس العاثية T4. Nature 227 , 680-685.

          Li, R., Waga, S., Hannon, G. J., Beach, D., and Stillman, B. (1994). Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication. Nature 371 , 534-537.

          Mendelsohn, A. R., and Brent, R. (1994). Applications of interaction traps/two-hybrid systems to biotechnology research. بالعملة. أب. Biotechn. 5 , 482-486.

          Miller, J. (1972). Experiments in molecular genetics (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory).

          Stagljar, I., Bourquin, J. P., and Schaffner, W. (1996). Use of the two-hybrid system and random sonicated DNA to identify the interaction domain of a protein. Biotechniques 21 , 430-432.

          Zervos, A. S., Gyuris, J., and Brent, R. (1993). Mxi1, a protein that specifically interacts with Max to bind Myc-Max recognition sites. Cell 72 , 223-32.


          إنتاج اللقاحات والمضادات الحيوية والهرمونات

          Traditional vaccination strategies use weakened or inactive forms of microorganisms to mount the initial immune response. Modern techniques use the genes of microorganisms cloned into vectors to mass produce the desired antigen. Doctors then introduce the antigen into the body to stimulate the primary immune response and trigger immune memory. The medical field has used genes cloned from the influenza virus to combat the constantly changing strains of this virus.

          Antibiotics are a biotechnological product. Microorganisms, such as fungi, naturally produce them to attain an advantage over bacterial populations. Cultivating and manipulating fungal cells produces antibodies.

          Scientists used recombinant DNA technology to produce large-scale quantities of human insulin in بكتريا قولونية as early as 1978. Previously, it was only possible to treat diabetes with pig insulin, which caused allergic reactions in humans because of differences in the gene product. In addition, doctors use human growth hormone (HGH) to treat growth disorders in children. Researchers cloned the HGH gene from a cDNA library and inserted it into بكتريا قولونية الخلايا عن طريق استنساخها في ناقلات بكتيرية.

          In Summary: Medicinal Biotechnology

          Transgenic organisms possess DNA from a different species, usually generated by molecular cloning techniques. Vaccines, antibiotics, and hormones are examples of products obtained by recombinant DNA technology. Transgenic plants are usually created to improve characteristics of crop plants.


          التكنولوجيا الحيوية الزراعية

          Biotechnology in agriculture can enhance resistance to disease, pest, and environmental stress, and improve both crop yield and quality.

          Transgenic Animals

          Although several recombinant proteins used in medicine are successfully produced in bacteria, some proteins require a eukaryotic animal host for proper processing. For this reason, the desired genes are cloned and expressed in animals, such as sheep, goats, chickens, and mice. Animals that have been modified to express recombinant DNA are called transgenic animals. Several human proteins are expressed in the milk of transgenic sheep and goats, and some are expressed in the eggs of chickens. Mice have been used extensively for expressing and studying the effects of recombinant genes and mutations.

          Transgenic Plants

          Figure 1. Corn, a major agricultural crop used to create products for a variety of industries, is often modified through plant biotechnology. (credit: Keith Weller, USDA)

          Manipulating the DNA of plants (i.e., creating GMOs) has helped to create desirable traits, such as disease resistance, herbicide and pesticide resistance, better nutritional value, and better shelf-life (Figure 1). Plants are the most important source of food for the human population. Farmers developed ways to select for plant varieties with desirable traits long before modern-day biotechnology practices were established.

          Plants that have received recombinant DNA from other species are called transgenic plants. Because they are not natural, transgenic plants and other GMOs are closely monitored by government agencies to ensure that they are fit for human consumption and do not endanger other plant and animal life. Because foreign genes can spread to other species in the environment, extensive testing is required to ensure ecological stability. Staples like corn, potatoes, and tomatoes were the first crop plants to be genetically engineered.

          Transformation of Plants Using أغروباكتريوم توميفاسيانز

          Gene transfer occurs naturally between species in microbial populations. Many viruses that cause human diseases, such as cancer, act by incorporating their DNA into the human genome. In plants, tumors caused by the bacterium أغروباكتريوم توميفاسيانز occur by transfer of DNA from the bacterium to the plant. Although the tumors do not kill the plants, they make the plants stunted and more susceptible to harsh environmental conditions. Many plants, such as walnuts, grapes, nut trees, and beets, are affected by A. الورم. The artificial introduction of DNA into plant cells is more challenging than in animal cells because of the thick plant cell wall.

          Researchers used the natural transfer of DNA from الأجرعية to a plant host to introduce DNA fragments of their choice into plant hosts. In nature, the disease-causing A. الورم have a set of plasmids, called the Ti plasmids (tumor-inducing plasmids), that contain genes for the production of tumors in plants. DNA from the Ti plasmid integrates into the infected plant cell&rsquos genome. Researchers manipulate the Ti plasmids to remove the tumor-causing genes and insert the desired DNA fragment for transfer into the plant genome. The Ti plasmids carry antibiotic resistance genes to aid selection and can be propagated in بكتريا قولونية cells as well.

          Flavr Savr Tomato

          The first GM crop to be introduced into the market was the Flavr Savr Tomato produced in 1994. Antisense RNA technology was used to slow down the process of softening and rotting caused by fungal infections, which led to increased shelf life of the GM tomatoes. Additional genetic modification improved the flavor of this tomato. The Flavr Savr tomato did not successfully stay in the market because of problems maintaining and shipping the crop. However, since that time numerous crop plants have been developed and approved for sale and consumption. Corn, soybeans, and cotton in particular have been widely adopted by U.S. farmers.


          Simple, rapid and reliable methods to obtain high quality RNA and genomic DNA from Quercus ilex L. leaves suitable for molecular biology studies

          Isolation of high-quality RNA and genomic DNA (gDNA) from many samples is a necessary step before accomplishing molecular biology studies. The particular composition of Quercus ilex leaves, specially hard and rich in cell wall material, polyphenolics and secondary metabolites, usually results in preparations contaminated with non-nucleic acid compounds. Although many methods have been developed, each case of study demands a protocol adapted to the specific plant sample and the pursued research objectives. We have evaluated several protocols to establish the methodology that best suited to our current genetic and molecular studies on Q. ilex. Our priority was to select the simplest methods reducing the plant starting material and the time employed, without compromising yield, quality and integrity of the isolated nucleic acids. Our results point to two protocols based on silica-membrane purification, as the most convenient for Q. ilex leaf tissue, and both procedures are greatly improved by adding insoluble polyvinyl polypyrrolidone during the isolation process. The protocols optimized here can be completed at the microfuge scale and allow a researcher to process 48 samples in 1 h, producing high quality preparations suitable for the routinely molecular biology applications with higher efficiency than other more labour and time-consuming protocols.

          هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


          شاهد الفيديو: cDNA. Complementary DNA (شهر نوفمبر 2022).