معلومة

بروتين A- الجسم المضاد SDS-PAGE

بروتين A- الجسم المضاد SDS-PAGE


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أردت أن أعرف ما إذا كان غليان مركب البروتين A- الأجسام المضادة لتحليل SDS-PAGE سيعطل التفاعل؟ ويؤدي إلى تفكك البروتين (أ) والجسم المضاد؟

شكرا لك


نعم فعلا. يتم خلط عينات SDS-PAGE مع مخزن تحميل يحتوي على SDS (التركيز النهائي لـ SDS عادة ما يكون 2 ٪). بشكل عام ، سيعطل SDS تفاعلات البروتين والبروتين ، حتى قبل الغليان. يضاف عامل الاختزال (عادة DTT أو b-mercaptoethanol) لتعطيل روابط ثاني كبريتيد. انظر الرسم التخطيطي هنا.

ومع ذلك ، هناك استثناءات. بعض مجمعات البروتين / مولدات البروتين تقاوم SDS حتى الغليان ، وبعضها يحتفظ بالتفاعلات بعد الغليان. بعض الأمثلة: Xia et al 2007 ، Kubista et al 2004 ، Grigorian et al 2009.


تغلف كبريتات دوديسيل الصوديوم البروتينات بما يتناسب مع وزنها الجزيئي ثم تمنح نفس الشحنة الكهربائية السالبة عبر جميع البروتينات في العينة. يتناسب معدل انتقال بولي ببتيد في SDS-PAGE عكسًا مع لوغاريتم وزنه الجزيئي. هذا يعني أنه كلما زاد حجم عديد الببتيد ، كلما تراجعت بشكل أبطأ في مادة هلامية. يتم تحديد الوزن الجزيئي من خلال مقارنة هجرة بقع البروتين بهجرة المعايير. تعتبر قطع الوزن الجزيئي اللوغاريتمي مقابل مسافة الهجرة خطية بشكل معقول.

غالبًا ما يتم استرداد البروتينات المفصولة بواسطة SDS-PAGE في إجراء يتضمن توطين البروتين المطلوب على الهلام بعد SDS-PAGE ، وإزالة البروتين من الهلام ، وإزالة كبريتات دوديسيل الصوديوم من العينة المزالة ، وأخيرًا إعادة تكوين البروتين. لتحليل لاحق. تُستخدم البروتينات المستخرجة من المواد الهلامية في تطبيقات مختلفة بنجاح ، مثل كيمياء البروتين ، وتحديد تكوين الأحماض الأمينية ، وتحديد عديد الببتيدات التي تتوافق مع نشاط إنزيم معين ، وأغراض أخرى.

يعد تحليل تركيزات البروتين اختبارًا مهمًا في أبحاث الكيمياء الحيوية. يعتبر اختبار برادفورد أحد أكثر الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتحديد تركيزات البروتين ، بالنسبة للمعيار. تعتمد التقنية على تكوين مركب بين البروتينات في المحلول والصبغة. يُثنى على هذا الاختبار للاستخدام العام ، لا سيما لتقييم تركيزات البروتينات في الرحلان الكهربائي للهلام .. غالبًا ما يتم استرداد البروتينات المفصولة بواسطة SDS-PAGE في إجراء يتضمن توطين البروتين محل الاهتمام على الجل بعد SDS-PAGE ، مما يؤدي إلى تصفية البروتين من الجل ، وإزالة كبريتات دوديسيل الصوديوم من العينة المعبأة ، وأخيراً إعادة البروتين للتحليل اللاحق.

تُستخدم البروتينات المستخرجة من المواد الهلامية في تطبيقات مختلفة بنجاح ، مثل كيمياء البروتين ، وتحديد تكوين الأحماض الأمينية ، وتحديد عديد الببتيدات التي تتوافق مع نشاط إنزيم معين ، وأغراض أخرى. يعد تحليل تركيزات البروتين اختبارًا مهمًا في أبحاث الكيمياء الحيوية. يعتبر اختبار برادفورد أحد أكثر الطرق استخدامًا لتحديد تركيزات البروتين ، مقارنةً بالمعيار. تعتمد هذه التقنية على تكوين مركب بين البروتينات في المحلول والصبغة Brilliant Blue G.

تم الثناء على هذا الاختبار للاستخدام العام ، لا سيما لتقييم تركيزات البروتينات للهلام الكهربائي. يعتمد على الملاحظات التي تشير إلى أن الحد الأقصى للامتصاص للمخاليط الحمضية من Coomassie Brilliant Blue G-250 التي تتحول من 465 نانومتر إلى 595 نانومتر في الوقت الذي يحدث فيه ارتباط بالبروتين. يكون الفحص فعالًا نظرًا لأن معامل الإبادة لمحلول مركب صبغ الألبومين يكون عادةً ثابتًا على مدى 10 أضعاف تركيز (Westermeier، Naven & Ho؟ pker، 2008).

تتفاعل الصبغة بشكل أساسي مع بقايا الأرجينين ولكن بشكل أقل مع بقايا الهيستيدين والليسين والتربتوفان والتيروزين والفينيل ألانين. على ما يبدو ، هذا الفحص ليس مثالياً للبروتينات الحمضية أو الأساسية. ومع ذلك ، فهو حساس إلى حد ما لألبومين مصل الأبقار ، حتى أكثر من معظم البروتينات ، بمقدار ضعفين. جاما جلوبيولين (IgG) هو معيار البروتين المفضل. الهدف من هذا


بولي أكريلاميد جل الكهربائي

بولي أكريلاميد من المحتمل أن يكون الفصل الكهربائي للهلام (PAGE) هو التقنية التحليلية الأكثر شيوعًا المستخدمة لفصل البروتينات وتوصيفها. حل الأكريلاميد و bisacrylamide بلمرة. تشكل مادة الأكريلاميد وحدها بوليمرات خطية. يقدم بيساكرلميد روابط متقاطعة بين سلاسل بولي أكريلاميد. يتم تحديد "حجم المسام" من خلال نسبة مادة الأكريلاميد إلى بيساكريلاميد ، وبتركيز مادة الأكريلاميد. يؤدي وجود نسبة عالية من بيساكريلاميد إلى مادة الأكريلاميد وارتفاع تركيز مادة الأكريلاميد إلى انخفاض الحركة الكهربية. بلمرة الأكريلاميد وبيساكرلميد مونومرات يتم إحداثه بواسطة بيرسلفات الأمونيوم (APS) ، والذي يتحلل تلقائيًا لتشكيل الجذور الحرة. يتم تضمين TEMED ، وهو مثبت الجذور الحرة ، بشكل عام لتعزيز البلمرة.

عادة ما يتم تحضير المواد الهلامية مع الجزء العلوي من الهلام الموجود أسفل آبار العينة التي تكون أقل كثافة من باقي الجل الذي يتم جعله أكثر كثافة عن قصد. يشار إلى الجزء العلوي باسم & ldquostacking gel & rdquo والجزء السفلي يسمى & ldquorunning gel & rdquo أو & ldquoseparating gel & rdquo. الغرض من جل التكديس هو تركيز جميع البروتينات ذات الأحجام المختلفة في منطقة أفقية مضغوطة عن طريق حشرها بين تدرج جزيئات الجلايسين أعلاه وأيونات الكلوريد أدناه. بهذه الطريقة ، ستدخل معظم البروتينات في الهلام الأكثر كثافة في آنٍ واحد قبل أن تبدأ في الانتقال إلى الأسفل بمعدلات مختلفة بناءً على حجمها. بهذه الطريقة ، تكون النطاقات أكثر وضوحًا وأفضل فصلًا عن التصور والتحليل. بدون هلام التكديس ، ستنتج البروتينات مسحة طويلة من خلال الجل المحلول بدلاً من الأشرطة المتميزة المشدودة حتى نتمكن من تحليلها.

الشكل 1. هلام PAGE. يمر البروتين أولاً عبر هلام التراص ، حيث تنتشر العينات. بمجرد وصول البروتين إلى الجل الفاصل ، تتجمع البروتينات معًا في أشرطة ضيقة. أثناء تحركهم خلال هلام الحل ينفصلون حسب الحجم.

SDS-PAGE

كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) عبارة عن برمائي منظف. لديها مجموعة رأس أنيونية و محبة للدهون ذيل. يرتبط بشكل غير تساهمي بالبروتينات ، حيث ينجذب جزيء SDS واحد تقريبًا إلى كل نوعين من الأحماض الأمينية. يتسبب SDS في تفسد البروتينات وفصلها عن بعضها البعض (باستثناء الارتباط التساهمي المتقاطع) وتنحل بشكل أساسي إلى جزيئات خطية. كما أنه يمنح شحنة سالبة. في وجود SDS ، يتم إخفاء الشحنة الذاتية للبروتين. أثناء SDS-PAGE ، تهاجر جميع البروتينات نحو القطب الموجب (القطب الموجب الشحنة). البروتينات المعالجة بـ SDS لها نسب شحنة إلى كتلة متشابهة جدًا ، وأشكال مماثلة. خلال PAGE ، يتم تحديد معدل هجرة البروتينات المعالجة بـ SDS بشكل فعال من خلال طولها غير المطوي ، والذي يرتبط بوزنها الجزيئي.

الشكل 2: بروتين محاط بجزيئات SDS.


بروتوكول SDS PAGE:

1. اصنع ملف هلام فصل:

ضع إطارات الصب (ثبت لوحين زجاجيين في إطارات الصب) على حوامل الصب.

تحضير محلول الجل (كما هو موضح أعلاه) في دورق صغير منفصل.

قم بتدوير المحلول برفق ولكن بشكل كامل.

الماصة كمية مناسبة من محلول الهلام المنفصل (المذكور أعلاه) في الفجوة بين الألواح الزجاجية.

لجعل الجزء العلوي من هلام الفصل أفقيًا ، املأ الماء (إما الأيزوبروبانول) في الفجوة حتى يفيض.

انتظر لمدة 20-30 دقيقة للسماح لها بالهلام.

اعمل ال هلام التراص:

تخلص من الماء ويمكنك رؤية الهلام الفاصل المتبقي.

الماصة في التراص هلام حتى فيض.

أدخل المشط جيد التشكيل دون حبس الهواء تحت الأسنان. انتظر لمدة 20-30 دقيقة للسماح لها بالهلام.

2. تأكد من تكوين هلام كامل من هلام التكديس وإخراج المشط. أخرج الألواح الزجاجية من إطار الصب وضعها في سد الخلية العازلة. صب المخزن المؤقت للتشغيل (العازلة الكهربائي) في الغرفة الداخلية واستمر في التدفق بعد الفائض حتى يصل سطح العازلة إلى المستوى المطلوب في الغرفة الخارجية.

امزج العينات مع عينة المخزن المؤقت (تحميل المخزن المؤقت).

سخنيهم في الماء المغلي لمدة 5-10 دقائق.

4. قم بتحميل العينات المعدة في الآبار وتأكد من عدم تجاوزها. لا تنس تحميل علامة البروتين في المسار الأول. ثم قم بتغطية الجزء العلوي وقم بتوصيل الأنودات.

5. اضبط الفولت المناسب وقم بتشغيل الرحلان الكهربي عند الانتهاء من كل شيء.

6. بالنسبة إلى إجمالي وقت التشغيل ، أوقف تشغيل SDS-PAGE عندما تصل العلامة السفلية لعلامة البروتين (إذا لم تكن هناك علامة مرئية ، استفسر من الشركة المصنعة) تقريبًا عن خط قدم اللوحة الزجاجية. بشكل عام ، حوالي ساعة واحدة لجهد 120 فولت و 12٪ هلام فصل. بالنسبة للهلام المنفصل الذي يحتوي على نسبة أعلى من مادة الأكيلاميد ، فإن الوقت سيكون أطول.

ملحوظة: عوامل مختلفة تؤثر على خواص الهلام الناتج.


  • تتكون معايير البروتين الغربي mPAGE ® من سبعة بروتينات مؤتلفة عند 20 كيلو دالتون و 30 كيلو دالتون و 40 كيلو دالتون و 50 كيلو دالتون و 60 كيلو دالتون و 80 كيلو دالتون و 120 كيلو دالتون مع موقع ارتباط IgG الذي يرتبط بمعظم الأجسام المضادة. يتيح ذلك تصور كل من واسم البروتين وعينة البروتينات على نفس البقعة الغربية بدون كواشف إضافية.
  • تتضمن معايير البروتين الملون mPAGE ® خليطًا من عشرة بروتينات عالية النقاء مسبقة الصبغة تتراوح من 10 كيلو دالتون إلى 203 كيلو دالتون ، مقترنة تساهميًا مع كروموفورات مختلفة. تم تصميم معايير بروتين اللون mPAGE ® لمراقبة فصل البروتين أثناء SDS-PAGE ، والتحقق من كفاءة نقل النشاف الغربي على الأغشية ، وتقريب حجم البروتينات.
  • تتضمن معايير البروتين غير الملوث mPAGE ® خليطًا من اثني عشر بروتينًا غير ملوثًا مؤتلفًا يتراوح من 10 كيلو دالتون إلى 200 كيلو دالتون. تتمتع نطاقات 85 كيلو دالتون و 25 كيلو دالتون و 10 كيلو دالتون بكثافة أعلى لتكون بمثابة نقاط مرجعية. معايير البروتين غير الملون mPAGE ® مناسبة لتحديد الوزن الجزيئي بعد SDS-PAGE أو النشاف الغربي وتعمل كمعايير لمعايرة تنقل العلامات الملطخة مسبقًا.


بروتين A- الجسم المضاد SDS-PAGE - علم الأحياء

منحنيات البروتين القياسية

كما تعلم ، يعتبر الفصل الكهربائي للهلام أداة قوية لفصل وتصور الجزيئات البيولوجية. لقد أجريت عملية الفصل الكهربائي لجيل الاغاروز لفصل أجزاء الحمض النووي في علم الأحياء 151 ، وعلى الأرجح في مختبرات أخرى أيضًا. المختبرين التاليين سوف نستخدم نوعًا من الرحلان الكهربي يسمى SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide electrophoresis) والذي يستخدم لفصل خلائط البروتينات.

في SDS-PAGE ، يغلف المنظف ، كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، البروتينات القابلة للذوبان وعديد الببتيدات بشحنة سالبة موجودة على الجزيء. يمكن للبروتينات المغلفة بـ SDS أن تهاجر بعد ذلك نحو القطب الموجب ، ولكن بمعدلات مختلفة اعتمادًا على أحجامها النسبية. عندما يتم تسخين البروتينات وتغطيتها بـ SDS ، فإنها تفقد هيكلها ثلاثي الأبعاد ، مما يسهل الانتقال عبر مصفوفة الهلام. يتم تغليف عديد الببتيدات الأكبر بمزيد من جزيئات SDS ، وبالتالي فإن نسبة الوزن الجزيئي للبروتين إلى شحنته هي نفسها تقريبًا لجميع البروتينات. هذا يعني أن الحجم (الوزن الجزيئي) يصبح هو العامل المحدد للتنقل عبر الهلام.

كما تعلم ، تتكون العديد من البروتينات الكبيرة متعددة الوحدات من وحدات بروتينية فرعية أصغر. يتم تجميع هذه البولي ببتيدات معًا بواسطة عدد من الروابط ، بما في ذلك الروابط بين ذرات الكبريت في الأحماض الأمينية التي تحتوي عليها. يتم استخدام الحرارة و SDS لكسر جسور ثاني كبريتيد هذه وتحرير وحدات البولي ببتيد المنفصلة.

نتيجة لذلك ، يمكن لبروتين أصلي وظيفي واحد أن يؤدي إلى ظهور العديد من عديد الببتيدات الأصغر والتي قد تظهر على شكل شرائط مميزة على مادة هلامية. الميوسين ، على سبيل المثال ، هو مركب من سلسلتين بروتينيتين ثقيلتين و 4 سلاسل خفيفة. السلاسل الخفيفة ذات حجمين مختلفين ، لذا فإن عينة الميوسين المنقى ستشكل 3 نطاقات منفصلة عند معالجتها بشكل مناسب قبل الرحلان الكهربائي.

تستخدم إجراءات SDS-PAGE المواد الهلامية SDS-PAGE التي يتم تشغيلها في غرف التفريد الرأسية. في هذه الأنظمة ، يتم وضع هلام بولي أكريلاميد في غرفة مملوءة بالعازل بين قطبين. يتم وضع عينات البروتين المعالجة في آبار أعلى الهلام ، ويتم توصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر طاقة يولد تدرج جهد عبر الهلام. عندئذٍ تكون البروتينات سالبة الشحنة والمغلفة بـ SDS قادرة على الهجرة إلى الأسفل عبر الهلام باتجاه القطب الموجب.

يُقاس حجم البروتين بالدالتون ، وهو مقياس للوزن الجزيئي. يُعرَّف الدالتون الواحد بأنه كتلة ذرة الهيدروجين ، وهي 1.66 × 10 24 جرامًا. تحتوي معظم البروتينات على كتل تصل إلى آلاف الدالتون ، لذلك غالبًا ما يستخدم مصطلح كيلودالتون (kD) لوصف الوزن الجزيئي للبروتين. بالنظر إلى أن متوسط ​​وزن الحمض الأميني هو 110 دالتون ، يمكن تقريب عدد الأحماض الأمينية في البروتين من وزنه الجزيئي.

لا تكون البروتينات في عيناتك مرئية أثناء تشغيل الجل ، إلا إذا تم ترصيعها بأصباغ مرتبطة تساهميًا. لذلك ، أثناء تشغيل الرحلان الكهربي النموذجي ، يجب أن تكون قادرًا على رؤية الفصل بين معايير البروتين المرموقة ، ولكن ليس حركة أي بروتينات غير معروفة قيد الدراسة.

كما هو الحال في أي إجراء رحلان كهربي ، إذا ترك التيار الكهربائي في وضع التشغيل لفترة طويلة جدًا ، فإن البروتينات ستخرج من الهلام في الأسفل. لتجنب ذلك ، يتم خلط صبغة تتبع زرقاء مع عينات البروتين المأخوذة من الأجنة. هذه الصبغة الزرقاء مشحونة سلبًا وتوجه أيضًا نحو القطب الموجب. نظرًا لأن جزيئات الصبغة أصغر من البروتينات المتوقعة في معظم العينات ، فإنها تتحرك بسرعة أكبر عبر الهلام.

توجد بشكل عام علاقة خطية بين اللوغاريتمات (القاعدة 10) للوزن الجزيئي للبروتين والمسافة التي يهاجرها جزء البروتين في الهلام. لاحظ أن هذه العلاقة الخطية هي فقط بين لوغاريتم الوزن الجزيئي والمسافة. بسبب هذه العلاقة الخطية ، يمكننا إنشاء معادلة للخط المستقيم تصف اللوغاريتمي الوزن الجزيئي والمسافة المقطوعة.

تسمى هذه الأنواع من المنحنيات المنحنيات القياسية التي يمكن استخدامها لتحديد الوزن الجزيئي لبروتينات غير معروفة. بالطبع لتتمكن من القيام بذلك ، تحتاج إلى معرفة الوزن الجزيئي للبروتينات ، ولهذا السبب نشتري معايير البروتين مثل تلك الموجودة في Bio-Rad أدناه.

جدول معايير البروتين الملون المحتمل

سيكون الإجراء الخاص بمختبر اليوم واضحًا ومباشرًا. سوف تقوم بتنفيذ SDS-PAGE الكمي الكهربائي لمعايير البروتين وإنشاء منحنى قياسي مع أشرطة الخطأ. النقطة الأساسية هي تطوير أسلوبك بحيث يكون لديك اختلاف بسيط في نتائجك.

1. سيوضح مدرسك كيفية تجميع وحدات الهلام الرأسية وتركيب المواد الهلامية SDS-PAGE مسبقة الصب. احرص على عدم تشديد مشابك الهلام أكثر من اللازم

2. أضف محلول فصل كهربائي وتأكد من عدم وجود تسرب في النظام. أصلح التسريبات إذا لزم الأمر.

3. تحميل أكبر عدد ممكن من 10 عينات ul من المعايير كما هو متاح لديك. سيعتمد هذا على تكلفة المعايير ومقدار المتاح.

4. قم بتشغيل المواد الهلامية لمدة 45 دقيقة أو حتى تصل العصابات السريعة الحركة نحو نهايات الجل.

5. قم بإزالة الجل من ألواح الساندويتش. ضع على طاولة خفيفة وقراءة المسافة المقطوعة مباشرة. قم بالقياس من أسفل البئر إلى مقدمة الشريط. إذا كانت لديك معايير غير ملوثة ، فستحتاج إلى تلطيخها. سيتم توفير إجراء التلوين إذا لزم الأمر ، وهناك نوعان من بقع البروتين العامة القياسية التي يمكن استخدامها اعتمادًا على مزيج المعايير لدينا.

6. سيتم تزويدك بالأوزان الجزيئية للمعايير. استخدم هذه الأوزان لإنشاء منحنى قياسي مع أشرطة الخطأ (راجع المعمل السابق لمعرفة الإجراء). قم بتضمين معادلة لخط الانحدار. تذكر أن تأخذ لوغاريتم الأساس 10 للأوزان الجزيئية عند عمل المنحنى القياسي.

المواد المدرجة أدناه مطلوبة لإجراء تجربة اليوم. يتم استخدامها لمعالجة العينات ، ولإعداد وتحليل المواد الهلامية SDS-PAGE.

- اسطوانات متدرجة وزجاج ماء مقطر

- 50 ميكرولتر / مجموعة معايير البروتين

- قفازات ، مساطر بلاستيكية شفافة ، حامل أنبوب اختبار لأنابيب الاختبار الساخنة

- حوامل مواسير للمواسير 0.5 مل

- الماصات ، eppendopf و 10 مل ، صواني تلطيخ البلاستيك (6 & quot X 6 & quot)

- ضبط الكتل الساخنة على 95 درجة مئوية لتسخين العينات

1. مركز التدريب المتقدم في الخلية والبيولوجيا الجزيئية. جاءت بعض المواد الخاصة بمختبر اليوم من ورشة عمل حضرتها بعنوان & quotSeparation Techniques & quot ، الدكتور فرانك كاستورا ، مدير الجامعة الكاثوليكية ، واشنطن العاصمة.

2. Davis، L.D.، Dibner، M.D. and Battey، J.F. 1986. الطرق الأساسية في البيولوجيا الجزيئية. إلسفير ، نيويورك. ص 58-75.

3. جاسك ، م 1989. دليل التجارب المعملية في بيولوجيا الخلية. مرحاض. براون للنشر ، دوبوك ، أيوا.

4. بيرجمان ، أ. 1990. الفحوصات المخبرية في البيولوجيا الخلوية والجزيئية. الطبعة الثالثة. جون وايلي وأولاده ، نيويورك.

5. Hames، B.D. وريكوود ، د. 1988. الرحلان الكهربائي للهلام للبروتينات ، نهج عملي. مطبعة IRL ، واشنطن العاصمة.

تحديد الوزن الجزيئي لمزيج من البروتينات غير المعروفة

لذلك ، بناءً على معمل الأسبوع الماضي ، فأنت جميعًا على دراية بـ SDS-PAGE وكيفية إنشاء منحنى قياسي. مهمتك هذا الأسبوع هي تصميم وتنفيذ تجربة لتحديد الوزن الجزيئي لمزيج من البروتينات غير المعروفة. ستحتاج مجموعتك إلى قراءة هذا المعمل ومقابلة المعلم قبل هذا المعمل لتقديم تصميمك التجريبي. خلال اجتماعات ما قبل المعمل ، سأطرح عادةً أسئلة على المجموعة مثل:

1. ما الذي تحاول القيام به بكلمات بسيطة في هذا المعمل؟

2. ما هي فرضيتك وفرضية العدم؟

3. ما هي مصفوفة التصميم التجريبية الخاصة بك؟ سوف اريد ان اراها مكتوبة

4. كيف ستحلل / تحدد بياناتك؟ أريدك أن تكون محددًا.

بالنسبة لهذا المعمل التجريبي الأول ، كنت سأقوم بإعطاء مجموعات الطلاب مزيجًا من الدم الكامل وجعلك تصف بروتينات البلازما الموجودة ، لكنك تحتاج حقًا إلى تركيز بروتينات الدم قليلاً للحصول على نتائج جيدة. لذا بدلاً من ذلك سأقدم لك نفس المواد التي تناولتها الأسبوع الماضي بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من مزيج غير معروف من البروتينات. مرة أخرى ، مهمتك هي تصميم وتنفيذ تجربة لتحديد الوزن الجزيئي لهذه البروتينات.

نظرًا لأن خليط البروتين غير المعروف غير ملوث ، ستحتاج إلى تصورها باستخدام إجراء تلطيخ coomassie. ترتبط أصباغ Coomassie بالبروتينات من خلال التفاعلات الأيونية بين مجموعات حمض السلفونيك الصبغية ومجموعات البروتين الأمينية الإيجابية وكذلك من خلال عوامل الجذب Van der Waals. هناك عدد من بروتوكولات التلوين التي تتضمن جميعها اختلافات في موضوع التلوين ، ثم التخلص من الجل. هنا واحد يعمل بشكل جيد:

1. اغمر الجل في محلول التلوين.

2. الميكروويف لمدة 30 ثانية ، لم أجرب هذا من قبل ، لكن من المفترض أن يسرعه.

3. ضع الجل على منصة دوارة ورجها ببطء حتى تصبح العصابات مرئية. يستغرق حوالي نصف ساعة (يستخدم الميكروويف لتسريع عملية التلوين).

4. تخلص من محلول التلوين وحفظه للاستخدام في المستقبل.

5. شطف الجل عدة مرات بالماء النقي.

7. اغمر الجل في محلول التقديم.

8. الميكروويف لمدة 30 ثانية ، مرة أخرى ، لم أجرب هذا من قبل ، ولكن من المنطقي أنه سيسرع الإجراء.

9. قم بطي وضع عدة أوراق من مناديل Kimwipes في زاوية الحاوية (تحتوي الورقة على بروتينات وترتبط بالبقعة ، مما يؤدي إلى تسريع عملية التخلص).

10. ضع الجل مرة أخرى على منصة دوارة ورجها حتى تصبح العصابات مرئية. يستغرق هذا حوالي نصف ساعة. بدلا من ذلك ، يمكنك تركها بين عشية وضحاها.

11. قم باستبدال المنشفة الورقية ، إذا لزم الأمر. الفكرة الكاملة في التدمير هي أن coommassie تلطخ كل شيء ، هلام وعصابات. يجب عليك إزالة معظم البقعة من الجل حتى تتمكن من رؤية العصابات.

ثانيًا. المواد سيتم تزويدك بالمواد التالية:

- محلول التلوين الأزرق coommasie ، يمكن أن يتكون في مجموعة ، أو مصنوع من مزيج أدناه

- 50 ميكرولتر / مجموعة خليط بروتين غير معروف

- 50 ميكرولتر / مجموعة معايير البروتين

- اسطوانات متدرجة وزجاج ماء مقطر

- قفازات ، مساطر بلاستيكية شفافة ، حامل أنبوب اختبار لأنابيب الاختبار الساخنة

- حوامل مواسير للمواسير 0.5 مل

- الماصات ، eppendopf و 10 مل ، صواني تلطيخ البلاستيك (6 & quot X 6 & quot)

- ضبط الكتل الساخنة على 95 درجة مئوية لتسخين العينات

محلول تلطيخ 1 لتر:

100 مل حمض الخليك الجليدي

2.5 جرام كوماسي بريليانت بلو R-250

مرشح الحل من خلال مرشح Whatman رقم 1 لإزالة الشوائب.

الحل المقصود 1 لتر:

50 مل حمض الخليك الجليدي

2. مركز التدريب المتقدم في الخلية والبيولوجيا الجزيئية. جاءت بعض المواد الخاصة بمختبر اليوم من ورشة عمل حضرتها بعنوان & quotSeparation Techniques & quot ، الدكتور فرانك كاستورا ، مدير الجامعة الكاثوليكية ، واشنطن العاصمة.

3. Davis، L.D.، Dibner، M.D. and Battey، J.F. 1986. الطرق الأساسية في البيولوجيا الجزيئية. إلسفير ، نيويورك. ص 58-75.

4. جاسك ، م 1989. دليل التجارب المعملية في بيولوجيا الخلية. مرحاض. براون للنشر ، دوبوك ، أيوا.

5. بيرجمان ، أ. 1990. الفحوصات المخبرية في البيولوجيا الخلوية والجزيئية. الطبعة الثالثة. جون وايلي وأولاده ، نيويورك.

6. Hames، B.D. وريكوود ، د. 1988. الرحلان الكهربائي للهلام للبروتينات ، نهج عملي. مطبعة IRL ، واشنطن العاصمة.

ملاحظات للمختبر التجريبي الأول

عند تصميم تجربتك ، ضع ما يلي في الاعتبار. يجب إكمال تجربتك وتحليلها ويجب إكمال تقرير شفهي ومكتوب في مختبر الأسبوع التالي. يتكون المعمل رقم 4 من عرض شفهي لنتائج تجربتك في الفصل. يجب أن يأخذ العرض الشفوي لمجموعتك شكل:

مقدمة: خلفية لما فعلته ، ولماذا قررت القيام به ، وما كنت تأمل في تحقيقه ، وقد يشمل ذلك بيانًا يصف فرضيتك الصفرية

الطرق: يجب أن يشمل ذلك تصميم التجربة وكيف بدأت فعليًا في أداء عملك

النتائج: يجب أن يتضمن هذا عرضًا تقديميًا لنتائجك ومناقشة أهميتها ، ويجب أن يتضمن الرسوم البيانية (النفقات العامة) حيثما كان ذلك مناسبًا والتحليل الإحصائي الذي استخدمته لإعطاء درجة معينة من الثقة في نتائجك

يجب أن تخطط لعرضك التقديمي الذي يستغرق حوالي 15-20 دقيقة. سيتيح ذلك حوالي 10 دقائق للمناقشة. يجب على جميع الأعضاء المشاركة في المناقشة وكتابة التجربة. يمكن للمجموعة العمل معًا في كتابة تقرير مشترك عن تجربتهم. سيتم تحديد درجتك في المكون المختبري للدورة من خلال العوامل التالية:

2. جودة العرض الشفوي (انظر نموذج التقييم)

3. جودة الكتابة المعملية الخاصة بك

يجب كتابة التقارير المكتوبة واستخدام القواعد الصحيحة. تقاريرك المكتوبة لا يمكن أن يكون مجرد نسخة ورقية من عرض PowerPoint التقديمي الخاص بك. يجب أن تتضمن أي رسوم بيانية أو تحليل إحصائي استخدمته. راجع المعمل الأول للحصول على تنسيق أكثر اكتمالاً للكتابات المعملية. عندما تقوم مجموعتك بتسليم تقريرها المكتوب ، يجب أن يتم التوقيع عليه من قبل جميع أعضاء المجموعة. بجانب توقيعاتك يجب أن يكون لديك نسبة (0 - 100٪). يمثل هذا الرقم مقدار الوقت الذي يقضيه كل عضو في كتابة التجربة وإعداد التقرير الشفوي.

يجب أن يصل مجموع هذه النسب المئوية إلى 100٪. من الناحية المثالية ، يجب على كل عضو أن يبذل نفس القدر من العمل. على سبيل المثال ، إذا كان هناك ثلاثة أشخاص في المجموعة ، فمن الأفضل أن يضع كل طالب 33.3٪ من العمل في تحليل البيانات وكتابة التجربة وإعداد التقرير الشفوي. انظر النشرة المعملية الأولى للشكل الذي سيتم استخدامه للتقارير المكتوبة.


تنقية الجسم المضاد: كروماتوجرافيا التقارب - البروتين A والبروتين G Sepharose

يعتمد كروماتوغرافيا التقارب على التفاعل القابل للانعكاس بين بروتين ورابط محدد مثبت في مصفوفة كروماتوغرافية. يتم تطبيق العينة في ظل الظروف التي تفضل ارتباطًا محددًا بالرابط كنتيجة للتفاعلات الكهروستاتيكية والطارئة للماء ، وقوى فان دير فال و / أو الرابطة الهيدروجينية. بعد غسل المادة غير المربوطة ، يتم استعادة البروتين المرتبط عن طريق تغيير ظروف المخزن المؤقت إلى تلك التي تفضل الامتصاص. تم استخدام هذه التقنية ليس فقط لعزل الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد ولكن أيضًا لإزالة الملوثات المحددة من العينات البيولوجية. تم وصف طرق تنقية الجلوبولينات المناعية ، وهي IgG ، وشظايا IgG والفئات الفرعية ، باستخدام التقارب العالي للبروتين A والبروتين G المقترن ب agarose. يوجد في العنوان الفرعي 3 أيضًا بروتوكولات لتنقية التقارب باستخدام يجند محدد مقترنًا بالمصفوفات التجارية مثل CNBr- Sepharose 4-B و Affigel.


SDS PAGE المعروف أيضًا باسم Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis هو تقنية تستخدم لفصل البروتينات على أساس وزنها الجزيئي. إنها تقنية مستخدمة على نطاق واسع في الطب الشرعي وعلم الوراثة والتكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لفصل جزيئات البروتين بناءً على حركتها الكهربي.

مبدأ SDS-PAGE

ينص مبدأ SDS-PAGE على أن الجزيء المشحون يهاجر إلى القطب مع الإشارة المعاكسة عند وضعه في مجال كهربائي. سيتم الفصل على أنه تنقل الأنواع المشحونة. تميل الجزيئات الصغيرة إلى التحرك بشكل أسرع بسبب مقاومتها الأقل في وقت الرحلان الكهربائي. يؤثر معدل الهجرة على هيكل وشحنة البروتين.

تساعد كبريتات دوديسيل الصوديوم والبولي أكريلاميد على القضاء على تأثير بنية البروتينات وشحنها ، ويتم فصل البروتينات بناءً على طول سلسلة البولي ببتيد.

وظيفة SDS في SDS-PAGE

يمكن تعريف SDS على أنه منظف موجود في المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE. تتمثل وظيفة SDS في كسر روابط ثاني كبريتيد البروتينات التي تعطل البنية الثلاثية للبروتينات جنبًا إلى جنب مع بعض عوامل الاختزال.

المواد المطلوبة

مزودات الطاقة: يستخدم لتحويل التيار المتردد إلى تيار مستمر.

المواد الهلامية: يتم تحضيرها ذاتيًا في المختبر أو يتم شراؤها من السوق.

غرف الرحلان الكهربائي: يجب استخدام غرف المواد الهلامية SDS-PAGE الملائمة جيدًا.

عينات البروتين: يذوب البروتين مع محلول SDS-PAGE ويغلى لمدة 10 دقائق. يتم أيضًا إضافة عامل اختزال مثل ديثيوثريتول أو 2-مركابتوإيثانول لتقليل روابط ثاني كبريتيد لمنع أي طي للبروتين العالي.

تشغيل المخزن المؤقت: يتم تشغيل عينات البروتين المملوءة على الجل في المخزن المؤقت للتشغيل SDS-PAGE.

محلول التلوين والوجه: يستخدم محلول البقع Coomassie للتلوين. يتم استخدام محلول تقضي على مادة هلامية. يمكن بعد ذلك ملاحظة عصابات البروتين بالعين المجردة.

سلم البروتين: يتم استخدام سلم البروتين المرجعي لتحديد البروتين محل الاهتمام بناءً على الحجم الجزيئي.

بروتوكول SDS-PAGE

تحضير الجل

يتم الجمع بين جميع الكواشف ، باستثناء TEMED ، لتحضير الجل.

عندما يكون الجل جاهزًا للوضع ، أضف TEMED.

يُسكب الجل المستخدم للفصل في غرفة الصب.

تحتاج إلى وضع البيوتانول قبل البلمرة لإزالة فقاعات الهواء غير المرغوب فيها الموجودة.

بين اللوح الزجاجي ، يتم إدخال المشط.

"الكاسيت الهلامي" عبارة عن جل مبلمر.

اغلي بعض الماء في دورق.

أضف 2-مركابتويثانول إلى المخزن المؤقت للعينة.

ضع محلول العازلة في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وأضف عينات البروتين إليها.

خذ علامات MW في أنابيب منفصلة.

اترك العينات تغلي لمدة أقل من 5 دقائق لتفسد البروتينات تمامًا.

الكهربائي

يتم إخراج علبة الهلام من حامل الصب وتوضع بشكل منفصل في مجموعة القطب الكهربي.

تم تثبيت حامل المشبك على مجموعة القطب.

يضاف عازلة 1X الكهربائي إلى فتحة إطار الصب لملء آبار الهلام.

احتواء 30 مل من العينة المشوهة في البئر.

الخزان مغطى بغطاء والوحدة متصلة بمصدر طاقة.


شاهد الفيديو: طرق فصل وتنقية البروتينات (شهر نوفمبر 2022).