معلومة

بدائل الأحماض الأمينية بالقرب من بروتين HA في موقع ارتباط المستقبلات في سلالات الأنفلونزا من النوع A H3N2؟

بدائل الأحماض الأمينية بالقرب من بروتين HA في موقع ارتباط المستقبلات في سلالات الأنفلونزا من النوع A H3N2؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قرأت الورقة العلمية ، "البدائل بالقرب من موقع ربط المستقبلات تحدد التغيير الرئيسي للأنتيجين أثناء تطور فيروس الإنفلونزا" بقلم Björn F. Koel et al (http://science.sciencemag.org/content/342/6161/976).

في الورقة ، تشمل المواقف المهمة لانجراف مستضدات الأنفلونزا المواقف 109-301 ، مع التركيز بشكل خاص على المواقع 133 ، 144 ، 145 ، 155 ، 156 ، 158 ، 159 ، 189 ، 193.

ومع ذلك ، لم يذكر أي موضع في الورقة تحديدًا المواضع التي تشكل جزءًا من موقع ربط المستقبل وأيها قريب منه.

النطاق (109-301) واسع بعض الشيء لأنه يتضمن مواضع الأحماض الأمينية غير المهمة لمولد الضد. أود الحصول على قائمة بجميع بدائل AA المهمة جدًا (القريبة من موقع ربط المستقبلات) للمشاركة في مشروع المعلوماتية الحيوية. لا تتضمن قائمة مواقع الأحماض الأمينية ذات التركيز الخاص جميع الأحماض الأمينية القريبة من موقع الربط.

لنقل فكرة عن المشكلة ، إذا كان الموضع 155 مهمًا ، فهل يعني ذلك أن الموضع 156 مهم أيضًا؟

لا أعرف ما إذا كان الموضع 156 يعتبر "قريبًا" من موقع ربط المستقبلات.

هو موضع تقدير أي مساعدة.


إجابة مختصرة: نعم ، 156 تعتبر بشكل عام "قريبة" من بنك إسكتلندا الملكي ، على سبيل المثال في هذه الورقة يمكنك رؤيتها مخططة على الهيكل.

للحصول على إجابة أكثر عمومية ، ستحتاج إلى الجلوس والتحديق في النماذج ثلاثية الأبعاد من الهيماجلوتينين (هناك المئات في PDB) ، تمامًا مثل بقيتنا. مواقع ارتباط الجسم المضاد ليست سوداء وبيضاء ، والتفاعلات بين الإنفلونزا والأجسام المضادة معقدة للغاية. ما هو "القريب" في بعض السياقات قد يكون "بعيدًا" في سياقات أخرى.

قد تجد أداة تحديد سمات التسلسل في المقاطع في قاعدة بيانات أبحاث الإنفلونزا مفيدة ، لا سيما التعليق التوضيحي على هيماجلوتينين H3.

اعلم أن ترقيم الأحماض الأمينية قد يكون محيرًا ، لأن المجموعات المختلفة قد تستخدم نقاط بداية مختلفة. هناك اتفاق غامض على الترقيم "الصحيح" ، لكن هناك مجموعات قليلة تشدق به ثم ترقيم نسختها كيفما تشاء.


خلفية

يستمر فيروس الإنفلونزا في التأثير بشكل كبير على الصحة العالمية وهو مسؤول عن ملايين حالات أمراض الجهاز التنفسي ومئات الآلاف من حالات الاستشفاء سنويًا في الولايات المتحدة وحدها [1]. البروتينات السكرية المغلفة ، الهيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز (NA) ، تتوسط ارتباط الخلية المضيفة وإطلاقها ، على التوالي ، وهي الأهداف الأساسية للاستجابة المناعية الواقية بوساطة الجسم المضاد. يحتوي HA على مواقع مستضدات مناعية محددة وظيفيًا والتي تحدد بشكل أساسي المجال الكروي للبروتين السكري وتحيط بموقع ربط المستقبل (RBS) [2]. تتراكم فيروسات الإنفلونزا المنتشرة تدريجيًا طفرات HA ، بشكل أساسي في مواقع المستضدات المستهدفة من خلال تحييد الأجسام المضادة ، وتسمح هذه التغييرات في كثير من الأحيان بالهروب من الاستجابة المناعية للذاكرة بوساطة الجسم المضاد. تُعرف هذه العملية باسم "الانجراف" المستضدي ومن المحتمل أن تكون مدفوعة بالاختيار الذي تفرضه المناعة السائدة في المجتمع المضيف ، مما يؤدي إلى الحاجة إلى تحديث سلالات اللقاح بشكل دوري. يمكن لفيروس الإنفلونزا الهروب من استجابة الجسم المضاد من خلال الاستبدالات التي تحدث تغييرات توافقية في مواقع المستضد (الحواتم) ، وبالتالي الحد من ارتباط الجسم المضاد. علاوة على ذلك ، فإن تعديل شغف ارتباط مستقبلات HA الفيروسي يمكن أن يؤدي أيضًا إلى تغيير مستضد والهروب من تحييد الجسم المضاد [3 ، 4].

تستهدف العديد من منتجات الأدوية المضادة للفيروسات التي تم اعتمادها من قِبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية أو قيد التطوير للوقاية من عدوى فيروس الأنفلونزا أو علاجها ، البروتينات السكرية HA و / أو NA وتشمل مثبطات NA (NAI) والأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) واللقاحات. قد يتأثر نشاط هذه الأدوية واللقاحات بالتغيرات في جزيئات HA و NA الديناميكية المختارة من خلال الاستخدام السريري لهذه العوامل العلاجية. على سبيل المثال ، تم تحديد فيروسات الإنفلونزا مع بدائل الأحماض الأمينية و / أو عمليات الحذف المرتبطة بانخفاض القابلية للإصابة بمضادات الأكسدة غير المؤذية في دراسات اختيار ثقافة الخلايا ، والمرضى المعالجين بـ NAI ، وكذلك في الفيروسات المنتشرة من الأفراد غير المعالجين [5،6،7،8 ، 9 ، 10 ، 11]. أظهر التحليل الجيني أن انخفاض القابلية للإصابة بـ NAIs يرتبط بالطفرات في بروتينات NA و / أو HA الفيروسية والعديد من هذه الطفرات مدرجة في إدراج حزمة NAI [12 ، 13 ، 14]. على الرغم من أن الأساس الآلي للطفرات الناشئة عن علاج NAI في HA لم يتم تحديدها بعد ، فمن المحتمل أن تأثيرها المتوقع لخفض شغف ربط المستقبلات يعوض عن انخفاض نشاط NA [5،6،7،8،9،10،11] . تم توثيق الارتباط بين هروب الأجسام المضادة لـ HA وحدوث طفرات NA التعويضية التي تؤدي إلى اكتساب مقاومة NAI المتزايدة [15]. ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كانت طفرات HA المرتبطة بالاستخدام السريري لـ NAIs ترتبط بانخفاض التفاعل المناعي مع الأجسام المضادة المضادة للإنفلونزا. توضح الدراسة الحالية أن طفرات HA الناشئة عن علاج NAI يمكن أن تؤدي إلى ملفات تعريف مستضدية متغيرة وقد تؤثر بشكل محتمل على تثبيط الفيروس بوساطة الجسم المضاد.


ملخص المؤلف

يمكن أن يكون لأوبئة الإنفلونزا آثار مدمرة كما تم إثباته بشكل كبير من خلال ما يسمى بالإنفلونزا الإسبانية في عام 1918. وتحدث مثل هذه الأوبئة بسبب فيروسات الإنفلونزا الحيوانية أ (IAVs) التي تتكيف بشكل كافٍ مع البشر. يتضمن هذا التكيف ، من بين أمور أخرى ، تغييرًا في خصائص ارتباط مستقبلات الهيماجلوتينين الفيروسي (HA). اكتسبت بعض IAVs بالفعل القدرة على الارتباط بمستقبلات من النوع البشري عبر HA. نحن نقدم رؤى جديدة حول تطور مثل هذه الفيروسات ونوضح الدور الحاسم لزمالة المدمنين المجهولين هنا. من المتوقع أن تساهم هذه الدراسة في التعرف في الوقت المناسب على فيروسات الحيوانات ذات الإمكانات الحيوانية المتزايدة.

الاقتباس: Du W ، Wolfert MA ، Peeters B ، van Kuppeveld FJM ، Boons G-J ، de Vries E ، et al. (2020) يؤدي تحور الموقع الثاني المرتبط بحمض السياليك لفيروس الأنفلونزا أ إلى حدوث طفرات تعويضية في الهيماجلوتينين. بلوس باثوج 16 (8): e1008816. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008816

محرر: دانيال ر. بيريز ، جامعة جورجيا ، الولايات المتحدة

تم الاستلام: 27 مارس 2020 وافقت: 16 يوليو 2020 نشرت: 27 أغسطس 2020

حقوق النشر: © 2020 دو وآخرون. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

توافر البيانات: جميع البيانات ذات الصلة موجودة داخل المخطوطة وملفات المعلومات الداعمة الخاصة بها.

التمويل: تم دعم WD بمنحة شخصية من مجلس المنح الصينية (رقم الملف 201603250057). م. بدعم من مؤسسة ميزوتاني لعلوم الجليكو. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.


مقدمة

يستمر فيروس الأنفلونزا أ (IAV) في السكان من خلال التطور المستمر للهروب من مناعة القطيع. يتم التوسط في المناعة الواقية في الغالب عن طريق تحييد الأجسام المضادة (Abs) الخاصة بالسطح الفيروسي لبروتين سكري hemagglutinin (HA). يتوسط HA كلاً من ارتباط الخلية المستهدفة ، عن طريق ربط أحماض السياليك الطرفية (SA) بمكونات الغشاء الخلوي ، والاندماج بين الأغشية الفيروسية والخلوية بعد استيعاب الفيروس. تستهدف تحييد Abs أساسًا خمسة مواقع مستضدية مناعية شديدة التغير على مجال الرأس الكروي لـ HA ، مما يؤدي إلى حجب الارتباط أو الاندماج بوساطة HA [1-4]. يمكن للفيروسات الهروب من التحييد عن طريق الاستبدالات الأمينية في HA التي تقلل تقارب الجسم المضاد و / أو وظيفته. تظل تكاليف اللياقة التي يفرضها Ab Escape ، والآليات التي يعوض بها الفيروس غير مفهومة جيدًا ، ومع ذلك تلعب دورًا مركزيًا في التحكم في تطور مستضد HA [5،6].

يهرب فيروس الإنفلونزا من تحييد الأجسام المضادة عبر عدد من الآليات المحددة التي تتضمن طفرات HA. أبسطها هو استبدال الأحماض الأمينية في حاتمة مشابهة تقلل تقارب الجسم المضاد [2]. أقل شيوعًا ، يمكن أن تؤثر الاستبدالات البعيدة على ارتباط الجسم المضاد من خلال التأثيرات الخيفية على وصول الجسم المضاد إلى حلقته [7-9]. بدائل الأحماض الأمينية في موقع مستقبلات حمض السياليك ، أو مناطق أخرى من المجال الكروي التي تزيد من تقارب مستقبلات SA الخلوية ، تمكن Ab-escape عن طريق تحويل توازن الارتباط نحو ارتباط الفيروس بالخلايا عكس الجسم المضاد [10-13]. عادةً ما تنتج التغييرات الأكثر جذرية في مولد الضد الكلي عن بدائل الأحماض الأمينية التي تخلق موقع ارتباط بالجليكوزيل مرتبط بـ N في المجال الكروي ، حيث يمكن للجليكان المرتبط أن يمنع ارتباط Abs بمواقع متعددة [5،14-19].

إن قدرة الفيروسات على استغلال طرق الهروب هذه محدودة بتكاليفها على اللياقة الفيروسية. يقع موقع ارتباط مستقبلات حمض السياليك بين مواقع المستضدات المناعية ، وغالبًا ما يغير الهروب من البدائل الملائمة الفيروسية عن طريق تغيير شغف ارتباط مستقبلات HA. بدائل الأحماض الأمينية التي تغير الشحنة الصافية للمجال الكروي عادةً ما تغير شغف ربط الخلية [13،20]. لقد أوضحنا سابقًا أن اختيار البدائل التي تضيف مواقع الارتباط بالجليكوزيل المرتبطة بـ N داخل المجال الكروي للهروب من تحييد الجسم المضاد غالبًا ما يقلل من شغف المستقبل [5]. وبالتالي ، فإن شغف المستقبلات ومستضد HA مرتبطان ارتباطًا وثيقًا ، ويجب موازنتهما باستمرار للحفاظ على اللياقة أثناء تطور المستضد [13 ، 21].

هنا ، نستخدم طريقة primerID لتصحيح الخطأ لتسلسل سكان الفيروس للكشف عن دور جديد مفاجئ للجليكوزيل المرتبط بـ N في تسهيل الهروب المناعي IAV. إلى جانب دوره الأساسي في منع ارتباط Ab ، نظهر أن الارتباط بالجليكوزيل يمكن أن يعوض أيضًا عن تكاليف اللياقة التي تفرضها بدائل الهروب في مكان آخر على HA ، وبالتالي زيادة الجدوى وإمكانية ظهور متغيرات Ab-escape لاحقًا.


نتائج

التوصيف الجيني لفيروسات الإنفلونزا H9N2 المعزولة في الصين عام 1994 & # x20132017

تم تحليل العلاقات الجينية للفيروسات من سنوات ومقاطعات مختلفة عن طريق تسلسل جينات HA لـ 92 فيروسًا تم جمعها في أسواق الدواجن الحية (LPMs) خلال 1994 & # x20132017 من تسع مقاطعات (قوانغدونغ ولياونينغ وجيانغسو وشاندونغ وقوانغشي وشانشي وهاينان ، مقاطعة Henan و Fujian) في الصين (كانت أرقام الانضمام MT561774 & # x2013MT561865 الجدول التكميلي 1). تشارك هذه الفيروسات & # x2019 HA جينات 79.1 & # x201396.8٪ و 72.9 & # x201397.9٪ تشابه مع SS94 على مستوى النوكليوتيدات ومستوى الأحماض الأمينية. جينات HA & # x2019 زخارف الانقسام كانت PSRSSR & # x2193GL ، مما يشير إلى أن هذه الفيروسات كانت ذات قدرة إمراضية منخفضة في الدجاج.

تم إنشاء شجرة النشوء والتطور لجينات HA من فيروسات H9N2 بواسطة MEGA7 باستخدام طريقة الاحتمالية القصوى (الشكل 1). أظهرت النتائج أن 92 فيروسًا تم تجميعهم في 4 مجموعات. الفيروسات 7 و 12 ، المعزولة في 1999 و 2000 ، تنتمي إلى clade h9.4.2.1. فيروسات SS94 و 4 ، المعزولة في عام 2000 ، كانت من النوع h9.4.2.3. الفيروسات 2 ، 48 ، 49 ، 57 ، 58 ، 83 ، 135 ، 194 ، 232 ، 282 ، 308 ، 335 ، SX10 ، BD2011 ، و FX13 ، المعزولة في 2000 & # x20132013 ، كانت في h9.4.2.4. تم عزل 74 فيروسات أخرى في 2013 & # x20132017 سقطت في clade h9.4.2.5.

شكل 1. التحليل الوراثي لجين HA لـ 92 من فيروسات أنفلونزا الطيور H9N2 بناءً على النيوكليوتيدات (NT) 34 & # x20131،716. تمت محاذاة التسلسلات بواسطة ClustalW. تم إنشاء الشجرة باستخدام 1000 نسخة مكررة من bootstrap بواسطة MEGA 7 باستخدام طريقة الاحتمالية القصوى. تشير الدائرة الحمراء الصلبة إلى فيروس SS94. تشير المثلثات الحمراء الصلبة إلى فيروسات H9N2 الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة.

الخصائص الملزمة للمستقبلات لفيروسات H9N2

لتوضيح ميزة ربط المستقبلات لكتل ​​مختلفة من فيروسات H9N2 ، تم تحليل قدرة ربط المستقبلات لجميع فيروسات H9N2 بواسطة ELISA المباشر للطور الصلب ، وتمت مقارنة النتائج مع تلك الخاصة بـ SS94. أولاً ، قمنا بتحليل تلك الانتفاخات الملزمة للمستقبلات من خلال فحوصات ربط المرحلة الصلبة باستخدام عزل فيروس إنفلونزا الطيور H5N1 A / Duck / Guangdong / 383/2008 (H5N1) (dk383-H5N1) وعزل فيروس الأنفلونزا الجائحة البشرية A / Guangdong / 776/2015 (H1N1) (hu776-H1N1) كعنصر تحكم أظهر استدارة نموذجية ملزمة لمستقبلات الطيور أو الإنسان (HRBT) (الأشكال 2 أ ، ب). أظهرت النتائج أن SS94 يرتبط ارتباطًا ضعيفًا بنظير مستقبلات الطيور أو البشر (الشكل 2C) ، مما يشير إلى أن فيروسات H9N2 المعزولة مبكرًا أظهرت استدارة ثنائية ملزمة للمستقبلات (DRBT). يعتبر الفيروس الذي يتمتع بقدرة ارتباط أعلى على الارتباط بمستقبلات الطيور مقارنة بـ SS94 بمثابة انتفاخ قوي لمستقبلات الطيور. وبالمثل ، فإن الفيروس الذي يتمتع بقدرة أعلى على الارتباط بالمستقبلات البشرية من فيروس SS94 كان يعتبر انتفاخًا قويًا للمستقبلات البشرية. يعتبر الفيروس ذو القدرة على الارتباط بمستقبلات الإنسان أو مستقبلات الطيور أقل من SS94 يعتبر انتفاخًا ضعيفًا.

الشكل 2. تحليل قدرة ربط المستقبلات لـ SS94. (أ) قدرة ربط المستقبلات من dk383-H5N1. (ب) قدرة ربط مستقبلات hu776-H1N1. (ج) قدرة ربط مستقبلات SS94. قدرة الفيروسات على الارتباط مع جليكانين مختلفين من نوع بيوتينيلاتيد (3 & # x2032-sialyl-N-acetyllactosamine ، 3 & # x2032-SLN ، موضح باللون الأزرق 6 & # x2032-sialyl-N-acetyllactosamine ، 6 & # x2032-SLN ، موضح باللون الأحمر ) وتم تحليل الفيروسات بتركيز 7.8 و 15.6 و 31.25 و 62.5 و 125 و 250 و 500 و 1000 نانوغرام / مل. أجريت كل تجربة مرتين ، وتمت قراءة قيمة الامتصاصية عند 450 نانومتر. تم استخدام فيروس إنفلونزا الطيور H5N1 A / Duck / Guangdong / 383/2008 (H5N1) (dk383-H5N1) وعزل فيروس الأنفلونزا الجائحة البشرية A / Guangdong / 776/2015 (H1N1) (hu776-H1N1) كطيور نموذجية و السيطرة المدارية البشرية. تم استخدام فيروس H9N2 ، A / chicken / Guangdong / SS / 1994 (SS94) ، كمرحلة مبكرة لمكافحة الفيروس. تم التعبير عن قدرة الفيروس على الارتباط بالمستقبلات على أنها تعني & # x00B1 SD.

تم تصنيف الفيروسات ذات المدارات القوية للطيور والبشر على أنها تحتوي على DRBT تلك التي لديها انتفاخ قوي واحد فقط تم تصنيفها على أنها تحتوي على مدارية مرتبطة بمستقبلات الطيور (ARBT) أو HRBT. تم تصنيف الفيروسات ذات المدارات الضعيفة على أنها تحتوي على انتواء ضعيف مرتبط بالمستقبلات (WRBT). أظهرت نتائج ELISA أن فيروسين أظهروا ARBT (الشكل 3) ، وأظهر 40 فيروسًا DRBT (الشكل 4 والشكل التكميلي 1) ، وأظهر 36 فيروسًا HRBT (الشكل 5 والشكل التكميلي 2) ، وأظهرت الفيروسات الـ 14 الأخرى WRBT (الشكل 6) ).

الشكل 3. تحليل قدرة الارتباط بالمستقبلات لفيروسات H9N2 مع انتفاخ مرتبط بمستقبلات الطيور (ARBT). تصنف الفيروسات ذات القدرة الأقوى على الارتباط بمستقبلات الطيور ولكن قدرة الارتباط بمستقبلات الإنسان الأضعف من SS94 على أنها ARBT. خصائص الارتباط بالمستقبلات لفيروسات H9N2 المختلفة [يشار إليها على شكل لوحات (أ ، ب)] بواسطة ELISA ذات المرحلة الصلبة. تم قياس قدرة ربط الفيروسات من خلال نظيرتين مختلفتين للمستقبلات: 3 & # x2032-SLN (تظهر باللون الأزرق) و 6 & # x2032-SLN (تظهر باللون الأحمر). تم إجراء كل تجربة مرتين وتم التعبير عنها على أنها متوسط ​​& # x00B1 SD.

الشكل 4. تحليل قدرة الارتباط بالمستقبلات لفيروسات H9N2 مع الانتفاخ المزدوج المرتبط بالمستقبلات (DRBT). تصنف الفيروسات التي تتمتع بقدرة أقوى على الارتباط بمستقبلات الطيور وقدرة ربط مستقبلات الإنسان مقارنة بـ SS94 على أنها DRBT. خصائص الارتباط بالمستقبلات لفيروسات H9N2 المختلفة [يشار إليها على شكل لوحات (A & # x2013S)] بواسطة ELISA ذات المرحلة الصلبة. تم قياس قدرة ربط الفيروسات من خلال نظيرتين مختلفتين للمستقبلات: 3 & # x2032-SLN (تظهر باللون الأزرق) و 6 & # x2032-SLN (تظهر باللون الأحمر). تم إجراء كل تجربة مرتين وتم التعبير عنها على أنها متوسط ​​& # x00B1 SD.

الشكل 5. تحليل قدرة الارتباط بالمستقبلات لفيروسات H9N2 مع الانتثار المرتبط بالمستقبلات البشرية (HRBT). تصنف الفيروسات التي تتمتع بقدرة أقوى على الارتباط بالمستقبلات البشرية ولكن أضعف قدرة ربط مستقبلات الطيور من SS94 على أنها HRBT. خصائص الارتباط بالمستقبلات لفيروسات H9N2 المختلفة [يشار إليها على شكل لوحات (A & # x2013N)] بواسطة ELISA ذات المرحلة الصلبة. تم قياس قدرة ربط الفيروسات من خلال نظيرتين مختلفتين للمستقبلات: 3 & # x2032-SLN (تظهر باللون الأزرق) و 6 & # x2032-SLN (تظهر باللون الأحمر). تم إجراء كل تجربة مرتين وتم التعبير عنها على أنها متوسط ​​& # x00B1 SD.

الشكل 6. تحليل قدرة ربط المستقبلات لفيروسات H9N2 مع ضعف الانتفاخ المرتبط بالمستقبلات (WRBT). تصنف الفيروسات ذات القدرة على الارتباط بمستقبلات الطيور والبشر الأضعف من SS94 على أنها WRBT. خصائص الارتباط بالمستقبلات لفيروسات H9N2 المختلفة [يشار إليها على شكل لوحات (A & # x2013L)] تم اختبارها بواسطة ELISA. تم قياس قدرة ربط الفيروسات من خلال نظيرتين مختلفتين للمستقبلات: 3 & # x2032-SLN (تظهر باللون الأزرق) و 6 & # x2032-SLN (تظهر باللون الأحمر). تم إجراء كل تجربة مرتين وتم التعبير عنها على أنها متوسط ​​& # x00B1 SD.

أظهر الفيروسان الموجودان في Clade h9.4.2.1 ، السلالتان 7 و 12 ، WRBT. أظهر الفيروس 4 في clade h9.4.2.3 WRBT. من بين الفيروسات الـ 15 الموجودة في كليد h9.4.2.4 ، أظهرت ثلاث سلالات WRBT ، وأظهرت سلالتان ARBT ، وأظهرت ثماني سلالات DRBT ، وأظهرت سلالتان HRBT. كما أشارت النتائج إلى أنه من بين 74 فيروساً في h9.4.2.5 ، كان هناك ثماني سلالات من WRBT ، و 32 سلالة مع DRBT ، و 34 سلالة مع HRBT. تشير هذه النتائج إلى أنه بالمقارنة مع فيروسات المرحلة المبكرة ، فإن معظم فيروسات H9N2 لديها قدرة ارتباط أعلى بمستقبلات SA التي تشبه الطيور والبشر ، خاصة بالنسبة للفيروسات المعزولة بعد عام 2013 ، والتي أظهرت DRBT و HRBT.

لتحليل العلاقة بين تعزيز قدرة الارتباط بالمستقبلات وسنة العزل للفيروس ، تم اكتشاف قوة ارتباط المستقبلات للفيروسات المعزولة من سنوات مختلفة بواسطة ELISA مع 1000 نانوغرام / مل 3 & # x2032-SLN / 6 & # x2032-SLN . إذا كانت القيمة المتوسطة أعلى من قيمة SS94 ، فإن قدرة ربط المستقبلات & # x2019s تعتبر زيادة. إذا كانت القيمة المتوسطة أقل من قيمة SS94 ، فقد تم اعتبار قوة قدرة ربط المستقبلات في الانخفاض. تم اعتبار الزيادة أو النقصان التسلسلي لأكثر من 3 سنوات ذروة متغيرة للفيروسات وقدرة ربط المستقبلات # x2019. أشارت النتائج إلى أنه في عام 1994 & # 20132017 ، أظهرت قوة الارتباط بمستقبلات الطيور اتجاهين متزايدين وثلاثة اتجاهات متناقصة (الشكل 7 أ). حدثت ذروتان مرتفعتان عززتا قوة الارتباط بمستقبلات الطيور في 2002 & # x20132004 و 2011 & # x20132014 ، وحدثت ثلاث حوادث إضعاف في 1999 & # x20132001 و 2008 & # x20132010 و 2015 & # x20132017. بعد عام 2015 ، عادت قوة الارتباط بمستقبلات الطيور إلى مستوى قريب من مستوى SS94. كان الاختلاف من 1994 إلى 2017 يميل إلى الحفاظ على قوة ثابتة للارتباط بمستقبلات الطيور مثل السلالات المبكرة. أظهرت التغيرات في قوة فيروسات H9N2 لربطها بالمستقبلات البشرية تعزيزين واتجاه تنازلي واحد (الشكل 7 ب). ظهرت ذروة التحسين الأولى في 2002 & # x20132005 ، وحدث حدث التحسين الثاني في 2011 & # x20132017. حدث انخفاض في 1999 & # x20132001. أظهر الاتجاه التطوري للفيروسات المنتشرة من 1994 إلى 2017 قوة ارتباط متزايدة بالمستقبلات البشرية. في عام 2002 & # x20132005 و 2011 & # x20132017 ، زادت قدرة ربط فيروسات H9N2 على مستقبلات الطيور أو الإنسان.

الشكل 7. التباين في قوة ارتباط المستقبلات لفيروسات H9N2 من 1994 إلى 2017: (أ) التباين في قوة الارتباط لمستقبلات الطيور (3 & # x2032-SLN) (ب) التباين في قوة الارتباط للمستقبل البشري (6 & # x2032-SLN). تعتبر قوة ارتباط المستقبلات في زيادة (كما هو موضح باللون الأحمر) أو إنقاصها (كما هو موضح باللون الأخضر) إذا كان متوسط ​​قوة ارتباط المستقبلات في تلك السنة أعلى أو أقل من SS94. تعتبر الذروة قد زادت أو انخفضت بشكل مستمر لأكثر من 3 سنوات. تم إجراء كل فيروس مرتين وتم التعبير عنه على أنه متوسط ​​& # x00B1 SD.

فحص مواقع الأحماض الأمينية ذات الصلة بزيادة قدرة فيروسات H9N2 على الارتباط بالمستقبلات

لمعرفة الطفرات التي تشارك في تعزيز فيروسات H9N2 & # x2019 القدرة على الارتباط بمستقبلات الطيور والبشر ، تم حساب الاختلافات في مواقع الأحماض الأمينية 90 & # x2013260 بالمقارنة مع SS94. أظهرت النتائج 19 من الأحماض الأمينية المتورطة في زيادة فيروسات H9N2 & # x2019 القدرة على الارتباط بمستقبلات تشبه الطيور والبشر تم فحصها (الجدول 1). من بين هذه المواقع ، كان 137 ، 156 ، 159 ، 160 ، 190 ، 192 ، 226 ، 227 موقعًا للأحماض الأمينية في RBD للفيروسات ، وكانت الطفرات الأخرى خارج RBD. تم اختيار ما مجموعه 19 طفرة مختلفة لمزيد من البحث: M99L ، S119R ، K141N ، K141T ، D145N ، D145G ، Q156R ، A160N ، A160D ، R172Q ، S175N ، T205A ، D208E ، T212I ، V216L ، Q226L ، Q227M ، R245 .

الجدول 1. أفضل 20 موقعًا للطفرات في H9N2 AIVs مع تعزيز قوة الربط 3 & # x2032-SLN / 6 & # x2032-SLN (ترقيم H3).

الأساس الجزيئي لزيادة قدرة فيروسات H9N2 على الارتباط بالمستقبلات

لتوضيح الأساس الجزيئي لتعزيز قدرة فيروسات H9N2 على الارتباط بالمستقبلات ، تم إنقاذ فيروس مؤتلف مع جينات HA و NA من SS94 والجينات الداخلية من A / Puerto Rico / 8/1934 (H1N1) (PR8) بواسطة علم الوراثة العكسي وفقًا لدراسة سابقة (Hoffmann et al. ، 2000) وسميت باسم rSS94. بعد ذلك ، تم إنشاء الطفرات التالية في جين HA للفيروس المؤتلف: M99L ، S119R ، K141N ، K141T ، D145N ، D145G ، Q156K ، A160N ، A160D ، R172Q ، S175N ، T205A ، D208E ، T212I ، V216L ، Q722M V245L و R246K. تم إنقاذ المسوخ وتحديده كـ rSS94-M99L و rSS94-S119R و rSS94-K141N و rSS94-K141T و rSS94-D145N و rSS94-D145G و rSS94-Q156R و rSS94-A160N و rSS94-A160D و rSS94-R172Q و rSS94-A160D rSS94-T205A و rSS94-D208E و rSS94-T212I و rSS94-V216L و rSS94-Q226L و rSS94-Q227M و rSS94-V245I و rSS94-R246K (الجدول 2).

الجدول 2. معلومات الفيروسات المؤتلفة المستخدمة في هذه الدراسة.

تم تحليل قوة ارتباط مستقبلات الفيروسات باستخدام ELISA مع 3000 نانوغرام / مل من نظائر المستقبل. أشارت النتائج إلى أن rSS94 له نفس الانتفاخ المرتبط بالمستقبلات مثل SS94 وأظهر قوة ارتباط أعلى بالمستقبلات. مقارنةً بـ rSS94 ، عززت المسوخات rSS94-S119R و rSS94-K141N و rSS94-D145G و rSS94-D145N و rSS94-Q227M و rSS94-R246K بشكل كبير قوة الربط 3 & # x2032-SLN (ص & # x003C 0.05) (الشكل 8 أ). الطفرات من أجل زيادة قوة الربط 3 & # x2032-SLN هي كما يلي: Q227M & # x003E K141N & # x003E D145G & # x003E S119R & # x003E D145N & # x003E R246K.

الشكل 8. تحليل قدرة الارتباط بالمستقبلات لفيروسات H9N2 المؤتلفة مع الطفرة المقابلة في بروتين HA. (أ) قوة ربط المستقبلات لمستقبلات الطيور (3 & # x2032-SLN) (ب) قوة ارتباط المستقبلات للمستقبلات البشرية (6 & # x2032-SLN). ر تم استخدام الاختبار للتحليل الإحصائي. & # x002Aص & # x003C 0.05 ، & # x002A & # x002Aص & # x003C 0.01.

تسببت طفرات rSS94-K141N و rSS94-K141T في انخفاض كبير في قوة الربط لـ 6 & # x2032-SLN (ص & # x003C 0.05). تسببت المسوخات الأخرى في زيادة ذات دلالة إحصائية في قوة الربط إلى 6 & # x2032-SLN (rSS94-Q227M ، rSS94-A160D ، rSS94-Q226L ، rSS94-T212I ، rSS94-R172Q ، rSS94-S175N ، rSS94-A160N ، ص & # x003C 0.05 rSS94-D145N ، rSS94-D145G ، rSS94-S119R ، rSS94-Q156R ، rSS94-T205A ، rSS94-V245I ، rSS94-R246K ، rSS94-V216L ، rSS94-D208E ، ص & # x003C 0.01) (الشكل 8 ب). كان الترتيب على النحو التالي: Q227M & # x003E A160D & # x003E D145N & # x003E D145G & # x003E S119R & # x003E Q156R & # x003E T205A & # x003E Q226L & # x003E V245I & # x003E # R24 D208E & # x003E T212I & # x003E R172Q & # x003E S175N & # x003E A160N.

باختصار ، يمكن للطفرات Q227M و D145G و D145N و S119R و R246K أن تعزز بشكل كبير قوة ارتباط فيروس H9N2 بمستقبلات الطيور والبشر. يمكن للطفرات A160D / N و Q156R و T205A و Q226L و V245I و V216L و D208E و T212I و R172Q و S175N أن تعزز بشكل كبير قوة الربط للمستقبلات البشرية. يمكن للطفرة K141N أن تزيد بشكل كبير من قوة الارتباط بمستقبلات الطيور. تسببت الطفرة K141T في انخفاض كبير في المستقبلات البشرية (ص & # x003C 0.05).

تحليل مقارن لمواقع الأحماض الأمينية ذات الصلة بقدرة الارتباط بالمستقبلات عبر فيروسات H9N2 الطبيعية في الصين

لتوضيح ميزة ربط المستقبلات لفيروسات H9N2 التي تم تداولها في 1994 & # x20132018 في الصين ، قمنا بتحليل الطفرات المرتبطة بقدرة ربط المستقبلات لـ 5102 تسلسل HA تم تنزيله من قاعدة بيانات إنفلونزا NCBI (اعتبارًا من 28 سبتمبر 2019). أشارت نتائجنا السابقة إلى أن قدرة فيروسات H9N2 على الارتباط بالمستقبل بلغت ذروتها مرتين في 1994 & # x20132017: مرة في 2002 & # x20132005 ومرة ​​أخرى في 2011 & # x20132017. في الذروة الأولى ، حدثت طفرات T205A و V216L و Q226L و V245I و D208E في بروتين HA بتردد عالٍ (الشكل 9 أ). خلال هذه الفترة ، لعبت الطفرات Q226L و T205A و V216L و V245I و D208E دورًا مهمًا في زيادة قدرة الارتباط بالمستقبلات البشرية.

الشكل 9. انتشر تحليل الطفرة لبروتين HA لفيروسات H9N2 الطبيعية في الصين من 1994 إلى 2017. (أ) الطفرات عالية التردد التي حدثت في فيروسات H9N2 المعزولة بشكل طبيعي خلال عام 2002 & # x20132005 (ب) الطفرات عالية التردد التي حدثت في فيروسات H9N2 المعزولة الطبيعية خلال 2011 & # x20132017 (ج) أظهرت الطفرات تواترًا منخفضًا في فيروسات H9N2 المعزولة الطبيعية.

كانت 205A ، 208E ، 216L ، و 226 L مستقرة تدريجيًا في بروتين HA لفيروسات H9N2 بعد عام 2005. بالإضافة إلى ذلك ، زادت البدائل S119R و D145G و Q156R و A160D و T212I و Q227M و R246K في فيروسات H9N2 بسرعة بعد عام 2012 (الشكل 9 ب). أشارت هذه النتيجة إلى أن S119R و D145G و Q227M و R246K كانت طفرات أساسية لفيروسات H9N2 للحفاظ على DRBT في 2011 & # x20132017. عززت الطفرات Q156R و A160D و T212I قدرة الفيروسات على الارتباط بمستقبلات تشبه الإنسان. ومن المثير للاهتمام ، لوحظت زيادة ملحوظة في وتيرة طفرة K141T لإضعاف فيروسات H9N2 والقدرة على الارتباط بالمستقبلات البشرية بدءًا من عام 2013. وأظهرت النتائج أيضًا بعض الطفرات النادرة في فيروسات H9N2 ، مثل K141N و A160N و D145N (الشكل 9 ج).


مناقشة

توضح هذه الدراسة أن التبسيط المنهجي لـ N-glycans على HA يؤدي إلى زيادة متتالية في الارتباط بـ α2،3 sialosides ولكن ليس بـ α2،6 sialosides. على حد علمنا ، هذه دراسة غير موصوفة سابقًا لإظهار تأثير الجليكانات الخارجية والداخلية لـ HA على ارتباط المستقبلات وللتشريح الكمي لتقارب الارتباط والمساهمات النشطة لتفاعلات مستقبلات HA.

يؤثر ارتباط HA بالجليكوزيل على وظيفة الأنفلونزا HA (25). ومن المثير للاهتمام ، أنه مع زيادة مستوى الارتباط بالجليكوزيل في الأنفلونزا H3N2 منذ عام 1968 ، انخفض معدل المراضة والوفيات وتتر الرئة الفيروسي (26). لقد أظهر اكتشافنا أن HA مع GlcNAc واحد متصل بمواقع الارتباط بالجليكوزيل أظهر خصوصية استرخاء ولكن تقاربًا محسّنًا لـ α2،3 sialosides يشير إلى أن N-glycans على HA قد يسبب عائقًا فائقًا بالقرب من مجال ربط مستقبلات HA. قد تمنع الخصوصية العالية لمستقبلات سيالوسيدات الفيروس من الارتباط ببعض الجليكانات المحددة الأخرى على سطح الخلية الظهارية في الرئة البشرية. من ناحية أخرى ، يمكن لـ HA مع الجليكان المقطوع التعرف على مستقبلات سيالوسيدات α2،3 مع تقارب ارتباط أعلى وخصوصية أقل ، مما يشير إلى أن تقليل طول الجليكانات على HA قد يزيد من خطر الإصابة بأنفلونزا الطيور. ومع ذلك ، فمن غير الواضح كيف تؤثر التغيرات في تفاعل مستقبلات HA عبر الارتباط بالجليكوزيل على عدوى الفيروس ونشاط NA في دورة الحياة الفيروسية.

HA مع GlcNAc واحد هو مرشح واعد للقاح الأنفلونزا لأن مثل هذا التركيب يحتفظ بالهيكل السليم لـ HA ويمكن تحضيره بسهولة (على سبيل المثال ، عن طريق الخميرة). ويمكنه أيضًا كشف الحواتم المحفوظة المخبأة بواسطة الجليكانات الكبيرة لاستنباط استجابة مناعية تتعرف على متغيرات HA في العيار الأعلى. تفتح هذه الاستراتيجية اتجاهًا جديدًا لتصميم اللقاح ، جنبًا إلى جنب مع استراتيجيات اللقاح المختلفة الأخرى (27-30) والاكتشافات الحديثة للأجسام المضادة المعادلة لـ HA (31-36) ، يجب أن تسهل تطوير لقاحات ضد الفيروسات مثل الأنفلونزا والتهاب الكبد الوبائي سي فيروس وفيروس نقص المناعة البشرية.


الملخص

داخل جزيئات الأنفلونزا الفيروسية ، يتم الحفاظ بعناية على التوازن المعقد بين ارتباط الخلية المضيفة وتدمير مستقبلات حمض السياليك عن طريق البروتينات السكرية هيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز (NA) ، على التوالي. السؤال الرئيسي المعلق في بيولوجيا الإنفلونزا هو وظيفة موقع ارتباط حمض السياليك الثانوي على إنزيم NA. من خلال سلسلة من عمليات محاكاة الديناميات البراونية (BD) للطيور N1 ، والجائحة البشرية N2 ، وإنزيمات الجائحة (H1) N1 المنتشرة حاليًا ، قمنا بالتحقيق في دور موقع الارتباط الثانوي لحمض السياليك في النوع الفرعي N1 من الطيور. تشير نتائجنا إلى أن التفاعلات الكهروستاتيكية في المواقع الثانوية والأولية في NA الطيور قد تلعب دورًا رئيسيًا في عملية التعرف على مستقبلات حمض السياليك والكفاءة التحفيزية لـ NA. يبدو أن هذا الموقع الثانوي يسهل تكوين المجمعات مع بروتين NA ومستقبلات حمض السياليك ، فضلاً عن توفير نشاط HA بدرجة أقل. علاوة على ذلك ، فإن هذا الموقع قادر على توجيه ارتباط المثبط أيضًا ، وإن كان بقدرة منخفضة في N1 ، وقد يكون له آثار محتملة على مقاومة الأدوية أو تصميم المثبط الأمثل. على الرغم من أن موقع ارتباط حمض السياليك الثانوي قد ثبت سابقًا أنه غير محفوظ في سلالات الخنازير NA ، يبدو أن تحقيقاتنا حول سلالة H1N1 الوبائية المنتشرة حاليًا من أصل الخنازير قد احتفظت ببعض السمات الرئيسية لموقع ارتباط حمض السياليك الثانوي. تشير نتائجنا إلى نشاط HA منخفض محتمل لموقع حمض السياليك الثانوي هذا ، والذي قد يكون حدثًا مهمًا في ظهور السلالة الوبائية الحالية.

داخل جزيئات الأنفلونزا الفيروسية ، يتم الحفاظ بعناية على التوازن المعقد بين ارتباط الخلايا المضيفة وتدمير مستقبلات حمض السياليك عن طريق البروتينات السكرية هيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز (NA) ، على التوالي. موقع ارتباط حمض السياليك الثانوي على إنزيم NA (الشكل 1). تم اكتشاف هذا الموقع الثاني لأول مرة من خلال نشاط HA الذي أظهره N9 NA في عزلات الطيور. دور في النشاط التحفيزي NA. (3) هذا النشاط ، الذي يُطلق عليه أيضًا اسم امتصاص الدم (HB) لقدرته على ربط خلايا الدم الحمراء ، ثبت أنه قابل للتحويل إلى النوع الفرعي N2 البشري عن طريق الطفرات الموجهة للموقع. تم إنشاء موقع ارتباط حمض السياليك الثانوي هذا لاحقًا من خلال تجارب علم البلورات بالأشعة السينية. (5) اقترح حفظ البقايا التي تشتمل على هذا الموقع الثانوي في NA من سلالات الطيور ، ولكن ليس الإنسان أو الخنازير ، أن هذه الميزة قد تلعب دورًا غير معروف أشار التحليل الدقيق للسلالات الفردية إلى ضغط الاختيار الإيجابي في موقع HB داخل سلالات الطيور فقط. [6) من خلال سلسلة من الديناميكيات البراونية (BD) محاكاة إنزيمات الطيور N1 وإنزيمات N2 البشرية ، لقد بحثنا في دور موقع ارتباط حمض السياليك الثانوي هذا في النوع الفرعي للطيور N1. تشير نتائجنا إلى أن التفاعلات الكهروستاتيكية في المواقع الثانوية والأولية في NA الطيور قد تلعب دورًا رئيسيًا في عملية التعرف على مستقبلات حمض السياليك والكفاءة التحفيزية (7) لـ NA.


التحديات والتوقعات المستقبلية

لقد ألقت الأعمال الحديثة المتعلقة بربط الفيروس وتكاثره وتسببه وانتقاله وأعمال المتابعة على المحددات الهيكلية لخصوصية مستقبلات HA واستقرارها ضوءًا جديدًا مهمًا على تكيف فيروس الإنفلونزا مع مضيفات الثدييات. إيماي وآخرون وهيرفست وآخرون وصفت بدائل مختلفة للأحماض الأمينية في فيروس H5N1 HA والتي مثلت صفات نمطية متشابهة بشكل ملحوظ تؤدي إلى انتقال الفيروس عبر الهواء. وقد لوحظت بعض هذه الاستبدالات أيضًا في عام 2013 فيروسات H7N9 ذات القابلية المحدودة للانتقال عبر الهواء ، وفي فيروس H9N2 المحمول جواً ، وفي فيروسات وباء القرن الماضي. Some of the substitutions of the laboratory-derived airborne H5N1 viruses and combinations of such substitutions were already detected in naturally circulating H5N1 viruses (Russell وآخرون, 2012 ). However, it should be noted that these mutations do not necessarily result in the same phenotype in all H5N1 strains or in strains of other influenza virus subtypes. Moreover, it is possible that there are evolutionary constraints to the accumulation of genetic changes required to yield an airborne transmission phenotype, making the emergence of such viruses possibly an unlikely event (Russell وآخرون, 2012 ). Further identification of the genetic and phenotypic changes required for host adaptation and transmission of influenza viruses remains an important research topic to facilitate risk assessment for the emergence of zoonotic and pandemic influenza.

In currently circulating strains of clade 2.2.1 H5N1 containing a deletion in the 130-loop and lacking a glycosylation site at position 160, the substitutions 224-Asn and 226-Leu resulted in a switch of receptor specificity (Tharakaraman وآخرون, 2013b ). We know that there are many more ways by which H5N1 viruses can adapt to attach to α2,6-SA. Some natural human H5N1 virus isolates bind to both α2,3-SA and α2,6-SA due to substitutions in and around the RBS (Yamada وآخرون, 2006 Crusat وآخرون، 2013). In addition, mutational analyses of H5 HA based on analogies with other influenza virus subtypes identified several substitutions that caused a switch in receptor specificity and virus attachment to upper respiratory tract tissues of humans. Although none of these human virus isolates and mutant viruses were capable of airborne transmission between mammals (Maines وآخرون, 2006 Stevens وآخرون, 2006b , 2008 Chutinimitkul وآخرون, 2010b Paulson & de Vries, 2013 ), it is clear that there are multiple ways by which circulating H5N1 strains can change receptor specificity and adapt to replication in mammals.

Yang وآخرون ( 2013 ) have shown that introduction of substitution 228-Ser in H7N9 HA that already had 226-Leu resulted in overall increased binding to α2,3-SA and α2,6-SA, but not in a switch in receptor preference. Based on structural studies, it was anticipated that Gly-228-Ser would optimize interactions with both α2,3-SA and α2,6-SA. Gly-228-Ser resulted in increased binding of the H7N9 HA to the apical surface of tracheal and alveolar tissues of humans (Tharakaraman وآخرون, 2013a ). At present, it is unclear whether other amino acid substitutions would further fine-tune the receptor binding preference of the H7N9 viruses and could potentially increase the airborne transmissibility under laboratory or natural conditions.

Although our knowledge of receptor specificity and its implications for transmission and pathogenesis has improved since the initial characterization of the influenza virus RBS, there are still many unknowns. The lack of knowledge of which cells are the primary target of airborne transmissible viruses and the type and distribution of receptors they express hampers the interpretation of receptor binding data and structural studies. Major current interest is focused on receptor binding assays such as glycan arrays, solid-phase binding assays, and agglutination assays using modified erythrocytes. But without knowledge on which receptors are relevant for influenza virus attachment, replication, and transmission في الجسم الحي, it is impossible to assess which binding assays best represent influenza virus attachment in the respiratory tract. As a consequence, studies should focus more on identification of the relevant functional glycans in humans and animal models. The possibility that a plethora of receptors in the human respiratory tract can be utilized for the attachment of influenza viruses and are relevant for replication and transmission should be considered. Based on studies of the glycome of human and animal hosts, it is clear that a large number of glycan structures are not represented on glycan arrays (Walther وآخرون، 2013). A potential way forward would be the use of shotgun glycan arrays that employ receptors of relevant tissues and cells of the human respiratory tract rather than random synthetic glycans (Yu وآخرون, 2012 ). At present, such studies are limited since they generally employ all glycans expressed in the respiratory tract rather than just those receptors expressed on relevant cell types at the apical surface of the respiratory tract that are accessible upon influenza virus infection. Future work should clearly focus on improvement of the methods available in glycobiology. Similarly, X-ray crystal structures of human and avian receptor analogs in complex with HAs of human and influenza viruses have revealed crucial structural determinants for binding to α2,3-SA and α2,6-SA receptor analogs. But potentially these structural studies could also be complemented with influenza HAs in complex with a variety of sialylated glycan structures, to increase understanding of the structural determinants of HA receptor binding.

There is a clear need for phenotypic assays to predict which animal influenza viruses can infect humans and transmit between humans. One major unknown is to what extent the transmissibility of influenza viruses in ferret and guinea pig transmission models can be extrapolated to humans. Although thus far there has been good correspondence between the transmissibility of avian and human influenza viruses between humans and the ferret transmission model, it is not certain that all viruses that transmit between ferrets will also transmit between humans. It is also not clear how the ferret and guinea pig models compare with respect to airborne transmission of animal influenza viruses. Better understanding about the behavior of airborne transmissible viruses في المختبر may allow replacement of some animal models with في المختبر methods and contribute to reduction, replacement, and refinement in animal experiments (Russell & Burch, 1959 Belser وآخرون, 2013b ). In addition, such phenotypical assays may complement ongoing surveillance studies to identify biological traits of circulating influenza viruses that could trigger immediate action or attention. So far, when data obtained with attachment studies, infection studies using primary epithelial cell lines explants, and animal studies were compared, the correspondence was not always obvious, and therefore, more work in this field is also needed. While it may never be feasible to perfectly predict the adaptation of animal influenza viruses to humans, increased knowledge from animal studies, في المختبر assays, and structural analyses collectively will almost certainly improve such predictions.


Amino acid substitutions near the receptor binding site HA protein in type A H3N2 influenza strains? - مادة الاحياء

REcognition of Cluster-transition Determining Sites (RECDS)

RECDS evaluate the contribution of a specific amino acid site on the HA protein in the whole history of antigenic evolution. In RECDS , we ranked all of the HA sites by calculating the contribution scores derived from the forest of Gradient Boosting Classifiers trained by various sequence-based and structure-based features.

Copyright of RECDS scripts in code dir, including how to extract features, train model and color trees, are reserved by Aiping Wu lab.

Important: The project uses python 2.7 interpreter and when you run the pipeline, you should modify python script files and set some paths based on your computing environment and third-party software installation.

The repo contains the following:

1. Raw data used in this project

The antigenic clustering and raw sequence used in RECDS can be found in dataset/ directory.

H3N2AntigenicCluster.strains : The strain names of A/H3N2 used by RECDS

H3N2/source/ : Seven antigenic clusters derived from Smith’s studies including raw HA1 protein sequences.

H3N2/nonredundant/ : The sequences after removing redundant HA1 protein sequences and sequence alignment.

Koel, B.F., et al. Substitutions near the receptor binding site determine major antigenic change during influenza virus evolution. Science 2013342(6161):976-979.

H1N1AntigenicCluster.strains : The strain names of A/H1N1 used by RECDS

H1N1/source/ : Seven antigenic clusters derived from our previous studies including raw HA1 protein sequences.

H1N1/nonredundant/ : The sequences after removing redundant HA1 protein sequences and sequence alignment.

Liu, M., et al. Antigenic Patterns and Evolution of the Human Influenza A (H1N1) Virus. Sci Rep 20155:14171.

2. Pipeline and result of the project

The pipeline uses python 2.7 interpreter. Source code of the RECDS pipeline can be found in code/sourceCode/script/ . The major steps includes a) features extracting, b) GBC model training and c) phylogenetic tree coloring. The dependency scripts can be found in code/sourceCode/python/ and tools/ .

Including the PIMA score and other metrics calculated from predicted 3D structure.

  1. Modify 1_PIMAscore.py file and set “seqin” path which contains virus sequences named by dData
  2. dir/dData is the virus pairs name and you can find its example format in InputH3N2Example
  3. dir/features/dPIMA is the output feature file
  1. Modify 2_1_run_Modeler.py file and set some paths, such as runModeller, fastaDir and outDir
  2. seqName is the virus name and you can find its example format in InputH3N2Example
  3. dir/Modeler is the output file of outDir in 2_1_run_Modeler.py
  4. dir/newModeler is the rename output file of Modeler structure

Relative solvent accessibility

  1. Modify 3_1_runDssp.py file and set some paths which contains outdir for dssp resuls and Modeler for dir/newModeler
  2. dir/seqMap contains the virus name and you can find its example format in InputH3N2Example
  3. Modify 3_2_get_dssp.py file and set dsspfile path to outdir for dssp resuls in 3_1_runDssp.py
  4. dir/features/dDssp is the output feature file
  1. Modify 4_1_run_ddG.py file and set “seqin” path which contains virus sequences named by dData
  2. dir/dSEF output file for ddG
  3. Modify 4_2_get_ddG.py file and set ddGDir path to outdir for SEF resuls in 4_1_run_ddG.py
  4. dir/dSEF is the output feature file

Half-sphere exposure (HSE)-up

  1. Modify 5_1_runHSE.py file and set some paths which contains outdir for HSE resuls and ModelDir for dir/newModeler
  2. Modify 5_2_get_HSE.py file and set hsefile path to outdir for HSE resuls in 5_1_runHSE.py
  3. dir/features/dHSE is the output feature file
  1. Modify 6_1_run_Amber.py file and set some paths
  2. 10000 is modeler model name
  3. dir/amber/10000 is output dir
  4. dir/newModeler is modeler structure dir
  5. Modify 6_2_get_Amber.py file and set amberfile path to outdir for amber resuls in 6_1_run_Amber.py
  6. dir/features/dAmber is the output feature file

Merge six different features

  1. Modify 7_merge_feature.py file and set featureDir path which contains above six features
  2. dir/dFeatures is output dir

Use the features extracted in the previous steps to train Gradient Boost Classifier model.

  1. 9_cross_train.py and siteImportance_diffComb.py is similar to 8_siteImportance.py and they are our experiment scripts
  2. dir/dFeatures is features file for antigenically different virus pairs
  3. dir/sFeatures is features file for antigenically similar virus pairs
  4. dir/train/allImportance is score output file

c) Custom-made phylogenetic analysis.

Build phylogenetic tree, plot and color the tree according to the amino acid type of the candidate positions.

  1. The phylogenetic trees of A/H3N2 و A/H1N1 were built under a GTR substitution model using RAxML (version 8.2.9). The GAMMA model of rate heterogeneity and other model parameters were estimated by RAxML .
  2. The dedicated phylogenetic visualization R package ggtree (v1.6.1) was used to make the plot.
  3. The result can be found in colorTree.zip .

3. Third-party software installation:

While the majority of programs in the package code/sourceCode/ are developed in the Aiping Wu lab here in the permission of use is released, there are some programs and databases which were developed by third-party groups. You may experience installation problems, please check the third-party websites.

Install python dependencies

Python modules pandas , biopython and scikit-learn are required. Installation using pip is recommended.

The homologous modelling for protein 3D structure is implemented by Modeller . The download and installation can be found at https://salilab.org/modeller/. Modeller is written in python and C can be import as a python module.

The calculation of relative solvent accessibility (RSA) for protein residuals needs dssp . The download and installation can be found at https://swift.cmbi.umcn.nl/gv/dssp/. Or the pre-complied package can be installed on Linux machine:

We calculated ∆∆G denoting a protein stability change upon the single point mutation through the statistical energy function (SEF). This software is developed by Xiong Peng, and he modified application program interfaces (APIs) from original program for our use. So, the input is very simple, which just need protein structure and mutation information (wild type, position, mutant type). We have obtained his approval to open his modified software with our works and its software can be downloaded at https://drive.google.com/open?id=1Hls89AV6r5DNMXyDfC-qv4YhxkW_iaov. If you use SEF, please kindly cite as following:

Xiong, P., et al., Protein design with a comprehensive statistical energy function and boosted by experimental selection for foldability. Nat Commun, 2014. 5: p. 5330


محتويات

The "RNA viruses" include the "negative-sense ssRNA viruses" which include the Family "Orthomyxoviridae" which contains five genera, classified by variations in nucleoprotein (NP and M) antigens. One of these is the Genus "Influenzavirus A" which consists of a single species called "Influenza A virus" one of its subtypes is H5N1.

H5N1 (like the other avian flu viruses) has strains called "highly pathogenic" (HP) and "low-pathogenic" (LP). Avian influenza viruses that cause HPAI are highly virulent, and mortality rates in infected flocks often approach 100%. LPAI viruses are generally of lower virulence, but these viruses can serve as progenitors to HPAI viruses. The current strain of H5N1 responsible for die-offs of domestic birds in Asia is an HPAI strain other strains of H5N1 occurring elsewhere in the world are less virulent and, therefore, are classified as LPAI strains. All HPAI strains identified to date have involved H5 and H7 subtypes. The distinction concerns pathogenicity in poultry, not humans. Normally a highly pathogenic avian virus is not highly pathogenic to either humans or non-poultry birds. This current strain of H5N1 is unusual in being deadly to so many species.

Both "influenza" (meaning flu) and "A" (meaning species type A) can be used as adjectives of the noun "virus" resulting in the noun phrase "influenza A virus" which when capitalized is the proper noun Influenza A virus which is the name of the species the noun phrase أيضا يعود الى.

A virus is one type of microscopic parasite that infects cells in biological organisms.

The Orthomyxoviridae are a family of RNA viruses which infect vertebrates. It includes those viruses which cause influenza. Viruses of this family contain 7 to 8 segments of linear negative-sense single-stranded RNA.

"Influenza virus" refers to a subset of Orthomyxoviridae that create influenza. This taxonomic category is not based on phylogenetics.

Influenza A viruses have 10 genes on eight separate RNA molecules, which, for the reasons mentioned above, are named PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, and NS. HA, NA, and M specify the structure of proteins that are most medically relevant as targets for antiviral drugs and antibodies. (An eleventh recently discovered gene called PB1-F2 sometimes creates a protein but is absent from some influenza virus isolates. [5] ) This segmentation of the influenza genome facilitates genetic recombination by segment reassortment in hosts who are infected with two different influenza viruses at the same time. [1] Influenza A virus is the only species in the Influenzavirus A genus of the family Orthomyxoviridae and are negative sense, single-stranded, segmented RNA viruses.

"The influenza virus RNA polymerase is a multifunctional complex composed of the three viral proteins PB1, PB2 and PA, which, together with the viral nucleoprotein NP, form the minimum complement required for viral mRNA synthesis and replication." [7]

  • Surface antigen encoding gene segments (RNA molecule): (HA, NA)
  • HA codes for hemagglutinin, which is an antigenicglycoprotein found on the surface of the influenzaviruses and is responsible for binding the virus to the cell that is being infected. Hemagglutinin forms spikes at the surface of flu viruses that function to attach viruses to cells. This attachment is required for efficient transfer of flu virus genes into cells, a process that can be blocked by antibodies that bind to the hemagglutinin proteins. One genetic factor in distinguishing between human flu viruses and avian flu viruses is that "avian influenza HA bind alpha 2-3 sialic acid receptors while human influenza HA bind alpha 2-6 sialic acid receptors. Swine influenza viruses have the ability to bind both types of sialic acid receptors." [8] A mutation found in Turkey in 2006 "involves a substitution in one sample of an amino acid at position 223 of the haemoagglutinin receptor protein. This protein allows the flu virus to bind to the receptors on the surface of its host's cells. This mutation has been observed twice before — in a father and son in Hong Kong in 2003, and in one fatal case in Vietnam last year. It increases the virus's ability to bind to human receptors, and decreases its affinity for poultry receptors, making strains with this mutation better adapted to infecting humans." [على من؟] Another mutation in the same sample at position 153 has as yet unknown effects. [9] "Amino acid residues at positions 226 and 228 of the receptor binding pocket of HA appear to determine binding affinity to cell surface receptors and to influence the selective binding of the virus to avian (sialic acid -2,3-NeuAcGal) or human (sialic acid -2,6-NeuAcGal) cell surface receptors. The human A/HK/212/03 and A/HK/213/03 isolates retain the signature associated with avian receptor binding, but they have a unique amino acid substitution (Ser227Ile) within the receptor binding pocket that was not present even in the closely related A/Gs/HK/739.2/02 (genotype Z+) virus." [10] Recent research reveals that humans have avian type receptors at very low densities and chickens have human type receptors at very low densities. [11] Researchers "found that the mutations at two places in the gene, identified as 182 and 192, allow the virus to bind to both bird and human receptors." [12][13] See research articles Host Range Restriction and Pathogenicity in the Context of Influenza Pandemic (Centers for Disease Control and Prevention, 2006) (by Gabriele Neumann and Yoshihiro Kawaoka) and Structure and Receptor Specificity of the Hemagglutinin from an H5N1 Influenza Virus (American Association for the Advancement of Science, 2006) (by James Stevens, Ola Blixt, Terrence M. Tumpey, Jeffery K. Taubenberger, James C. Paulson, Ian A. Wilson) for further details.
  • NA codes for neuraminidase which is an antigenicglycoproteinenzyme found on the surface of the influenzaviruses. It helps the release of progeny viruses from infected cells. Flu drugs Tamiflu and Relenza work by inhibiting some strains of neuraminidase. They were developed based on N2 and N9. "In the N1 form of the protein, a small segment called the 150-loop is inverted, creating a hollow pocket that does not exist in the N2 and N9 proteins. [. ] When the researchers looked at how existing drugs interacted with the N1 protein, they found that, in the presence of neuraminidase inhibitors, the loop changed its conformation to one similar to that in the N2 and N9 proteins." [14]

Matrix encoding gene segments Edit

    M codes for the matrix proteins (M1 and M2) that, along with the two surface proteins (hemagglutinin and neuraminidase), make up the capsid (protective coat) of the virus. It encodes by using different reading frames from the same RNA segment.
      is a protein that binds to the viral RNA. is a protein that uncoats the virus, thereby exposing its contents (the eight RNA segments) to the cytoplasm of the host cell. The M2 transmembrane protein is an ion channel required for efficient infection. [16] The amino acid substitution (Ser31Asn) in M2 some H5N1 genotypes is associated with amantadine resistance. [17]

    Nucleoprotein encoding gene segments. يحرر

    • NP codes for nucleoprotein.
    • NS: NS codes for two nonstructural proteins (NS1 and NS2 - formerly called NEP). "[T]he pathogenicity of influenza virus was related to the nonstructural (NS) gene of the H5N1/97 virus". [18]
      • NS1: Non-structural: nucleus effects on cellular RNA transport, splicing, translation. Anti-interferon protein. [19] The "NS1 of the highly pathogenic avian H5N1 viruses circulating in poultry and waterfowl in Southeast Asia might be responsible for an enhanced proinflammatory cytokine response (especially TNFa) induced by these viruses in human macrophages". [4] H5N1 NS1 is characterized by a single amino acid change at position 92. By changing the amino acid from glutamic acid to aspartic acid, the researchers were able to abrogate the effect of the H5N1 NS1. [This] single amino acid change in the NS1 gene greatly increased the pathogenicity of the H5N1 influenza virus." [20]
      • NEP: The "nuclear export protein (NEP, formerly referred to as the NS2 protein) mediates the export of vRNPs". [21]

      Polymerase encoding gene segments Edit

      • PA codes for the PA protein which is a critical component of the viral polymerase.
      • PB1 codes for the PB1 protein and the PB1-F2 protein.
        • The PB1 protein is a critical component of the viral polymerase.
        • The PB1-F2 protein is encoded by an alternative open reading frame of the PB1 RNA segment and "interacts with 2 components of the mitochondrial permeability transition pore complex, ANT3 and VDCA1, [sensitizing] cells to apoptosis. [. ] PB1-F2 likely contributes to viral pathogenicity and might have an important role in determining the severity of pandemic influenza." [4] This was discovered by Chen وآخرون. and reported in Nature. [5] "After comparing viruses from the Hong Kong 1997 H5N1 outbreak, one amino acid change (N66S) was found in the PB1-F2 sequence at position 66 that correlated with pathogenicity. This same amino acid change (N66S) was also found in the PB1-F2 protein of the 1918 pandemic A/Brevig Mission/18 virus." [6]

        Influenza viruses have a relatively high mutation rate that is characteristic of RNA viruses. The segmentation of the influenza genome facilitates genetic recombination by segment reassortment in hosts who are infected with two different influenza viruses at the same time. H5N1 viruses can reassort genes with other strains that co-infect a host organism, such as a pig, bird, or human, and mutate into a form that can pass easily among humans. This is one of many possible paths to a pandemic.

        The ability of various influenza strains to show species-selectivity is largely due to variation in the hemagglutinin genes. Genetic mutations in the hemagglutinin gene that cause single amino acid substitutions can significantly alter the ability of viral hemagglutinin proteins to bind to receptors on the surface of host cells. Such mutations in avian H5N1 viruses can change virus strains from being inefficient at infecting human cells to being as efficient in causing human infections as more common human influenza virus types. [25] This doesn't mean that one amino acid substitution can cause a pandemic, but it does mean that one amino acid substitution can cause an avian flu virus that is not pathogenic in humans to become pathogenic in humans.

        H3N2 ("swine flu") is endemic in pigs in China, and has been detected in pigs in Vietnam, increasing fears of the emergence of new variant strains. The dominant strain of annual flu virus in January 2006 was H3N2, which is now resistant to the standard antiviral drugs amantadine and rimantadine. The possibility of H5N1 and H3N2 exchanging genes through reassortment is a major concern. If a reassortment in H5N1 occurs, it might remain an H5N1 subtype, or it could shift subtypes, as H2N2 did when it evolved into the Hong Kong Flu strain of H3N2.

        Both the H2N2 and H3N2 pandemic strains contained avian influenza virus RNA segments. "While the pandemic human influenza viruses of 1957 (H2N2) and 1968 (H3N2) clearly arose through reassortment between human and avian viruses, the influenza virus causing the 'Spanish flu' in 1918 appears to be entirely derived from an avian source". [26]

        In July 2004, researchers led by H. Deng of the Harbin Veterinary Research Institute, Harbin, China and Professor Robert G. Webster of the St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, Tennessee, reported results of experiments in which mice had been exposed to 21 isolates of confirmed H5N1 strains obtained from ducks in China between 1999 and 2002. They found "a clear temporal pattern of progressively increasing pathogenicity". [27] Results reported by Dr. Webster in July 2005 reveal further progression toward pathogenicity in mice and longer virus shedding by ducks.

        Asian lineage HPAI A(H5N1) is divided into two antigenic clades. "Clade 1 includes human and bird isolates from Vietnam, Thailand, and Cambodia and bird isolates from Laos and Malaysia. Clade 2 viruses were first identified in bird isolates from China, Indonesia, Japan, and South Korea before spreading westward to the Middle East, Europe, and Africa. The clade 2 viruses have been primarily responsible for human H5N1 infections that have occurred during late 2005 and 2006, according to WHO. Genetic analysis has identified six subclades of clade 2, three of which have a distinct geographic distribution and have been implicated in human infections: Map

        • Subclade 1, Indonesia
        • Subclade 2, Europe, Middle East, and Africa (called EMA)
        • Subclade 3, China" [28][29][30]

        A 2007 study focused on the EMA subclade has shed further light on the EMA mutations. "The 36 new isolates reported here greatly expand the amount of whole-genome sequence data available from recent avian influenza (H5N1) isolates. Before our project, GenBank contained only 5 other complete genomes from Europe for the 2004–2006 period, and it contained no whole genomes from the Middle East or northern Africa. Our analysis showed several new findings. First, all European, Middle Eastern, and African samples fall into a clade that is distinct from other contemporary Asian clades, all of which share common ancestry with the original 1997 Hong Kong strain. Phylogenetic trees built on each of the 8 segments show a consistent picture of 3 lineages, as illustrated by the HA tree shown in Figure 1. Two of the clades contain exclusively Vietnamese isolates the smaller of these, with 5 isolates, we label V1 the larger clade, with 9 isolates, is V2. The remaining 22 isolates all fall into a third, clearly distinct clade, labeled EMA, which comprises samples from Europe, the Middle East, and Africa. Trees for the other 7 segments display a similar topology, with clades V1, V2, and EMA clearly separated in each case. Analyses of all available complete influenza (H5N1) genomes and of 589 HA sequences placed the EMA clade as distinct from the major clades circulating in People's Republic of China, Indonesia, and Southeast Asia." [23]


        شاهد الفيديو: ايه هو البروتين الطبيعي وايه هي الأحماض الامينية وأنواعها (كانون الثاني 2023).