معلومة

هل توجد قاعدة بيانات أو أداة أو طريقة يمكنني استخدامها لمعرفة أي من الشفرات الجينية الخاصة بي لمستقبلات السيتوكين؟

هل توجد قاعدة بيانات أو أداة أو طريقة يمكنني استخدامها لمعرفة أي من الشفرات الجينية الخاصة بي لمستقبلات السيتوكين؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لدي قائمة تضم أكثر من 600 جينة معبر عنها تفاضليًا من تحليلات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية. أريد المضي قدمًا في اكتشاف أي من الكود الجيني لمستقبلات السيتوكين حتى أتمكن من إظهار كيف يختلف تعبيرها عبر المجموعات على خريطة حرارية. هل يمكن لأي شخص أن يعطيني تلميحًا حول الأداة أو الطريقة التي يمكنني استخدامها لمعرفة أي من الكود الجيني لمستقبلات السيتوكين؟

شكرا لك مقدما.


أنا متأكد من أن هناك العديد من الطرق للقيام بذلك (بما في ذلك البحث الأدبي عبر PubMed) ، ولكن كبداية ، بحثت في قاعدة بيانات مصطلح GO والتي ، بالنسبة لمصطلح البحث "نشاط مستقبلات السيتوكين" ، أعاد هذا ، والذي يتضمن عددًا من الجينات التي يمكنني تنزيلها كملف Excel ومطابقتها مع مجموعة الجينات الخاصة بي باستخدام R.


LIQA: قياس وتحليل شكل إسوي طويل القراءة

يمكن لتقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي طويلة القراءة (RNA-seq) تسلسل النصوص كاملة الطول ، مما يسهل استكشاف التعبير الجيني الخاص بالشكل الإسوي عبر تسلسل الحمض النووي الريبي قصير القراءة. نقدم LIQA لقياس التعبير الإسوي واكتشاف أحداث الربط البديل التفاضلي (DAS) باستخدام تسلسل mRNA المباشر طويل القراءة أو بيانات تسلسل cDNA. تدمج LIQA نقاط جودة الزوج الأساسي ومعلومات طول القراءة الخاصة بالشكل الإسوي في نموذج البقاء لتعيين أوزان مختلفة عبر القراءات ، وتستخدم خوارزمية تعظيم التوقعات لتقدير المعلمات. نحن نطبق LIQA على بيانات RNA-seq طويلة القراءة من المرجع البشري العالمي ، وسرطان الدم النخاعي الحاد ، والخلايا الظهارية الحرشفية المريئية ونثبت دقتها العالية في تحديد سمات أحداث الربط البديلة.


هل توجد قاعدة بيانات أو أداة أو طريقة يمكنني استخدامها لمعرفة أي من الشفرات الجينية الخاصة بي لمستقبلات السيتوكين؟ - مادة الاحياء

قاعدة بيانات توفر معلومات حول بنية الجينومات المجمعة وأسماء التجميع والبيانات الوصفية الأخرى والتقارير الإحصائية وروابط لبيانات التسلسل الجيني.

مجموعة منسقة من البيانات الوصفية للمجموعات الثقافية والمتاحف والأعشاب ومجموعات التاريخ الطبيعي الأخرى. تعرض السجلات رموز التجميع ، ومعلومات حول المؤسسات الرئيسية للمجموعات ، وروابط إلى البيانات ذات الصلة في NCBI.

مجموعة من دراسات الجينوميات والجينوميات الوظيفية وعلم الوراثة وروابط لمجموعات البيانات الناتجة عنها. يصف هذا المورد نطاق المشروع والمواد والأهداف ويوفر آلية لاسترداد مجموعات البيانات التي يصعب العثور عليها غالبًا بسبب التعليقات التوضيحية غير المتسقة والتقديمات المستقلة المتعددة والطبيعة المتنوعة لأنواع البيانات المتنوعة التي يتم تخزينها غالبًا في قواعد بيانات مختلفة.

تحتوي قاعدة بيانات BioSample على أوصاف لمواد المصدر البيولوجية المستخدمة في المقايسات التجريبية.

جهد تعاوني لتحديد مجموعة أساسية من مناطق ترميز بروتين الإنسان والفأر التي يتم شرحها باستمرار وذات جودة عالية.

يشمل اختلافات النوكليوتيدات المفردة ، والسواتل المكروية ، وعمليات الإدراج والحذف على نطاق صغير. يحتوي dbSNP على بيانات التردد والنمط الجيني الخاصة بالسكان ، والظروف التجريبية ، والسياق الجزيئي ، ومعلومات رسم الخرائط لكل من الاختلافات المحايدة والطفرات السريرية.

قاعدة بيانات التسلسل الجيني للمعاهد الوطنية للصحة ، وهي مجموعة مشروحة لجميع سلاسل الحمض النووي المتاحة للجمهور. GenBank هو جزء من التعاون الدولي لقاعدة بيانات تسلسل النيوكليوتيدات ، والذي يضم بنك بيانات DNA في اليابان (DDBJ) ، ومختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي (EMBL) ، وبنك GenBank في NCBI. تتبادل هذه المنظمات الثلاث البيانات على أساس يومي. يتكون GenBank من عدة أقسام ، يمكن الوصول إلى معظمها من خلال قاعدة بيانات Nucleotide. الاستثناءات هي أقسام EST و GSS ، والتي يتم الوصول إليها من خلال قواعد بيانات Nucleotide EST و Nucleotide GSS ، على التوالي.

تجميع للبيانات من مشروع تسلسل جينوم الإنفلونزا NIAID و GenBank. يوفر أدوات لتحليل تسلسل الإنفلونزا والتعليقات التوضيحية وتقديمها إلى GenBank. يحتوي هذا المورد أيضًا على روابط لمصادر تسلسل الإنفلونزا الأخرى ، والمنشورات والمعلومات العامة حول فيروسات الأنفلونزا.

مشروع يتضمن جمع وتحليل التسلسلات الجينومية لمسببات الأمراض البكتيرية الناشئة عن العزلات الغذائية والبيئية والمرضى. حاليًا ، يتكتل خط الأنابيب الآلي ويحدد التسلسلات التي توفرها بشكل أساسي مختبرات الصحة العامة للمساعدة في التحقيق في تفشي الأمراض المنقولة بالغذاء واكتشاف المصادر المحتملة لتلوث الأغذية.

مجموعة من متواليات النوكليوتيدات من عدة مصادر ، بما في ذلك GenBank و RefSeq وقاعدة بيانات الطرف الثالث للتعليقات التوضيحية (TPA) و PDB. سيؤدي البحث في قاعدة بيانات النيوكليوتيدات إلى نتائج متاحة من كل قاعدة بيانات مكونة لها.

قاعدة بيانات لتسلسلات الحمض النووي ذات الصلة والتي تنشأ من الدراسات المقارنة: علم الوراثة ، والسكان ، والبيئة ، وبدرجة أقل ، الطفرات. كل سجل في قاعدة البيانات عبارة عن مجموعة من تسلسلات الحمض النووي. على سبيل المثال ، توفر مجموعة السكان معلومات عن التباين الجيني داخل الكائن الحي ، في حين قد تحتوي مجموعة النشوء والتطور على متواليات ومواءمتها لجين واحد تم الحصول عليه من العديد من الكائنات الحية ذات الصلة.

سجل عام لكواشف الحمض النووي المصمم للاستخدام في مجموعة متنوعة من تطبيقات البحوث الطبية الحيوية ، جنبًا إلى جنب مع معلومات عن موزعات الكاشف ، وفعالية التحقيق ، وأوجه التشابه في التسلسل المحسوب.

RefSeqGene مجموعة من التسلسلات الجينومية المرجعية الخاصة بالجينات البشرية. الجين RefSeq هو مجموعة فرعية من قاعدة بيانات RefSeq الخاصة بـ NCBI ، ويتم تحديده بناءً على مراجعة من القيمين على قواعد البيانات الخاصة بالموقع ومجتمع الاختبار الجيني. إنها تشكل أساسًا مستقرًا للإبلاغ عن الطفرات ، ولإنشاء اتفاقيات ترقيم متسقة intron و exon ، ولتحديد إحداثيات التباين البيولوجي المهم الآخر. RefSeqGene هو جزء من Locus Reference Genomic Collaboration (LRG). التسلسل المرجعي (RefSeq)

مجموعة من تسلسل الحمض النووي الجيني المنسق وغير الزائد عن الحاجة ونسخة (RNA) وتسلسلات البروتين التي تنتجها NCBI. توفر RefSeqs مرجعًا ثابتًا لتعليقات الجينوم ، وتحديد الجينات وتوصيفها ، وتحليل الطفرات وتعدد الأشكال ، ودراسات التعبير ، والتحليلات المقارنة. يتم الوصول إلى مجموعة RefSeq من خلال قواعد بيانات Nucleotide and Protein.

يخزن أرشيف قراءة التسلسل (SRA) بيانات التسلسل من الجيل التالي من منصات التسلسل بما في ذلك Roche 454 GS System® و Illumina Genome Analyzer® و Life Technologies AB SOLiD System® و Helicos Biosciences Heliscope® و Complete Genomics® و Pacific Biosciences SMRT® .

قاعدة بيانات تحتوي على تسلسلات مبنية من بيانات التسلسل الأولية الموجودة في GenBank. يتم دعم التسلسلات والتعليقات التوضيحية المقابلة بشكل تجريبي وتم نشرها في مجلة علمية محكمة. يتم استرداد سجلات TPA من خلال قاعدة بيانات النيوكليوتيدات.

مستودع لكروماتوجرام تسلسل الحمض النووي (آثار) ، والمكالمات الأساسية ، وتقديرات الجودة لقراءات التمرير الفردي من مختلف مشاريع التسلسل واسعة النطاق.

التحميلات

يتم توفير ملفات BLAST التنفيذية للاستخدام المحلي لأنظمة Solaris و LINUX و Windows و MacOSX. راجع ملف README في دليل ftp للحصول على مزيد من المعلومات. تتوفر أيضًا قواعد بيانات مسبقة التنسيق للنيوكليوتيدات والبروتينات وعمليات البحث المترجمة للتنزيل ضمن دليل فرعي db.

قواعد بيانات التسلسل للاستخدام مع برامج بلاست المستقلة. الملفات الموجودة في هذا الدليل هي قواعد بيانات مسبقة التنسيق وجاهزة للاستخدام مع بلاست.

قواعد بيانات التسلسل بتنسيق FASTA للاستخدام مع برامج BLAST المستقلة. يجب تنسيق قواعد البيانات هذه باستخدام formatdb قبل استخدامها مع بلاست.

يحتوي هذا الموقع على ملفات لجميع سجلات التسلسل في GenBank بتنسيق الملف الثابت الافتراضي. يتم تنظيم الملفات بواسطة قسم GenBank ، ويتم وصف المحتويات الكاملة في ملف README.genbank.

يحتوي هذا الموقع على جميع سجلات تسلسل النيوكليوتيدات والبروتينات في مجموعة التسلسل المرجعي (RefSeq). يحتوي دليل "الإصدار" على أحدث إصدار للمجموعة الكاملة ، بينما تتوفر بيانات الكائنات الحية المختارة (مثل الإنسان والفأر والجرذان) في أدلة منفصلة. البيانات متوفرة في FASTA وتنسيقات الملفات المسطحة. راجع الملف التمهيدي للتفاصيل.

يحتوي هذا الموقع على بيانات التسلسل من الجيل التالي التي ينظمها مشروع التسلسل المقدم.

يحتوي هذا الموقع على بيانات التتبع اللوني التي تنظمها الأنواع. تتضمن البيانات مخطط الكروماتوغرام ، ودرجات الجودة ، وتسلسل FASTA من الاستدعاءات الأساسية التلقائية ، والمعلومات المساعدة الأخرى في نص محدد بعلامات جدولة بالإضافة إلى تنسيقات XML. راجع الملف التمهيدي للتفاصيل.

يحتوي هذا الموقع على قواعد بيانات UniVec و UniVec_Core بتنسيق FASTA. راجع ملف README.uv للحصول على التفاصيل.

يحتوي هذا الموقع على بيانات تسلسل بندقية الجينوم الكاملة المنظمة بواسطة كود المشروع المكون من 4 أرقام. تتضمن البيانات ملفات GenBank و GenPept الثابتة ، ودرجات الجودة وإحصاءات الملخص. راجع ملف README.genbank.wgs لمزيد من المعلومات.

التقديمات

نموذج عبر الإنترنت يوفر واجهة للباحثين والاتحادات والمنظمات لتسجيل مشاريعهم الحيوية. هذا بمثابة نقطة البداية لتقديم البيانات الجينومية والجينية للدراسة. لا يلزم تقديم البيانات في وقت تسجيل BioProject.

أداة إرسال تسلسل قائمة على الويب لواحد أو بضع عمليات إرسال إلى قاعدة بيانات GenBank ، وهي مصممة لجعل عملية الإرسال سريعة وسهلة.

أداة للتقديم إلى قاعدة بيانات GenBank لتسلسلات النيوكليوتيدات القصيرة للرموز الشريطية من موقع وراثي قياسي لاستخدامها في تحديد الأنواع.

أداة برمجية قائمة بذاتها تم تطويرها بواسطة NCBI لتقديم وتحديث الإدخالات إلى قواعد بيانات التسلسل العامة (GenBank أو EMBL أو DDBJ). إنه قادر على التعامل مع عمليات الإرسال البسيطة التي تحتوي على تسلسل mRNA قصير واحد ، والتقديمات المعقدة التي تحتوي على تسلسلات طويلة ، وشروح متعددة ، ومجموعات مجزأة من الحمض النووي ، بالإضافة إلى متواليات من دراسات علم الوراثة والسكان مع المحاذاة. للتقديم البسيط ، استخدم أداة التقديم عبر الإنترنت BankIt بدلاً من ذلك.

برنامج سطر أوامر يقوم بأتمتة إنشاء سجلات التسلسل لتقديمها إلى GenBank باستخدام العديد من الوظائف نفسها مثل Sequin. يتم استخدامه بشكل أساسي لتقديم الجينوم الكامل ودفعات كبيرة من التسلسلات.

يصف هذا الارتباط كيف يمكن لمقدمي بيانات SRA الحصول على موقع NCBI FTP آمن لبياناتهم ، كما يصف تنسيقات البيانات وهياكل الدليل المسموح بها.

نقطة دخول واحدة لمقدمي الطلبات للارتباط والعثور على معلومات حول جميع عمليات تقديم البيانات في NCBI. حاليًا ، يعمل هذا كواجهة لتسجيل BioProjects و BioSamples وتقديم البيانات لـ WGS و GTR. الإضافات المستقبلية لهذا الموقع مخطط لها.

يصف هذا الارتباط كيف يمكن لمقدمي بيانات التتبع الحصول على موقع NCBI FTP آمن لبياناتهم ، كما يصف تنسيقات البيانات وهياكل الدليل المسموح بها.

أدوات

يكتشف مناطق التشابه المحلي بين التسلسلات البيولوجية. يقارن البرنامج تسلسلات النيوكليوتيدات أو البروتينات لتسلسل قواعد البيانات وحساب الأهمية الإحصائية للمطابقات. يمكن استخدام بلاست لاستنتاج العلاقات الوظيفية والتطورية بين التسلسلات وكذلك للمساعدة في تحديد أعضاء عائلات الجينات.

يسمح لك باسترداد السجلات من العديد من قواعد بيانات Entrez عن طريق تحميل ملف GI أو أرقام المدخلات من قواعد بيانات Nucleotide أو Protein ، أو ملف معرفات فريدة من قواعد بيانات Entrez الأخرى. يمكن حفظ نتائج البحث بتنسيقات مختلفة مباشرة إلى ملف محلي على جهاز الكمبيوتر الخاص بك.

الأدوات التي توفر الوصول إلى البيانات داخل نظام Entrez الخاص بـ NCBI خارج واجهة استعلام الويب العادية. أنها توفر طريقة لأتمتة مهام Entrez داخل تطبيقات البرامج. تقوم كل أداة بمهمة استرجاع متخصصة ، ويمكن استخدامها ببساطة عن طريق كتابة عنوان URL منسق بشكل خاص.

تقارن هذه الأداة تسلسلات النيوكليوتيدات أو البروتينات بقواعد بيانات التسلسل الجيني وتحسب الأهمية الإحصائية للمطابقات باستخدام خوارزمية أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST).

تسمح أداة NCBI's Remap للمستخدمين بإسقاط بيانات الشروح وتحويل مواقع الميزات من مجموعة جينية إلى أخرى أو إلى تسلسلات RefSeqGene من خلال تحليل قاعدة تلو الأخرى. يتم توفير الخيارات لضبط صرامة إعادة التعيين ، ويتم عرض النتائج الموجزة على صفحة الويب. يمكن تنزيل النتائج الكاملة للعرض في العارض الرسومي Genome Workbench الخاص بـ NCBI ، كما تتوفر بيانات التعليقات التوضيحية للميزات المعاد تعيينها ، بالإضافة إلى البيانات الموجزة ، للتنزيل.

تطبيق متكامل لعرض وتحليل بيانات التسلسل. باستخدام Genome Workbench ، يمكنك عرض البيانات في قواعد بيانات التسلسل المتاحة للجمهور في NCBI ، ومزج هذه البيانات مع بياناتك الخاصة.

أداة تحليل رسومية تبحث عن جميع إطارات القراءة المفتوحة في تسلسل مستخدم أو في تسلسل موجود بالفعل في قاعدة البيانات. يمكن استخدام ستة عشر رمزًا وراثيًا مختلفًا. يمكن حفظ تسلسل الأحماض الأمينية المستخلصة بتنسيقات مختلفة والبحث في قواعد بيانات البروتين باستخدام بلاست.

تستخدم أداة Primer-BLAST Primer3 لتصميم بادئات PCR لقالب تسلسل. ثم يتم تحليل المنتجات المحتملة تلقائيًا من خلال بحث BLAST مقابل قواعد البيانات المحددة من قبل المستخدم ، للتحقق من الخصوصية للهدف المقصود.

فائدة لحساب محاذاة البروتينات لتسلسل النوكليوتيدات الجينية. وهو يعتمد على تباين خوارزمية المحاذاة العالمية Needleman Wunsch ويحسب على وجه التحديد إشارات الإنترونات والتوصيل. بسبب هذه الخوارزمية ، فإن ProSplign دقيقة في تحديد مواقع لصق وتتسامح مع أخطاء التسلسل.

يوفر عرضًا رسوميًا قابلاً للتكوين لتسلسل النيوكليوتيدات أو البروتين والميزات التي تم شرحها في هذا التسلسل. بالإضافة إلى استخدامه على صفحات قاعدة بيانات تسلسل NCBI ، يتوفر هذا العارض كمكون لصفحة ويب قابلة للتضمين. تتوفر وثائق مفصلة بما في ذلك دليل مرجعي لواجهة برمجة التطبيقات للمطورين الراغبين في تضمين العارض في صفحاتهم الخاصة.

أداة مساعدة لحساب محاذاة تسلسل cDNA-to-Genomic. وهو يعتمد على تباين خوارزمية المحاذاة العالمية Needleman-Wunsch ويحسب على وجه التحديد إشارات الإنترونات والتوصيل. بسبب هذه الخوارزمية ، فإن Splign دقيقة في تحديد مواقع لصق وتتسامح مع أخطاء التسلسل.

نظام للتعرف بسرعة على أجزاء تسلسل الحمض النووي التي قد تكون ذات أصل ناقل. يبحث VecScreen في تسلسل استعلام عن المقاطع التي تطابق أي تسلسل في قاعدة بيانات متجهية متخصصة غير متكررة (UniVec).


عملية الدراسة

عقدت اللجنة اجتماعًا تنظيميًا أوليًا في يناير 2001. قدم مركز السيطرة على الأمراض والمعاهد الوطنية للصحة مسؤولية اللجنة في الاجتماع ، ثم أجرت اللجنة مراجعة عامة لمخاوف سلامة التطعيم. في هذا الاجتماع ، حددت اللجنة أيضًا المنهجية الأساسية التي سيتم استخدامها لتقييم السببية في الفرضيات التي يجب مراعاتها في مداولاتها اللاحقة. تم إنشاء موقع على شبكة الإنترنت (www.iom.edu/imsafety) وقائمة بريدية لتوفير وصول الجمهور إلى المعلومات حول عمل اللجنة ولتيسير الاتصال باللجنة. تم تلخيص استنتاجات وتوصيات تقارير اللجنة حتى الآن (انظر الإطار 1) في الملحق أ.

المربع 1

التقارير السابقة للجنة مراجعة سلامة التطعيم. مراجعة سلامة التحصين: لقاح الحصبة والنكاف والحصبة الألمانية والتوحد (المنظمة الدولية للهجرة ، 2001 أ) مراجعة سلامة التحصين: اللقاحات المحتوية على الثيميروسال والاضطرابات العصبية النمائية (المنظمة الدولية للهجرة ، 2001 ب)

من أجل تقييمها للأسئلة المتعلقة باللقاحات والتوحد ، عقدت اللجنة اجتماعًا علميًا مفتوحًا في فبراير 2004 للاستماع إلى عروض تقديمية حول القضايا ذات الصلة بالموضوع (انظر الملحق ب). يتوفر العديد من هذه العروض التقديمية في شكل إلكتروني (ملفات صوتية وشرائح) على موقع الويب الخاص بالمشروع. بالإضافة إلى ذلك ، استعرضت اللجنة مجموعة واسعة من المواد ، في المقام الأول من المؤلفات العلمية والطبية المنشورة والمراجعة من قبل النظراء. كما أصدرت اللجنة تكليفًا بإعداد ورقة بحثية عن التوحد والجهاز المناعي. يمكن العثور على قائمة بالمواد التي استعرضتها اللجنة ، بما في ذلك العديد من العناصر غير المذكورة في هذا التقرير ، على موقع الويب الخاص بالمشروع.


شكر وتقدير

شكر خاص لـ Leander Dony ، الذي قام بتصحيح دراسة الحالة وتحديثها واختبارها للعمل مع أحدث الأساليب. علاوة على ذلك ، نود أن نشكر العديد من الأشخاص الذين قاموا بمراجعة دفتر دراسة الحالة والمخطوطة وتحسينها بتعليقاتهم وخبراتهم. لهذا ، نعترف بمساهمة مارين باتنر ، وديفيد فيشر ، وأليكس وولف ، ولوكاس سيمون ، ولويس أوسبينا-فوريرو ، وصوفي تريتشلر ، ونيكلاس كوهلر ، وغويكين إيراسلان ، وبنجامين شوبرت ، وميروميت سينجر ، ودانا بير ، وراهول ساتيجا. شكر خاص لهذا أيضًا لمراجعي المخطوطة المجهولين وللمحرر توماس ليمبيرجر على تعليقاتهم الشاملة والبناءة والشاملة. تم اختبار دفتر دراسة الحالة وتحسينه من قبل المستخدمين الأوائل ماريوس لانج ، وحنانه علي ، وسوبارنا باليت ، وليزا ثيرغارت. ساهم فولكر بيرغن وأليكس وولف أيضًا في سير العمل من خلال إجراء تعديلات على scanpy. تم تسهيل اختيار مجموعة البيانات لإظهار جميع جوانب سير عمل التحليل على النحو الأمثل من خلال المدخلات اللطيفة من آدم هابر وأفيف ريجيف. تم دعم هذا العمل من خلال منحة BMBF # 01IS18036A ومنحة # 01IS18053A ، من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) داخل مركز الأبحاث التعاوني 1243 ، المشروع الفرعي A17 ، من قبل جمعية هيلمهولتز (منحة الحاضنة متفرقة 2big ، منحة # ZT-I-0007) ومن خلال مبادرة تشان زوكربيرج DAF (الصندوق الاستشاري لمؤسسة Silicon Valley Community Foundation ، 182835).


يمكن العثور على جميع رموز التحليل الواردة في هذه المخطوطة على http://oshlacklab.com/methyl-geneset-testing/. تم إنشاء موقع التحليل باستخدام سير العمل (1.6.2) حزمة R [38]. يوجد مستودع GitHub المرتبط بموقع التحليل على: https://github.com/Oshlack/methyl-geneset-testing.

النموذج الإحصائي لـ GOmeth

يعتمد الاختبار الإحصائي لـ GOmeth و GOregion على توزيع Wallenius غير المركزي للهندسة الفائقة ، وهو نسخة معممة من التوزيع الهندسي الفائق حيث يتم أخذ عينات من العناصر مع التحيز. بالنسبة لـ GOmeth ، نتخذ الإجراء التدريجي التالي:

لكل CpG أنا مشروح للجين ي، احسب الوزن

إذا تم شرح كل CpG لجين واحد بالضبط ، إذن ثاي جاي = 1.

يترك أنا = 1 ، ... ، أناي تشير إلى CpGs المشروحة على الجين ي. احسب العدد المكافئ لـ CpGs المقاسة عبر الجينات ي كما:

إذا لم يكن هناك CpGs متعددة الجينات مرتبطة ، إذن ني هو ببساطة عدد المجسات المقاسة عبر الجين ي.

يترك أ تحديد مجموعة Cpgs الميثيلية التفاضلية الكبيرة. لكل جين ي، حدد متجه المؤشر 1ي(x) من الطول أناي مثل ذلك xأنا = 1 إذا CpGاي جايأ، و xأنا = 0 إذا CpGاي جايأ، أين أنا = 1 ، ... ، أناي.

يترك ثي تحديد متجه الأوزان ثاي جاي لكل جين ي. احسب نقاط المثيلة التفاضلية لكل جين ي

لاحظ القيمة القصوى لـ سي هو 1 و سي & lt 1 فقط في الحالات التي تكون فيها جميع CpGs المهمة مرتبطة بجينات متعددة ، وتكون الأوزان المجمعة أقل من واحد. سي = 0 عندما لا توجد CpGs ميثلة تفاضليًا عبر الجينات ي.

يترك ي = 1, …, يز تشير إلى الجينات الموجودة في مجموعة الجينات ز. احسب إحصاء الإثراء لاختبار والينيوس غير المركزي للهندسة الفائقة لكل مجموعة جينات ز

بالنسبة لاختبار Wallenius القياسي غير المركزي ، فإن إحصاء الإثراء هو التقاطع بين الجينات والجينات الميثيلية التفاضلية المهمة في مجموعة الجينات ز، والذي يتجاهل CpGs المرتبطة بالجينات المتعددة. إحصائية التخصيب المعدلة ESز حسابات CpGs متعددة الجينات المرتبطة لمجموعة الجينات ز.

احسب دالة ترجيح الاحتمال (PWF) عن طريق تطبيق متوسط ​​متحرك أكثر سلاسة على متجه ثنائي مرتب (بناءً على عدد CpGs المرتبطة) حيث يشير 1 إلى أن الجين ميثلي تفاضلي ويشير 0 إلى أن الجين غير ميثلي تفاضليًا. نستخدم وظيفة "tricubeMovingAverage" في ملف ليما الحزمة التي تشبه منحنى اللوس للمربعات الصغرى بدرجة صفر. يتم ترتيب المتجه الثنائي حسب عدد CpGs المكافئة التي تقيس المثيلة عبر كل جين ، ني، من الأصغر إلى الأكبر. الناتج عبارة عن متجه له نفس طول المدخلات بحيث يتم تعيين احتمالية مثيلة تفاضلية لكل جين بناءً على القيمة المتجانسة. ثم نحسب الاحتمالات المتوقعة للتخصيب لكل مجموعة جينات ز عن طريق حساب متوسط ​​PWF للجينات في المجموعة ومقارنتها بمتوسط ​​PWF لبقية الجينات الممثلة في الصفيف.

لاختبار تخصيب كل مجموعة جينية ز، نحصل على قيمة p من جانب واحد من التوزيع الهندسي غير المركزي في Wallenius مع المعلمات التالية: x = أرضية (ESز), م1 = حجم مجموعة الجينات يز, م2 = عدد الجينات في باقي المصفوفة ، ن = العدد الإجمالي للجينات المهمة ، و احتمال = احتمالز. نحن نستخدم ال منحازة حزمة R للحصول على قيم p.

محاكاة لاغية: أخذ عينات عشوائية من CpGs

اخترنا عشوائيًا مجموعات من 50 و 100 و 500 و 1000 و 5000 و 10000 CpGs من شرح صفيف Illumina لكل من صفيفات 450k و EPIC. تم تكرار أخذ العينات 100 مرة لكل حجم مجموعة CpG. لقد اختبرنا الإثراء الكبير لفئات GO باستخدام اختبار قياسي للهندسة الفائقة (HGT) ، واختبار Wallenius للهندسة الفائقة الذي يحسب انحياز رقم المسبار (HGT-mod) و GOmeth ، الذي يعتمد على اختبار Wallenius للهندسة الفائقة وحسابات رقم المسبار ومتعدد - التحيز الجيني.

مجموعات بيانات الميثيل

تم استخدام العينات العادية من مجموعة بيانات KIRC TCGA [39] لتقدير معدل الاكتشاف الخاطئ لطرق اختبار مجموعة الجينات المختلفة. تم تنزيل البيانات باستخدام ملف برعاية tcgadata حزمة الموصل الحيوي [40] ويتم استخراج 160 عينة عادية. تم توفير البيانات كما تمت معالجتها بالفعل β ومع ذلك ، أجرينا ترشيحًا إضافيًا وأزلنا تحقيقات الجودة الرديئة ، والمجسات التي تحتوي على تعدد الأشكال بالإضافة إلى مجسات الكروموسوم الجنسي. لم تظهر مخططات التحجيم متعددة الأجيال الناتجة أي دليل واضح على الجنس أو تأثيرات تقنية أخرى (الشكل 3 ج).

بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام 85 عينة طبيعية من مجموعة بيانات BRCA TCGA [41] لتقدير معدلات الاكتشاف الخاطئ لطرق اختبار مجموعة الجينات السبعة. تم تنزيل البيانات باستخدام ملف برعاية tcgadata حزمة الموصل الحيوي واستخراج 97 عينة عادية. بعد مراقبة الجودة تمت إزالة 12 عينة (8 بتوزيعات قيمة بيتا غير عادية و 4 عينات أمريكية أفريقية / أفريقية). تم تصفية المجسات ذات الجودة الرديئة والتحقيقات التي تحتوي على SNPs. تم الاحتفاظ بالمجسات الموجودة على الكروموسومات الجنسية لأن جميع العينات كانت من الإناث (ملف إضافي 1: الشكل S3C).

لمقارنة الأداء بين طرق اختبار مجموعة الجينات المختلفة عندما يكون هناك مثيلة تفاضلية كبيرة ، استخدمنا بيانات Illumina Infinium HumanMethylationEPIC (GSE110554) التي تم إنشاؤها من العدلات المصنفة بالتدفق (Neu ، n = 6) ، وحيدات (Mono ، n = 6) ، B - الخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية ، ن = 6) ، خلايا CD4 + T (CD4T ، n = 7 ، ست عينات ونسخة تقنية واحدة) ، خلايا CD8 + T (CD8T ، n = 6) ، الخلايا القاتلة الطبيعية (NK ، n = 6) و 12 خليطًا اصطناعيًا من الحمض النووي (المسمى MIX) [29]. تم استخدام الخلايا المصنفة فقط في تحليلنا. تم تنزيل البيانات باستخدام ملف ExperimentHub حزمة الموصل الحيوي.

قمنا أيضًا بتحليل مجموعة بيانات الخلايا البائية النامية التي تطابقت مع مثيلة الحمض النووي وقياسات التعبير الجيني [42]. تم الحصول على أربعة مجموعات من مراحل نمو الخلايا البائية المبكرة من نخاع عظم الجنين البشري ، من 8 أفراد. تم قياس المثيلة باستخدام Illumina HumanMethylation450 Beadchip ، وتم قياس التعبير الجيني باستخدام GeneChip Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix). تم تحديد المجموعات السكانية الأربعة باستخدام الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي وتتكون من المرحلة 1 (في الغالب السلالات متعددة القدرات والأسلاف اللمفاوية الشائعة) ، والمرحلة 2 (خلايا ما قبل BI) ، والمرحلة 3 (خلايا ما قبل B-II) والمرحلة 4 (خلايا B غير الناضجة ). تم تنزيل البيانات من Gene Expression Omnibus (GSE45461).

التحليل والمعالجة

تم إجراء غالبية التحليل باستخدام R (4.0.3) وبعضها باستخدام R (3.6.1) [43]. يمكن الاطلاع على إصدارات R والحزم المحددة المستخدمة في جوانب مختلفة من التحليل ضمن أقسام "معلومات الجلسة" في موقع التحليل المرتبط بهذه الدراسة: http://oshlacklab.com/methyl-geneset-testing/.

ضبط الجودة والتطبيع

تمت معالجة جميع بيانات المثيلة باستخدام minfi [3 ، 44] حزمة R Bioconductor [45 ، 46]. تم إجراء التطبيع بين الصفيف ونوع المسبار باستخدام طريقة التطبيع الكمي الطبقي (SQN) [47]. تم التخلص من المجسات ذات قيمة الكشف P & gt 0.01 في عينة واحدة أو أكثر. المجسات التي يحتمل أن تتأثر بـ SNPs الشائعة (تردد أليل ثانوي & gt 0) القريبة من CpG ذات الأهمية (حتى 2 نقطة أساس في المنبع و 1 في اتجاه مجرى النهر) والمجسات غير المحددة [37 ، 48] تمت إزالتها أيضًا من التحليل الإضافي.

تحليل احصائي

يتم تمثيل نسبة المثيلة في كل CpG بواسطة βيتم تعريفها على أنها نسبة الإشارة الميثيلية إلى إجمالي الإشارة والمحسوبة من قيم الكثافة الطبيعية. تم إجراء التحليلات الإحصائية على قيم M ( left [M = frac حق] ) كما أوصى دو وآخرون. [49].

مقارنة بين طرق اختبار مجموعة الجينات باستخدام بيانات خلايا الدم المصنفة

تم تركيب نماذج خطية مسبار CpG لتحديد الاختلافات في مثيلة بين أنواع الخلايا (الخلايا B مقابل NK ، CD4 مقابل خلايا CD8 T ، وحيدات مقابل العدلات) باستخدام ليما الحزمة [2]. تم تحديد المجسات الميثيلية التفاضلية (DMPs) باستخدام اختبارات بايز التجريبية المعتدلة [50] ، مما يؤدي إلى انكماش بايز التجريبي القوي للتباينات الجينية للحماية من المجسات شديدة التغير [51]. تم بعد ذلك حساب قيم tp التجريبية Bayes المعتدلة بالنسبة إلى حد أدنى ذي مغزى لتغيير أضعاف السجل (lfc) على مقياس القيمة M (lfc = 0.5 ، المقابلة لـ |Δβ|

0.1) [30]. تم تعديل قيم P للاختبار المتعدد باستخدام إجراء Benjamini-Hochberg [52].

لكل مقارنة ، قمنا باختبار الإثراء الكبير لفئات GO ومسارات KEGG. اختبرنا فقط مجموعات تحتوي على 5 جينات على الأقل و 5000 جين على الأكثر لـ ميثيل جي إس إيه أساليب. تم اختبار 5000 CpGs الأعلى تصنيفًا باستخدام HGT و GOmeth ، من ملكة جمال ميثيل الحزمة ، لإثراء شروط GO ومسارات KEGG. تم تمرير قيم p الأولية كمدخلات إلى ملف ميثيل جي إس إيه أساليب. تم تشغيل أساليب ebGSEA باستخدام ebGSEA حزمة R (https://github.com/aet21/ebGSEA).

مقارنة بين طرق اختبار مجموعة الجينات باستخدام بيانات سرطان الخلايا الصافية في الكلى (KIRC)

بيانات KIRC [39] من برعاية tcgadata تم تقديم الحزمة باسم β تم إخفاء القيم التي تحتوي على نقاط بيانات نقاط البيانات المقنعة على أنها "NA" إذا كانت قيمة اكتشافها أكبر من 0.05 أو تم شرح المسبار على أنه يحتوي على SNP ضمن 10 أزواج أساسية أو كرر خلال 15 زوجًا أساسيًا من CpG الذي تم استجوابه [53]. لقد استخرجنا فقط 160 عينة عادية وأزلنا مجسات بأي قيم NA ، بالإضافة إلى تحقيقات متأثرة بالـ SNP وتحقيقات متعددة الخرائط والكروموسوم الجنسي ، كما هو موضح سابقًا. ترك هذا 364602 مجسًا لتحليل المصب.

أجرينا 100 محاكاة فارغة عن طريق أخذ عينات فرعية عشوائية للعينات العادية وتقسيمها إلى "مجموعتين" مصطنعتين مع 5 و 10 و 20 و 40 و 80 عينة لكل مجموعة. لكل من 100 محاكاة ، في كل حجم عينة ، تم تحديد DMPs بين المجموعات باستخدام اختبارات بايز التجريبية المعتدلة [50] ، مما يؤدي إلى انكماش بايز التجريبي القوي للتباينات الجينية للحماية من تحقيقات فرط التغير [51].

ثم أجرينا اختبار مجموعة الجينات لنتائج تحليل المثيلة التفاضلية باستخدام عدة طرق مع مجموعات جينات MSigDB العريضة المتاحة في تشامب حزمة الموصل الحيوي. تم تشغيل GOmeth باستخدام كل من أعلى 1000 وأعلى 5000 CpGs كمدخلات. ال ميثيل جي إس إيه تم تشغيل طرق mGLM و mRRA (ORA) و mRRA (GSEA) بأحجام مجموعة جينات مقيدة بحد أدنى 5 وحد أقصى 5000 جين. تم تشغيل طريقة ebGSEA باستخدام المعلمات الافتراضية وتمت مقارنة كل من ناتج KPMT و WT.

مقارنة بين طرق اختبار مجموعة الجينات باستخدام بيانات سرطان الثدي الغازية (BRCA)

كما هو الحال مع بيانات KIRC ، تم تنزيل بيانات BRCA [41] باستخدام ملف برعاية tcgadata صفقة. ثم استخرجنا 97 عينة عادية وأزلنا مجسات بأي قيم NA ، بالإضافة إلى تحقيقات متأثرة بالـ SNP وتحقيقات متعددة الخرائط ، كما هو موضح سابقًا. تم الاحتفاظ بتحقيقات الكروموسوم الجنسي لأن جميع المتبرعين بالعينة كانوا من الإناث. ترك هذا 371389 مسبارا لمزيد من التحليل. تمت إزالة اثني عشر عينة خارجية (8 بتوزيعات قيمة بيتا غير عادية و 4 عينات أمريكية أفريقية / أفريقية) ، وترك 85 عينة لتحليل المصب.

أجرينا 100 محاكاة فارغة عن طريق أخذ عينات فرعية عشوائية للعينات العادية وتقسيمها إلى مجموعتين مصطنعتين مع 5 و 10 و 20 و 40 عينة لكل مجموعة. تم تحديد DMPs بين المجموعتين على النحو الموصوف لبيانات KIRC ، متبوعًا بنفس نهج اختبار مجموعة الجينات باستخدام الطرق السبع المختلفة الموضحة مسبقًا.

تحليل بيانات RNA-Seq

تم تنزيل بيانات RNA-Seq لأنواع خلايا الدم المصنفة من SRA (GSE107011 SRP125125) [31 ، 32]. تم تعيين القراءات إلى نسخة مرجع hg19 (http://refgenomes.databio.org/v2/asset/hg19_cdna/fasta/archive؟tag=default) وقياسها باستخدام سمك السلمون (1.2.1) [54]. تم استيراد تقديرات مستوى نسخ السلمون وتلخيصها على مستوى الجينات على أنها TPM بطول مقياس باستخدام tximport حزمة الموصل الحيوي [55]. تم تصفية الجينات المعبر عنها بشكل ضعيف باستخدام حافة [56] وظيفة "filterByExpr" كما وصفها تشين في [57] .. تم تطبيع البيانات بعد ذلك TMM [58] وتحويلها باستخدام "voomWithQualityWeights" [59] ، لزيادة الطاقة عن طريق الجمع بين "voom" [60] المراقبة- أوزان المستوى بأوزان خاصة بالعينة.

تم بعد ذلك تركيب نماذج خطية مسبقة لكل جين لتحديد اختلافات التعبير الجيني بين أنواع الخلايا (الخلايا البائية مقابل الخلايا القاتلة الطبيعية ، الخلايا التائية CD4 مقابل الخلايا التائية CD8 ، الخلايا الوحيدة مقابل العدلات) باستخدام ليما [2]. تم تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا باستخدام اختبارات بايز التجريبية المعتدلة [50] ، مما أدى إلى انكماش بايز التجريبي القوي للتباينات الجينية للحماية من تحقيقات فرط التغير [51]. تم تعديل قيم P للاختبار المتعدد باستخدام إجراء Benjamini-Hochberg [52].

استخدمنا وظيفة goana من ملف ليما حزمة لاختبار تخصيب فئات GO ، kegga لاختبار تخصيب مسارات KEGG ونسخة معممة من goana و kegga لاختبار تخصيب مجموعات جينات MSigDB الواسعة. أخذت جميع الطرق انحياز طول الجين في الاعتبار [23]. تم بعد ذلك تحديد مجموعات الحقيقة GO و KEGG و MSigDB لكل مقارنة نوع خلية من تحليل RNA-Seq كأفضل 100 مجموعة غنية.

بيانات التعبير الجيني صفيف Affymetrix وتحليلها

تم تنزيل بيانات التعبير الجيني Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array لتطوير الخلية قبل B من GEO (GSE45460) [42].

تم تحميل ملفات CEL الأولية ومعالجتها باستخدام ملف قلة حزمة الموصل الحيوي. تم تصحيح البيانات في الخلفية وتطبيعها وتلخيصها باستخدام المعالجة المسبقة لمتوسط ​​الرقائق المتعددة القوي (RMA) [33 ، 34]. تم الاحتفاظ فقط بالمجسات ذات الكثافة المتوسطة التي تزيد عن 4.5 ، في 7 عينات على الأقل. تم تصفية معرفات مجموعة النسخ التي تم تعيينها لمعرفات Entrez المتعددة ، جنبًا إلى جنب مع أي تحقيقات لم يتم تعيينها لمعرفات Entrez ، تاركة 19494 جينًا للتحليل النهائي.

تم بعد ذلك تركيب نماذج خطية مسبقة لكل جين لتحديد اختلافات التعبير الجيني بين المرحلة 1 والمرحلة 2 من تطور الخلية B (المرحلة 1 مقابل المرحلة 2) باستخدام ليما [2]. تم تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا باستخدام اختبارات بايز التجريبية المعتدلة [50] ، مما يؤدي إلى انكماش بايز التجريبي القوي للتباينات الجينية للحماية من تحقيقات فرط التغير [51]. تم تعديل قيم P للاختبار المتعدد باستخدام إجراء Benjamini-Hochberg [52]. الجينات مع السجل2 تغيير أضعاف أكبر من 0.5 باستخدام TREAT [30] و FDR أقل من 0.05 تم اعتبارها معبرة بشكل تفاضلي.

وظيفة goana من ملف ليما تم استخدام الحزمة لاختبار تخصيب فئات GO و kegga لاختبار تخصيب مسارات KEGG. تم بعد ذلك تحديد مجموعات الحقيقة GO و KEGG لمقارنة المرحلة 1 مقابل المرحلة 2 من تحليل التعبير الجيني كأفضل 100 مجموعة غنية.

تقييم GOregion باستخدام بيانات خلايا الدم المصنفة بالتدفق

تم استخدام بيانات lllumina Infinium HumanMethylationEPIC (GSE110554) الناتجة عن خلايا الدم المصنفة بالتدفق لتحديد DMRs. تمت معالجة البيانات كما هو موضح سابقًا. تم تحديد DMRs بين أنواع الخلايا (الخلايا البائية مقابل الخلايا القاتلة الطبيعية ، CD4 مقابل الخلايا التائية CD8 ، الخلايا الوحيدة مقابل العدلات) باستخدام DMRcate حزمة الموصل الحيوي [16]. تم إجراء التحليل على قيم M باستخدام المعلمات الافتراضية. تم إجراء اختبار مجموعة الجينات المصب على قائمة DMRs المصفاة بمتوسط ​​|Δβ| ≥ 0.1 و 3 CpGs أساسية على الأقل.

تم اختبار شروط GO لإثراء الجينات المرتبطة بـ DMR باستخدام goregion و HGT القياسي ، كما هو مطبق في وظيفة goana من ليما حزمة الموصل الحيوي. الجين ، على النحو المحدد في TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene تم تضمين حزمة الموصل الحيوي ، في قائمة الجينات التي سيتم اختبارها باستخدام goana إذا تداخلت مع DMR بمقدار 1 نقطة أساس على الأقل.

تقييم GOregion باستخدام بيانات تطوير الخلايا قبل B

تم استخدام بيانات lllumina Infinium HumanMethylation450 (GSE45459) التي تم إنشاؤها من 4 مراحل من تطوير الخلية B السابقة لتحديد DMRs. تمت معالجة البيانات كما هو موضح سابقًا. تم تحديد DMRs بين المرحلة 1 والمرحلة 2 باستخدام DMRcate حزمة الموصل الحيوي [16]. تم إجراء التحليل على قيم M باستخدام المعلمات الافتراضية. لم يتم تصفية DMRs قبل اختبار مجموعة الجينات.

تم اختبار مصطلحات GO لإثراء الجينات المرتبطة بـ DMR باستخدام goregion و HGT القياسي ، كما هو موضح سابقًا لبيانات خلايا الدم المصنفة.


دليل فحص التكنولوجيا الحيوية (11/91)

ملاحظة: هذه الوثيقة هي مادة مرجعية للمحققين وغيرهم من موظفي إدارة الغذاء والدواء. لا يلزم المستند FDA ، ولا يمنح أي حقوق أو امتيازات أو مزايا أو حصانات لأي شخص (أشخاص) أو عليه.

شكر وتقدير

بدأ هذا الدليل بواسطة روبرت سي فيش ، مدير قسم التحقيقات الميدانية (DFI). طلب السيد فيش من Barbara-Helene mith ، الحاصلة على درجة الدكتوراه ، DIB ، CHI-DO ، رئاسة مجموعة عمل لتطوير إرشادات الفحص للمحققين في مجال التكنولوجيا الحيوية. مجموعة العمل ، التي تضمنت أيضًا ثاديوس ت. سزي ، دكتوراه ، مهندس كيميائي ، DFI ، وكيم أ.رايس ، محقق مشرف ، SEA-DO ، أعدت مسودة وثيقة مع المعلومات التي تم الحصول عليها من مركز FDA والموظفين الميدانيين الذين ينشطون تشارك في عمليات التفتيش على التكنولوجيا الحيوية.

تمت مراجعة الوثيقة والتوسع فيها خلال ورشة عمل مدتها يومان (29 - 3 مايو ، 1999) حضرها موظفو المركز والميدان التاليون: ويندي آرونسون (CBER) ، هنري أفالون (NWK- DO) ، يوان يوان تشيو ، دكتوراه. (CDER) ، Vitolis Vengris ، D.V.M. ، دكتوراه. (CVM) ، John Ingalls (BOS-DO) ، Rita Jhangiani (PHI-DO) ، George Kroehling (CDRH) ، Seth Pauker ، Ph.D. (OB) و Pearl Tanjuaquio (LOS-DO) و Frank Twardochleb (CDRH) و Sylvia Yetts (DAL-DO).

نود أن نعرب عن تقديرنا لجميع الذين شاركوا تقارير التفتيش و FDA-483 ، وساهموا بالخبرة الفنية ، وقدموا التعليقات ، وساعدوا في إعداد هذا الدليل. شكر خاص للسيدة كيمبرلي سيرتش (DFI) لمساعدتها الكتابية الخبيرة.

محتويات

دليل تفتيش التكنولوجيا الحيوية للمحققين

المقدمة

التكنولوجيا الحيوية ، التي تُعرَّف على أنها "تطبيق النظم البيولوجية والكائنات الحية في العمليات التقنية والصناعية" ، ليست جديدة. استمر استخدام الخميرة لتخمير الحبوب وتحويلها إلى كحول لعدة قرون. وبالمثل ، يستخدم المزارعون والمربون شكلاً من أشكال "الهندسة الوراثية" لإنتاج محاصيل ومخزونات محسنة عن طريق اختيار الخصائص المرغوبة في النباتات والحيوانات. في الآونة الأخيرة فقط مكنت تقنيات التكنولوجيا الحيوية "الجديدة" العلماء من تعديل المادة الجينية للكائن الحي على المستوى الخلوي أو الجزيئي. هذه الطرق أكثر دقة ، لكن النتائج مماثلة لتلك التي تم إنتاجها باستخدام تقنيات وراثية كلاسيكية تشمل كائنات حية كاملة. تشير المنتجات المشتقة من التكنولوجيا الحيوية (BDP) المستخدمة في هذا الدليل إلى تلك المنتجات المشتقة من تقنيات التكنولوجيا الحيوية الجديدة.

يقدم تطوير BDP والتفتيش على تصنيع هذه المنتجات والتحكم فيها العديد من التحديات. بسبب عمليات التصنيع والتحكم المتنوعة التي يتم تطويرها باستمرار ، يلزم بذل جهد كبير لتحقيق مستوى من الكفاءة الفنية لفحص هذه العمليات. على الرغم من أن مستوى التكنولوجيا آخذ في الازدياد ، يجب الاعتراف بأن نفس اللوائح والمتطلبات الأساسية تنطبق على تصنيع ومراقبة المواد والأجهزة المشتقة من التكنولوجيا الحيوية كما هو الحال بالنسبة للمنتجات المصنعة "التقليدية".

تم استخدام نفس المعايير لسنوات عديدة في فحص الشركات المصنعة للمضادات الحيوية والإنزيمات والمواد الأخرى ذات الوزن الجزيئي العالي بما في ذلك الأنسولين والهيبارين والألبومين. سيتناول هذا الدليل بعض المشكلات الأساسية التي تم تحديدها أثناء عمليات التفتيش على مصنعي BDP. قد تشمل أنظمة الإنتاج الحيوانات ، والخلايا المستنسخة (مثل الأورام الهجينة) ، والثدييات وخلايا الحشرات ، والخميرة ، والبكتيريا أو مجموعات من هذه الأنظمة.

الهدف الرئيسي من الفحص هو تحديد ما إذا كانت الشركة المصنعة تعمل في حالة رقابة ومتوافقة مع القوانين واللوائح. يعد التزام الشركة بالجودة أمرًا حيويًا ، بغض النظر عن نوع الشركة أو المنتج الذي يتم تصنيعه.

يتمثل أحد الجوانب المهمة للفحص في تحديد المنتج المعيب ، والمنتجات غير المطابقة ، وفشل النظام. تعتبر الطريقة التي تقوم بها الشركات بالتحقيق في الظروف غير المقبولة وتصحيحها وأنظمة التصنيع والتحكم المعيبة جزءًا مهمًا من عملية التفتيش وتوضح عادةً مستوى الجودة داخل الشركة.

كما هو الحال مع عمليات التفتيش المسبق على الأدوية والأجهزة البشرية والبيطرية ، يوصى بإجراء عمليات التفتيش على شركات التكنولوجيا الحيوية من قبل فرق ، مع كون المحقق الرئيسي مسؤولاً عن سير عملية التفتيش بشكل عام. يمكن للمحللين (الكيميائيين و / أو علماء الأحياء الدقيقة) وأخصائيي الكمبيوتر والمهندسين المشاركة في كل أو أجزاء من عملية التفتيش. قبل التفتيش ، يجب على "الفريق" مناقشة واجبات أعضاء الفريق المعينين.

فحص التكنولوجيا الحيوية هو أيضًا فحص خاص بالمنتج. كما هو الحال مع أي فحص ، تكون التغطية عمومًا تدقيقًا وليست شاملة. وبالتالي ، لا يمكن مراجعة بيانات التحقق من الصحة لجميع الأنظمة والعمليات والضوابط وإجراءات الاختبار. ومع ذلك ، ينبغي إعطاء تغطية مفصلة محددة لعدد قليل من الأنظمة أو الضوابط. يجب الحصول على مخطط تدفق من وثيقة الطلب أو من الشركة قبل أو في وقت مبكر من التفتيش ويجب مراجعة خطوات التصنيع المحددة مع الموظفين المسؤولين عن الشركة المصنعة.

زراعة الخلايا والتخمير

    بنك الخلية الرئيسي وبنك الخلايا العاملة

تشتمل المواد الأولية لتصنيع BDP على زراعة الخلايا البكتيرية أو الخميرة أو الحشرات أو الثدييات التي تعبر عن منتج البروتين أو الجسم المضاد وحيد النسيلة محل الاهتمام. يتم استخدام نظام دفعة البذور الخلوية من قبل الشركات المصنعة لضمان هوية ونقاء المواد الخام الأولية. تتكون مجموعة بذور الخلية من قسامات من ثقافة واحدة. بنك الخلايا الرئيسية (MCB) مشتق من مستعمرة واحدة (بكتيريا ، خميرة) أو خلية حقيقية النواة واحدة ، مخزنة مبردة لضمان الاستقرار الجيني وتتكون من أمبولات استنبات كافية لتوفير مادة مصدر لبنك الخلايا العاملة (WCB) . يتم تعريف WCB على أنه كمية من الخلايا المشتقة من أمبولة واحدة أو أكثر من أمبولات MCB ، يتم تخزينها بشكل مبرد واستخدامها لبدء دفعة الإنتاج.

نظرًا لأن الاستقرار الجيني للبنك الخلوي أثناء التخزين والتكاثر يمثل مصدر قلق كبير ، فمن المهم معرفة أصل وتاريخ (عدد الممرات) لكل من MCB و WCB. يتم حفظ أمبولة MCB مجمدة أو مجففة بالتبريد وتستخدم مرة واحدة فقط. من حين لآخر ، قد يتم إنشاء MCB جديد من WCB. يجب اختبار MCB الجديد وتوصيفه بشكل صحيح. بالنسبة للمنتجات البيولوجية ، يجب تقديم طلب ترخيص المنتج أو التعديل والموافقة عليه قبل إنشاء MCB جديد من WCB.

يتم تقديم معلومات حول بناء ناقل التعبير ، والجزء الذي يحتوي على المادة الوراثية التي تشفر المنتج المطلوب ، والنمط الوراثي ذي الصلة والنمط الظاهري للخلية (الخلايا) المضيفة كجزء من تطبيق المنتج. تتمثل الاهتمامات الرئيسية للأنظمة البيولوجية في الاستقرار الجيني لبنوك الخلايا أثناء الإنتاج والتخزين ، وتلوث الكائنات الحية الدقيقة ، ووجود فيروسات داخلية في بعض خطوط خلايا الثدييات. كجزء من وثيقة الطلب ، ستقدم الشركات المصنعة وصفًا لجميع الاختبارات التي تم إجراؤها لتوصيف وتأهيل بنك الخلية.

يجب التأكيد على أن الاختبارات المطلوبة لتوصيف بنك الخلية ستعتمد على الاستخدام المقصود للمنتج النهائي ونظام المضيف / التعبير وطريقة الإنتاج بما في ذلك التقنيات المستخدمة لتنقية المنتج. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتغير أنواع الاختبارات مع تقدم التكنولوجيا.

تم اختبار MCB بدقة. يتم إجراء الاختبارات التالية بشكل عام ، على سبيل المثال لا الحصر:

  1. التوصيف الوراثي ببصمة الحمض النووي
  2. التوصيف المظهري حسب متطلبات المغذيات ، تحليل الإنزيم المتماثل ، النمو والخصائص المورفولوجية
  3. إنتاج قابل للتكرار للمنتج المطلوب
  4. التوصيف الجزيئي للجزء المتجه / المستنسخ عن طريق رسم خرائط إنزيم التقييد وتحليل التسلسل
  5. فحوصات للكشف عن التلوث الفيروسي
  6. فحص النسخ العكسي للكشف عن الفيروسات القهقرية
  7. اختبار العقم واختبار المايكوبلازما لاكتشاف الملوثات الميكروبية الأخرى

ليس من الضروري اختبار WCB على نطاق واسع مثل MCB ومع ذلك ، فإن التوصيف المحدود لـ WCB ضروري. يتم إجراء الاختبارات التالية بشكل عام على WCB ، ولكن هذه القائمة ليست شاملة:

  1. التوصيف المظهري
  2. رسم خرائط إنزيم التقييد
  3. اختبار العقم والميكوبلازما
  4. اختبار الإنتاج القابل للتكرار للمنتج المطلوب

يجب تخزين MCB و WCB في ظروف تضمن الاستقرار الجيني. بشكل عام ، تكون الخلايا المخزنة في النيتروجين السائل أو طورها البخاري مستقرة لفترة أطول من الخلايا المخزنة في -70 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بتخزين MCB و WCB في أكثر من مكان في حالة حدوث عطل في المجمد.

  1. تحقق من أن الإجراءات المكتوبة تعكس بدقة ما يتم تقديمه في وثيقة الطلب. ب. حدد أن سجلات الدُفعات تتبع إجراءات مكتوبة. ج. تحديد هوية وإمكانية تتبع MCB / WCB. د. تحقق من شروط التخزين في كل مكان. ه. تحقق من إمكانية الوصول إلى MCB و WCB. تحديد ما إذا كانت هناك إجراءات أمنية وسجلات المساءلة. F. قم بتوثيق أي عينات من MCB / WCB فشلت في تلبية جميع المواصفات ، خاصة إذا تم إصدارها للاستخدام.

يجب اختيار المواد الخام المستخدمة في تحضير الوسائط بعناية لتوفير معدل النمو المناسب والعناصر الغذائية الأساسية للكائنات التي تنتج المنتج المطلوب. يجب ألا تحتوي المواد الخام على أي مكونات غير مرغوب فيها وسامة يمكن نقلها من خلال زراعة الخلايا والتخمير وعملية التنقية إلى المنتج النهائي. يعد الماء مكونًا مهمًا من مكونات الوسائط وستعتمد جودة المياه على النظام المؤتلف المستخدم ، ومرحلة التصنيع والاستخدام المقصود للمنتج. يجب أن تفي المواد الخام التي تعتبر متشابهة عند توفيرها من قبل بائع مختلف بمعايير القبول قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بإجراء تشغيل تجريبي صغير الحجم متبوعًا بتشغيل إنتاج كامل النطاق عند استخدام المواد الخام من بائع مختلف ، لضمان بقاء معلمات النمو والإنتاجية وتنقية المنتج النهائي كما هي.

تتطلب معظم مزارع خلايا الثدييات مصلًا للنمو. في كثير من الأحيان ، يكون المصل مصدرًا للتلوث بالكائنات العرضية ، وخاصة الميكوبلازما ، ويجب على الشركات اتخاذ الاحتياطات لضمان عقم المصل. تلوث بعض مصل الأبقار البرازيلي (BBS) بمرض الحافر والفم. تأكد أيضًا من أن المصل هو بالفعل مصل بقري وليس مشتقًا من مصادر بشرية.

هناك قلق إضافي من أن مصل الأبقار قد يكون ملوثًا بعامل الاعتلال الدماغي الإسفنجي البقري (BSE). مرض جنون البقر هو مرض بطيء تم اكتشافه في قطعان من المملكة المتحدة. نظرًا لعدم وجود فحص حساس في المختبر للكشف عن وجود هذا العامل ، فمن الضروري أن يعرف المصنعون مصدر المصل ويطلبون شهادة بأن المصل لا يأتي من المناطق التي يتوطن فيها مرض جنون البقر. قد تكون المصادر الأخرى المحتملة لمرض جنون البقر هي البروتياز والإنزيمات الأخرى المشتقة من مصادر الأبقار. طُلب من مصنعي المنتجات البيولوجية تحديد أصل هذه المواد المستخدمة في التصنيع.

يجب تعقيم الوسائط المستخدمة. عادة ما يتم استخدام عملية معقمة في المكان (SIP) أو نظام تعقيم مستمر (CSS). يجب أن تكون أي مغذيات أو مواد كيميائية مضافة بعد هذه النقطة معقمة. يجب أن تتضمن خطوط الهواء مرشحات معقمة.

  1. تحديد مصدر المصل.
  2. تأكد من التحقق من صحة دورة التعقيم بشكل صحيح لضمان تعقيم الوسائط.
  3. تحقق من أن جميع المواد الخام قد تم اختبارها عن طريق مراقبة الجودة. تحديد أصل كل مواد الأبقار.
  4. حالات المستند حيث فشلت الوسائط في تلبية جميع المواصفات.
  5. تحقق من عدم استخدام المواد الخام منتهية الصلاحية في التصنيع.
  6. تأكد من تخزين الوسائط والمواد المضافة الأخرى بشكل صحيح.

يجب إجراء عمليات التلقيح والنقل والحصاد باستخدام المفاعلات الحيوية باستخدام تقنيات معقمة تم التحقق من صحتها. تتم عمليات الإضافة أو السحب من المفاعلات الحيوية الصناعية بشكل عام من خلال خطوط التعقيم بالبخار وتجميعات القفل البخاري. يمكن ترك البخار في المواقف التي لا يكون فيها تسخين الخط أو جدار وعاء المفاعل الحيوي ضارًا بالثقافة.

من المهم مراقبة نظام المفاعل الحيوي عن كثب والتحكم فيه بإحكام لتحقيق التعبير المناسب والفعال للمنتج المطلوب. يجب تحديد معلمات عملية التخمير ومراقبتها. قد تشمل هذه: معدل النمو ، ودرجة الحموضة ، ومستوى المخلفات الثانوية ، واللزوجة ، وإضافة المواد الكيميائية ، والكثافة ، والخلط ، والتهوية ، والرغوة ، وما إلى ذلك. وتشمل العوامل الأخرى التي قد تؤثر على المنتج النهائي قوى القص ، والحرارة الناتجة عن العملية ، وفعالية السدادات. وحشيات.

يمكن أن تؤثر العديد من معلمات النمو على إنتاج البروتين. قد تؤثر بعض هذه العوامل على التهدئة ، أو تكوين الأيزوببتيد ، أو المعالجة المحللة للبروتين في الخلية المضيفة. على الرغم من استخدام الوسائط التي تفتقر إلى المغذيات كآلية اختيار في حالات معينة ، فقد يتسبب نقص الوسائط في بعض الأحماض الأمينية في حدوث بدائل. على سبيل المثال ، عندما يتم تجويع الإشريكية القولونية من الميثيونين و / أو الليوسين أثناء النمو ، فإن الكائن الحي سوف يصنع النورليوسين ويدمجها في وضع يشغله عادة الميثيونين ، مما ينتج عنه نظير للبروتين من النوع البري. سيكون من الصعب فصل وجود هذه المنتجات وثيقة الصلة كروماتوغرافيًا ، وقد يكون لذلك آثار على تطبيق مواصفات الإصدار وفعالية عملية تنقية المنتج.

يجب التحقق من صحة برامج الكمبيوتر المستخدمة للتحكم في مسار التخمير وتسجيل البيانات وتقليل البيانات وتحليلها.

لا تتطلب أنظمة المفاعلات الحيوية المصممة للكائنات الدقيقة المؤتلفة الحفاظ على ثقافة نقية فحسب ، بل تتطلب أيضًا احتواء الثقافة داخل الأنظمة. يمكن تحقيق الاحتواء من خلال الاختيار المناسب لنظام ناقل العائل الذي يكون أقل قدرة على البقاء خارج بيئة المختبر وبالوسائل المادية ، عندما يعتبر ذلك ضروريًا.

تعكس مراجعة الملحق ك من المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة (1991) إضفاء الطابع الرسمي على ممارسات الاحتواء المناسبة والمرافق لإجراء تجارب واسعة النطاق تشمل الكائنات الحية الدقيقة الصناعية المشتقة من الحمض النووي المؤتلف. يستبدل الملحق "ك" أجزاء من الملحق "ز" عندما يتم تضمين كميات تزيد عن 10 لترات من الثقافة في البحث أو الإنتاج. بالنسبة للبحث أو الإنتاج على نطاق واسع ، تم تحديد أربعة مستويات من الاحتواء المادي: GLSP و BL1-LS و BL2-LS و BL3-LS.

(الممارسة الجيدة على نطاق واسع) من الاحتواء المادي موصى به لبحوث واسعة النطاق للإنتاج تتضمن سلالات قابلة للحياة وغير ممرضة وغير سامة مشتقة من الكائنات الحية المضيفة التي لها تاريخ ممتد أو استخدام آمن على نطاق واسع. يوصى بمستوى الاحتواء الفيزيائي GLSP للكائنات الحية مثل تلك التي لديها قيود بيئية مدمجة تسمح بالنمو الأمثل في بيئة واسعة النطاق ولكنها محدودة البقاء على قيد الحياة دون عواقب سلبية في البيئة.

(مستوى السلامة الحيوية 1 - المقياس الكبير) يوصى بمستوى الاحتواء المادي لإجراء أبحاث على نطاق واسع أو إنتاج كائنات حية تحتوي على جزيئات الحمض النووي المؤتلف التي تتطلب احتواء BL1 على نطاق المختبر.

مستوى الاحتواء المادي مطلوب لإجراء أبحاث على نطاق واسع أو إنتاج كائنات حية تحتوي على جزيئات الحمض النووي المؤتلف التي تتطلب احتواء BL2 على نطاق المختبر.

مستوى الاحتواء المادي مطلوب لإجراء أبحاث على نطاق واسع أو إنتاج كائنات حية تحتوي على جزيئات الحمض النووي المؤتلف التي تتطلب احتواء BL3 على نطاق المختبر.

لم يتم وضع أحكام في هذا الوقت لإجراء أبحاث على نطاق واسع أو إنتاج كائنات حية تحتوي على جزيئات الحمض النووي المؤتلف التي تتطلب احتواء BL4 على نطاق المختبر.

يجب ألا يكون هناك كائنات عرضية في النظام أثناء نمو الخلايا. قد تؤثر الكائنات الملوثة في المفاعل الحيوي سلبًا على كل من إنتاجية المنتج وقدرة العملية النهائية على فصل البروتين المطلوب وتنقيته بشكل صحيح. يمكن الكشف عن وجود أو آثار الكائنات الحية الملوثة في المفاعل الحيوي بعدة طرق - معدل النمو ونقاء الثقافة ومقايسة العاثية وملف تعريف الأحماض الدهنية.

  1. تحقق من وجود إجراءات مكتوبة لضمان عدم وجود عوامل عرضية ومعايير موضوعة لرفض عمليات التشغيل الملوثة.
  2. راجع سجلات نمو الخلية وتحقق من أن معلمات تشغيل الإنتاج متوافقة مع النمط المحدد. ج. راجع الإجراءات المكتوبة لتحديد التحقيقات والإجراءات التصحيحية التي سيتم تنفيذها في حالة تجاوز معلمات النمو الحدود الموضوعة.
  3. راجع الإجراءات المكتوبة لتحديد التحقيقات والإجراءات التصحيحية التي سيتم تنفيذها في حالة تجاوز معلمات النمو الحدود الموضوعة.
  4. ضمان تقنيات التعقيم المناسبة أثناء الخلية في 5. نهج التفتيش:
  5. تأكد من استخدام عناصر التحكم المناسبة في العملية قبل إجراء مزيد من المعالجة.

إنتاج الأصول

يمكن إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في مزرعة خلوية أو في بطن فأر. هناك نقاط حرجة فريدة في إنتاج الاستسقاء يجب فحصها.

    مستعمرة الماوس
      توصيف والتحكم في مستعمرة الماوس

    يعد توصيف مستعمرة الفئران المستخدمة في إنتاج الاستسقاء والتحكم فيها أمرًا بالغ الأهمية. يجب تسجيل نوع الماوس والمصدر والبائع والشهادة بأن المستعمرة خالية من الأمراض الفيروسية. يجب عزل الحيوانات المستخدمة في الإنتاج وفحصها يوميًا لمدة أسبوع للتأكد من بقاء الفئران في صحة جيدة واستيفاء جميع معايير القبول. يجب ملاحظة الفئران يوميًا أثناء الإنتاج. يجب أن تكون هناك إجراءات تشغيلية صارمة لإزالة أي فأر لا يبقى بصحة جيدة أثناء الحجر الصحي والإنتاج.

    من الضروري الاهتمام الشديد بأماكن الحيوانات لضمان بقاء الفئران خالية من الأمراض ، وخاصة الفيروسات التي تصيب المستعمرات بشكل شائع. لمنع تلوث المستعمرات الموجودة في غرف مختلفة ، من الجيد أن يرتدي الأشخاص قفازات يمكن التخلص منها ومعاطف المختبر وأغطية الرأس والجوارب بحيث يمكن تغيير هذه العناصر قبل دخول غرفة أخرى. يجب أن تبقى أماكن وأقفاص الحيوانات في حالة صحية.

    يجب تحديد الفئران الفردية بحيث يمكن الاحتفاظ بدقة بتسجيل عدد المرات التي تم فيها النقر بالماوس وكمية السوائل التي تم الحصول عليها من كل نقرة.

    يجب أن يتم حقن الفئران وإزالة سائل الاستسقاء في بيئة نظيفة مثل تحت غطاء أحادي الاتجاه أو في محطة تحمي الفئران من العوامل المعدية. يجب أن تكون هناك إجراءات مكتوبة تصف عملية التنصت. يوصى باستخدام إبرة مختلفة لكل فأر لمنع إمكانية نقل العدوى من الفئران الأخرى. يجب أن تكون هناك أيضًا إجراءات مكتوبة للتعامل مع الإبر مع الالتزام الصارم باحتواء الخطر البيولوجي لمنع التلوث المتبادل.

    بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون هناك إجراءات مكتوبة تصف درجات حرارة التخزين وظروفه قبل المعالجة. وسيشمل ذلك وضع حد زمني للتحصيل والمعالجة. يعتبر تجميع الاستسقاء أمرًا مقبولاً ، ولكن يجب أن تكون هناك إجراءات مكتوبة تصف كيفية تكوين البركة (كم عدد الفئران وأيها يشكل تجمعًا) ويجب أن تعكس السجلات بدقة ما يتكون التجمع. وبالتالي ، إذا تم اكتشاف إصابة حيوان ما ، فسوف تعكس السجلات أي تجمع يحتوي على سائل استسقاء الحيوان المصاب.

    يستخدم Pristane أحيانًا لتغذية الفئران وتعزيز إنتاج الاستسقاء. بالنسبة للمنتجات الحقنية ، يجب على الشركة إثبات أن عملية التنقية ستزيل pristane. لا ينبغي أن يكون هذا مصدر قلق للمنتجات المستخدمة في أجهزة التشخيص في المختبر.

    1. راجع إجراءات التشغيل الموحدة لضمان الضوابط المناسبة للحجر الصحي وقبول الفئران ، والإسكان والعناية بالفئران ، وتحديد الفئران ، والحفاظ على بيئة نظيفة لمنع العدوى الفيروسية للمستعمرة ، والتخلص من الفئران غير الصحية ، ومعالجة سائل الاستسقاء.
    2. مراجعة السجلات للتأكد من أن الحيوانات بصحة جيدة ويتم مراقبتها يوميًا خلال فترة الحجر الصحي والإنتاج.
    3. تحقق من وجود طاقم رعاية حيوانات مؤهل.

    الاستخراج والعزل والتنقية

    بمجرد اكتمال عملية التخمير ، يتم فصل المنتج المطلوب ، وإذا لزم الأمر ، يعاد طيه لاستعادة سلامة التكوين ، وتنقيته. لاستعادة البروتينات داخل الخلايا ، يجب أن تتعطل الخلايا بعد التخمير. يتم ذلك بالطرق الكيميائية أو الأنزيمية أو الفيزيائية. بعد التعطيل ، يمكن إزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي أو الترشيح. لاستعادة البروتين خارج الخلية ، يتم الفصل الأولي للمنتج عن الكائنات الحية المنتجة عن طريق الطرد المركزي أو الترشيح الغشائي. يمكن استخدام طرق الفصل الأولية ، مثل ترسيب كبريتات الأمونيوم والفصل المائي على مرحلتين ، بعد الطرد المركزي لتركيز المنتجات. تتضمن خطوات التنقية الإضافية بشكل أساسي طرق كروماتوغرافية لإزالة الشوائب وتقريب المنتج من المواصفات النهائية.

    1. الاستخراج والعزلة
      1. الترشيح - يستخدم الترشيح الفائق بشكل شائع لإزالة المنتج المطلوب من حطام الخلية. تتم معايرة مسامية المرشح الغشائي إلى وزن جزيئي محدد ، مما يسمح للجزيئات التي تقل عن هذا الوزن بالمرور مع الاحتفاظ بالجزيئات فوق هذا الوزن.
      2. الطرد المركزي - يمكن أن يكون الطرد المركزي مفتوحًا أو مغلقًا. يجب تقييم مدى كفاية البيئة من أجل الطرد المركزي المفتوح.
      1. اللوني تقارب
      2. كروماتوغرافيا التبادل الأيوني (IEC)
      3. هجوم العمالقه
      4. كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء (HIC)
      5. عكس- المرحلة HPLC

      يجب وصف جميع خطوات الفصل والتنقية بالتفصيل وتقديمها مع مخططات التدفق. يجب توفير الأوصاف والمواصفات المناسبة لجميع المعدات والأعمدة والكواشف والمخازن المؤقتة والعوائد المتوقعة. عند الاقتضاء ، يجب مقارنة الإجراءات المكتوبة بمستندات الطلب المقدمة إلى الوكالة. يجب مراجعة شروط التخزين أثناء العملية وفحوصات مراقبة الجودة.

      حددت إدارة الغذاء والدواء (FDA) عملية التحقق من صحة العملية في مايو 1987 "إرشادات حول المبادئ العامة للتحقق من صحة العملية" على النحو التالي:

      المصادقة - إنشاء أدلة موثقة توفر درجة عالية من التأكيد على أن عملية معينة ستنتج باستمرار منتجًا يفي بمواصفاته المحددة مسبقًا وخصائص الجودة.

      نتوقع أن نرى الوثائق التي تبرر العملية وتوضح أن العملية تعمل باستمرار. بالنسبة للمنتجات البيولوجية ، يتم إرسال جميع بيانات التحقق من الصحة ومراجعتها ويتم وضع المواصفات والموافقة عليها كجزء من طلب ترخيص المنتج (PLA).

      يجب أن يكون لدى الشركات المصنعة تقارير تحقق من خطوات العملية الرئيسية المختلفة. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام عمود التبادل الأيوني لإزالة السموم الداخلية ، فيجب أن يكون هناك بيانات توثق أن هذه العملية فعالة باستمرار. من خلال تحديد مستويات الذيفان الداخلي قبل وبعد المعالجة ، يجب أن تكون الشركة المصنعة قادرة على إثبات صحة هذه العملية. من المهم مراقبة العملية قبل وأثناء وبعد تحديد كفاءة كل خطوة تنقية رئيسية. قد يكون "ضخ" المستحضر بكمية معروفة من الملوثات لإثبات إزالته طريقة مفيدة للتحقق من صحة الإجراء.

      عادة ، يقوم المصنعون بتطوير عمليات التنقية على نطاق صغير وتحديد فعالية خطوة المعالجة الخاصة. عندما يتم إجراء توسيع النطاق ، يجب عمل بدلات للعديد من الاختلافات عند مقارنتها مع العملية على نطاق المختبر. يمكن أن تؤثر أوقات المعالجة الأطول على جودة المنتج بشكل سلبي ، حيث يتعرض المنتج لظروف المخزن المؤقت ودرجة الحرارة لفترات أطول. استقرار المنتج ، في ظل ظروف التنقية ، يجب تحديده بعناية. يجب على الشركات المصنعة تحديد قيود وفعالية خطوة معينة. بعد ذلك ، سيقارن التحقق من صحة العملية على دفعة حجم الإنتاج تأثير توسيع النطاق. قد يستخدم المصنعون أحيانًا بيانات التطوير على نطاق صغير للتحقق من صحتها. ومع ذلك ، من المهم إجراء التحقق على دفعات حجم الإنتاج.

      يجب مراجعة عملية التحقق من صحة العملية و / أو تقارير التحقق من صحة بعض عمليات التنقية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أيضًا مراجعة الضوابط والاختبارات المستخدمة لضمان اتساق العملية.

      غالبًا ما يتم تجديد الأعمدة للسماح بالاستخدام المتكرر. يجب تنفيذ إجراءات التحقق المناسبة ويجب مراقبة العملية بشكل دوري بحثًا عن التلوث الكيميائي والميكروبي.

      يرفض المصنعون أحيانًا المنتج بعد عملية التنقية. كما هو الحال مع المنتجات الخاضعة للرقابة الأخرى ، من المتوقع أن تكون تقارير التحقيقات كاملة وتتعلق بدفعات أخرى. على سبيل المثال ، لوحظ خلال إحدى عمليات التفتيش أنه تم رفض ست دفعات تقريبًا من BDP بسبب قوتها المنخفضة ومستويات عالية من الشوائب. تم إرجاع المشكلة إلى عمود وتم رفض جميع الدُفعات التي تمت معالجتها في العمود. وتجدر الإشارة إلى أنه يجب التحقيق في أي مواصفات فاشلة للدفعة.

      لذلك ، من المهم تحديد المنتج المعيب بحيث يمكن توفير تغطية تفتيشية أكثر تفصيلاً لأنظمة التصنيع والتحكم المحددة.

      يجب أن تعتمد جودة المياه على الاستخدام المقصود للمنتج النهائي. على سبيل المثال ، يتطلب CBER جودة الماء للحقن (WFI) لمياه المعالجة. من ناحية أخرى ، قد تكون المياه النقية كافية للتشخيص في المختبر. بالنسبة للأدوية ، تعتمد جودة المياه المطلوبة على العملية. أيضًا ، نظرًا لأن المعالجة تحدث عادةً على البارد أو في درجة حرارة الغرفة ، فإن التعقيم الذاتي لنظام WFI الساخن عند 75 إلى 80 درجة مئوية يتم فقده.

      لأسباب اقتصادية ، تقوم العديد من شركات التكنولوجيا الحيوية بتصنيع WFI عن طريق التناضح العكسي بدلاً من التقطير. تم اكتشاف أن معظم هذه الأنظمة ملوثة. عادة ، يستخدمون الأنابيب البلاستيكية (PVC) وخزانات التخزين غير المغلقة ، والتي يصعب تعقيمها. توفر أي خيوط أو قطرات في نظام بارد منطقة يمكن أن تتكاثر فيها الكائنات الحية الدقيقة. تستخدم بعض الأنظمة مرشح تعقيم طرفي. ومع ذلك ، فإن الشاغل الرئيسي هو السموم الداخلية ، وقد يعمل المرشح النهائي فقط على إخفاء الجودة الحقيقية لـ WFI المستخدم. يجب أيضًا التعرف على قيود الاعتماد على عينة 0.1 مل من WFI للسموم الداخلية من النظام. يجب أن يكون النظام مصممًا لتقديم مياه عالية النقاء ، بحيث تعمل العينة فقط للتأكد من أنها تعمل بشكل كافٍ. كما هو الحال مع أنظمة WFI الأخرى ، إذا كانت هناك حاجة إلى ماء WFI بارد ، فيمكن استخدام المبادلات الحرارية في نقطة الاستخدام.

      يمكن تصنيع المحاليل العازلة على شكل محاليل معقمة وغير مولدة للحمى وتخزينها في حاويات معقمة. قامت بعض المرافق الأصغر بشراء محاليل عازلة تجارية معقمة وغير مولدة للحمى.

      يجب تقييم إنتاج و / أو تخزين المياه غير المعقمة التي قد تكون من درجة الكاشف أو تستخدم كمخزن مؤقت من ناحية الاستقرار والجوانب الميكروبيولوجية.

      أنظمة WFI الخاصة بـ BDP هي نفس أنظمة WFI للمنتجات الخاضعة للتنظيم الأخرى. كما هو الحال مع المنتجات الأخرى الحساسة للحرارة ، يتم استخدام WFI البارد في الصياغة. الأنظمة الباردة عرضة للتلوث. يجب مراقبة WFI البارد لكل من السموم الداخلية والكائنات الحية الدقيقة. يجب مراجعة بيانات التحقق وتقارير المراقبة.

      تعد الجودة الميكروبيولوجية للبيئة أثناء خطوات المعالجة المختلفة مصدر قلق. مع استمرار العملية في اتجاه مجرى النهر ، ينبغي زيادة الاهتمام بالضوابط البيئية والرصد. يجب أيضًا التحكم في البيئة والمناطق المستخدمة لعزل BDP لتقليل الملوثات الميكروبيولوجية وغيرها من الملوثات الأجنبية. يجب أن يكون العزل النموذجي لـ BDP من نفس التحكم مثل البيئة المستخدمة في صياغة المحلول قبل التعقيم والتعبئة.

      إجراء التنظيف

      يجب التحقق من إجراءات التنظيف الخاصة بمعالجة المعدات ، بما في ذلك الأعمدة. هذا مهم بشكل خاص لمنشأة متعددة المنتجات. يجب أن تحدد الشركة المصنعة درجة فعالية إجراء التنظيف لكل BDP أو وسيط مستخدم في تلك القطعة المعينة من المعدات.

      يجب أن تتحقق بيانات التحقق من أن عملية التنظيف ستقلل المخلفات المحددة إلى مستوى مقبول. ومع ذلك ، قد لا يكون من الممكن إزالة كل أثر للمواد على الإطلاق ، حتى مع وجود عدد معقول من دورات التنظيف. يجب تبرير مستوى المخلفات المسموح به ، معبراً عنه عمومًا بالأجزاء لكل مليون (جزء في المليون) ، من قبل الشركة المصنعة. يجب أن يزيل التنظيف السموم الداخلية والبكتيريا والعناصر السامة والبروتينات الملوثة ، مع عدم التأثير سلبًا على أداء العمود. يجب أن تشمل التغطية التفتيشية الخاصة بالتنظيف ما يلي:

        إجراءات التنظيف التفصيلية

      يجب أن يكون هناك إجراء مكتوب لتنظيف المعدات يوفر تفاصيل حول ما يجب القيام به والمواد التي سيتم استخدامها. تسرد بعض الشركات المصنعة المذيب المحدد لكل BDP وسيط.

      بالنسبة للسفن الثابتة ، غالبًا ما يتم العثور على جهاز نظيف في المكان (CIP). لتقييم هذه الأنظمة ، ستكون المخططات ضرورية ، إلى جانب تحديد الصمامات المحددة.

      بعد التنظيف ، يجب إجراء بعض الاختبارات الروتينية للتأكد من أن السطح قد تم تنظيفه إلى المستوى الذي تم التحقق من صحته. تتمثل إحدى الطرق الشائعة في تحليل ماء الشطف النهائي أو المذيب لمعرفة وجود عوامل التنظيف التي تم استخدامها مؤخرًا في تلك القطعة من المعدات. يجب أن يكون هناك دائمًا تحديد مباشر للمادة المتبقية.

      جزء من إجابة السؤال ، "ما مدى النظافة النظيفة؟" ، هو "ما مدى جودة نظامك التحليلي؟" أدت حساسية الجهاز التحليلي الحديث إلى خفض بعض عتبات الكشف إلى ما دون الأجزاء لكل مليون (جزء في المليون) ، وصولاً إلى أجزاء في المليار (جزء في المليون).

      يجب أن تكون حدود المخلفات المحددة لكل قطعة من الأجهزة عملية وقابلة للتحقيق ويمكن التحقق منها. عند مراجعة هذه الحدود ، تأكد من الأساس المنطقي للتأسيس على هذا المستوى. يجب أن تكون الجهة المصنعة قادرة على توثيق أن المستوى المتبقي المسموح به له أساس علمي سليم من خلال البيانات.

      هناك عامل آخر يجب مراعاته وهو التوزيع غير المنتظم المحتمل للبقايا على قطعة من المعدات. قد يكون متوسط ​​تركيز المخلفات الفعلي أكثر من المستوى المكتشف.

      المعالجة والتعبئة

      لا يمكن تعقيم معظم BDP نهائيًا ويجب تصنيعه بمعالجة معقمة. يعد وجود الملوثات المتعلقة بالعملية في منتج أو جهاز مشكلة تتعلق بالسلامة بشكل أساسي. مصادر الملوثات هي أساسًا ركيزة الخلية (DNA ، وبروتينات الخلية المضيفة ، والمكونات الخلوية الأخرى ، والفيروسات) ، والوسائط (البروتينات ، والأمصال ، والمواد المضافة) وعملية التنقية (المواد الكيميائية ذات الصلة بالعملية ، والشوائب المتعلقة بالمنتج).

      نظرًا لاعتبارات الاستقرار ، فإن معظم BDP إما مبردة أو مجففة بالتجميد. كما أن درجات الحرارة المنخفضة ومحتوى الرطوبة المنخفض من العوامل الرادعة للتكاثر الميكروبيولوجي. للتحقق من صحة المعالجة المعقمة للجرعة المفردة من الأدوية الحيوية غير المحفوظة (المملوءة بتعقيم) المخزنة في درجة حرارة الغرفة كمحلول ، يجب التعرف على حدود معدل تلوث تعبئة الوسائط بنسبة 0.1 ٪.

      يجب مراجعة بيانات تعبئة الوسائط والتحقق من صحة عملية التصنيع المعقم أثناء الفحص. قد لا يكون بعض BDP مستقرًا جدًا وقد يتطلب خلطًا ومعالجة لطيفة. في حين أن الترشيح المزدوج شائع نسبيًا للحقن المعقم المملوء بالعقم ، فإن الترشيح الفردي عند ضغوط منخفضة يتم إجراؤه عادةً لـ BDP. ولهذا السبب تكون اتجاهات التصنيع محددة ، مع إعطاء أقصى قدر من ضغوط الترشيح.

      يجب أن يتضمن الفحص مراجعة لتوجيهات التصنيع في سجلات الدُفعات للتأكد من أنها كاملة ومحددة.

      يجب التحكم في البيئة وإمكانية الوصول إلى دفعات BDP غير المعقمة. نظرًا لأن العديد من هذه المنتجات تفتقر إلى مواد حافظة أو نشاط جراثيم متأصل أو نشاط فطري ، يجب أن تكون الحمولة الحيوية قبل التعقيم منخفضة ويجب تحديد الحمولة الحيوية قبل تعقيم هذه المحاليل السائبة وقبل التعبئة. من الواضح أنه يجب التحكم في تجميع هذه المحاليل السائبة أو تركيبها من أجل منع أي زيادة محتملة في المستويات الميكروبيولوجية التي قد تحدث حتى وقت ترشيح المحاليل السائبة (معقمة). أحد المخاوف المتعلقة بأي مستوى ميكروبيولوجي هو الزيادة المحتملة في السموم الداخلية التي قد تتطور. قد تتضمن الممارسات الجيدة لتركيب هذه المنتجات أيضًا الخلط في بيئة خاضعة للرقابة وفي خزانات محكمة الغلق ، خاصة إذا كان سيتم تخزين المحلول قبل التعقيم. قد تتضمن الممارسات الجيدة أيضًا قيودًا على طول وقت التصنيع بين التركيب والتعقيم.

      يعد الاختبار أثناء العملية جزءًا أساسيًا من مراقبة الجودة ويضمن أن الأداء الفعلي للعملية في الوقت الفعلي مقبول. من أمثلة الضوابط أثناء العملية: معلمات التدفق ، وملامح الكروماتوغرافيا ، وأنواع البروتين وتركيزات البروتين ، والنشاط الحيوي ، والحمل الحيوي ، ومستويات الذيفان الداخلي. تتطلب هذه المجموعة من الضوابط قيد التشغيل واختيار معايير القبول التنسيق مع نتائج برنامج التحقق من الصحة.

      يطرح ملء BDP في أمبولات أو قوارير العديد من نفس المشاكل مثل معالجة المنتجات التقليدية. في الشركات الراسخة ، تعتبر هذه القضايا روتينية نسبيًا. ومع ذلك ، بالنسبة لمرفق BDP الجديد ، فإن محاولة تطوير وإثبات الفعالية والسلامة السريرية إلى جانب التحقق من صحة العمليات والمعدات والأنظمة المعقمة ، يمكن أن تكون عملية طويلة ، خاصة إذا لم تكن المتطلبات مفهومة بشكل واضح.

      من المحتمل أن يكون حجم الدفعة من BDP ، على الأقل عند إنتاجه في البداية ، صغيرًا. نظرًا لصغر حجم الدُفعة ، قد لا تكون خطوط الملء آلية كما هو الحال بالنسبة للمنتجات الأخرى التي يتم ملؤها بكميات أكبر. وبالتالي ، هناك مشاركة أكبر للأشخاص الذين يملئون هذه المنتجات ، لا سيما في بعض الشركات الأصغر والأحدث.

      تشمل المشاكل التي تم تحديدها أثناء الملء عدم كفاية الملابس التي تعاني من نقص برامج المراقبة البيئية وسدادة القوارير يدويًا ، لا سيما تلك التي يجب تجميدها بالتجميد والفشل في التحقق من صحة بعض عمليات التعقيم الأساسية. بسبب المشاركة النشطة للأشخاص في عمليات الملء والتعقيم ، يجب تقليل عدد الأشخاص المشاركين في هذه العمليات ، ويجب أن يتضمن البرنامج البيئي تقييمًا للعينات الميكروبيولوجية المأخوذة من الأشخاص العاملين في مناطق المعالجة المعقمة. يجب مراجعة هذا البرنامج مع البيانات أثناء التفتيش.

      مصدر قلق آخر بشأن استقرار المنتج هو استخدام الغاز الخامل لتحل محل الأكسجين أثناء معالجة المحلول وتعبئته. كما هو الحال مع المنتجات الأخرى التي قد تكون حساسة للأكسدة ، يجب وضع حدود لمستويات الأكسجين المذاب للمحلول. وبالمثل ، يجب أن يتضمن التحقق من صحة عملية الملء معلمات مثل سرعة الخط وموقع ملء الحقن فيما يتعلق بالإغلاق ، لضمان الحد الأدنى من التعرض للهواء (الأكسجين) للمنتجات الحساسة للأكسجين. في حالة عدم وجود إزاحة غاز خامل ، يجب أن تكون الشركة المصنعة قادرة على إثبات أن المنتج لا يتأثر بالأكسجين. قد تتم مراجعة هذه البيانات أثناء الفحص (يتم تقييم هذه البيانات كجزء من مراجعة طلب ترخيص المنتج (PLA)).

      عادة ، يتم إغلاق القوارير المراد تجميدها جزئيًا بواسطة الآلة. ومع ذلك ، فقد لوحظت بعض خطوط التعبئة التي تستخدم عاملًا لوضع كل سدادة أعلى القارورة يدويًا. القلق هو الوسيلة المباشرة للتلوث التي يقدمها المشغل. يجب إجراء مراقبة المشغلين والمراجعة النشطة لعمليات التعبئة.

      من الشواغل الرئيسية الأخرى المتعلقة بعملية الملء للمنتج المجفف بالتجميد ضمان أحجام التعبئة. من الواضح أن التعبئة المنخفضة ستمثل فراغًا في القارورة. على عكس الحشو المسحوق أو السائل ، لن تظهر التعبئة المنخفضة بسهولة بعد التجفيد ، خاصة بالنسبة لمنتج قد يكون المكون النشط فيه مليغرامًا فقط. بسبب الأهمية السريرية ، من المحتمل أن يكون السند في القارورة حالة خطيرة للغاية ، سريريًا.

      مرة أخرى ، يجب أن يشمل التفتيش المراقبة ومراجعة عمليات الملء ، ليس فقط فيما يتعلق بممارسات التعقيم ، ولكن أيضًا لتوحيد الملء.

      العديد من المنتجات مجففة بالتجميد لمخاوف الاستقرار. لسوء الحظ ، تخلفت جوانب GMP في تصميم المجففات عن تقنيات التعقيم والتحكم المستخدمة في معدات المعالجة الأخرى. ليس من المستغرب أنه تم تحديد العديد من المشكلات المتعلقة بعملية التجفيد.

      لا تقتصر هذه المشكلات على BDP ولكنها تتعلق عمومًا بتجفيف جميع المنتجات بما في ذلك BDP. يمكن العثور على مناقشة مفصلة للتجفيف بالضوابط والضوابط في دليل التفتيش الفني رقم 43 ، الصادر في 4/18/86.

      الضوابط المعملية

      أثناء التفتيش على معمل الشركة ، يجب مراجعة المجالات التالية وتوثيق أي أوجه قصور:

      يجب أن يكون موظفو المختبر مدربين تدريباً كافياً على الوظائف التي يؤدونها.

      يجب أن يكون لدى الشركات وثائق وجداول زمنية للصيانة والمعايرة والمراقبة لمعدات المختبرات المشاركة في قياس واختبار وتخزين المواد الخام والمنتج والعينات والكواشف المرجعية.

      يجب التحقق من صحة جميع طرق المختبر بالمعدات والكواشف المحددة في طرق الاختبار. سوف تتطلب التغييرات في البائع و / أو مواصفات المعدات / الكواشف الرئيسية إعادة التحقق.

      يجب أن يكون لدى الشركات بيانات أولية لدعم معايير التحقق في الطلبات المقدمة.

      يجب أن تكون المعايير المرجعية جيدة التوصيف والتوثيق ، وتخزينها ، وتأمينها ، واستخدامها بشكل صحيح أثناء الاختبار.

      قد تتحلل الثقافات والكواشف المختبرية ، مثل الإنزيمات والأجسام المضادة وكواشف الاختبار ، وما إلى ذلك ، إذا لم يتم الاحتفاظ بها في ظل ظروف تخزين مناسبة.

      يجب أن تكون الإجراءات مكتوبة وقابلة للتطبيق ومتابعة. يجب فصل عينات مراقبة الجودة وتخزينها بشكل صحيح.

      قد تكون الاختبارات التالية قابلة للتطبيق على المكونات ، في العملية ، السائبة و / أو اختبار المنتج النهائي. تعتمد الاختبارات المطلوبة على العملية والاستخدام المقصود للمنتج.

      تلوث البيروجين - يجب إجراء اختبار البيروجين عن طريق حقن الأرانب بالمنتج النهائي أو بمقايسة خلية الأميبوسيت ليمولوس (LAL). يجب استخدام نفس المعايير المستخدمة لقبول المنتج الطبيعي لمنتج التكنولوجيا الحيوية.

      قد يتداخل وجود السموم الداخلية في بعض منتجات التشخيص المختبري مع أداء الجهاز. أيضًا ، من الضروري اختبار المنتجات في الجسم الحي بحثًا عن البيروجينات. بعض المستحضرات الصيدلانية البيولوجية مُسببة للحمى في البشر على الرغم من اجتيازها اختبار LAL واختبار بيروجين الأرانب. قد تكون هذه الظاهرة بسبب المواد التي يبدو أنها مولدة للحرارة فقط في البشر. لمحاولة التنبؤ بما إذا كان البشر سيختبرون استجابة بيروجينية ، يتم استخدام اختبار بيروجين داخلي. تُزرع الخلايا أحادية النواة في الدم البشري في المختبر بالمنتج النهائي ، ويتم حقن سائل زراعة الخلايا في الأرانب. تشير الحمى في الأرانب إلى أن المنتج يحتوي على مادة قد تكون مولدة للحمى في البشر.

      الاختبارات التي يمكن مواجهتها:

      التلوث الفيروسي - يجب أن تكون اختبارات التلوث الفيروسي مناسبة لطبقة الخلية التحتية وظروف المزرعة المستخدمة. يجب إثبات عدم وجود فيروسات عرضية يمكن اكتشافها تلوث المنتج النهائي.

      الاختبارات التي يمكن مواجهتها:

      تلوث الحمض النووي - ينشأ القلق بشأن شوائب الحمض النووي من احتمال حدوث أحداث التحول الخلوي في المستلم. يمكن إثبات إزالة الحمض النووي في كل خطوة من خطوات عملية التنقية في تجارب تجريبية من خلال فحص مدى إزالة الحمض النووي للخلية المضيفة المضافة. مثل هذا التحليل من شأنه أن يوفر المدى النظري لإزالة الحمض النووي أثناء التنقية.

      يجب إجراء التحليلات المباشرة للحمض النووي في العديد من مجموعات الإنتاج للمنتج النهائي عن طريق تحليل التهجين للحمض النووي الملوث الثابت باستخدام المجسات المناسبة ، مثل الخلية المضيفة المترجمة بالنيكل والحمض النووي المتجه. سيتم التقليل من المخاوف النظرية المتعلقة بتحويل الحمض النووي المشتق من الركيزة الخلوية عن طريق التخفيض العام للحمض النووي الملوث.

      الاختبارات التي يمكن مواجهتها للبروتينات المرتبطة بالمنتج:

      الاختبارات التي يمكن مواجهتها للبروتينات الأجنبية:

      التلوث الميكروبي - يجب إجراء الاختبارات المناسبة للتلوث الميكروبي الذي يوضح عدم وجود البكتيريا التي يمكن اكتشافها (الهوائية واللاهوائية) والفطريات والخميرة والميكوبلازما ، عند الاقتضاء.

      الاختبارات التي يمكن مواجهتها:

      الملوثات الكيميائية - يجب مراعاة مصادر التلوث الأخرى ، على سبيل المثال ، المواد المسببة للحساسية ، والزيوت البترولية ، والمذيبات المتبقية ، ومواد التنظيف ، والمواد القابلة للتسرب في الأعمدة ، إلخ.

      1. جودة
        1. اللون / المظهر / الوضوح
        2. تحليل الجسيمات
        3. تحديد درجة الحموضة
        4. محتوى الرطوبة
        5. DNA الخلية المضيفة

        قد لا يكون اختبار واحد للهوية كافياً. هناك حاجة إلى تأكيد أنه تم التحقق من صحة الأساليب المستخدمة. يجب التحقق من توافر المواد المرجعية. ستوفر مقارنة المنتج بالمحضر المرجعي في اختبار حيوي مناسب أدلة إضافية تتعلق بهوية المنتج وفاعليته.

        الاختبارات التي يمكن مواجهتها:

        1. رسم خرائط الببتيد (مخفض / غير مخفض)
        2. هلام الكهربائي
          • صفحة SDS
          • التركيز الكهروضوئي (IEF)
          • الرحلان المناعي
        3. 2-الأبعاد الكهربائي
        4. الشعرية الكهربائي
        5. HPLC (الاحتفاظ بالكروموغرافيك)
          • المقايسة المناعية
          • إليسا
          • لطخة ويسترن
          • الراديو المناعي
        6. تحليل الأحماض الأمينية
        7. تسلسل الأحماض الأمينية
        8. مطيافية الكتلة
        9. الوزن الجزيئي (SDS PAGE)
        10. تحليل تكوين الكربوهيدرات (الارتباط بالجليكوزيل)

        الاختبارات التي يمكن مواجهتها:

        • كميات البروتين
        • لوري
        • طريقة بيوريت
        • قياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية
        • HPLC
        • تحليل الأحماض الأمينية
        • * تحليل التسلسل الجزئي

        يقصد بمصطلح "النقاء" التحرر النسبي من المواد الدخيلة في المنتج النهائي ، سواء كانت ضارة أو غير ضارة بالمتلقي أو ضارة بالمنتج. يشمل النقاء ، على سبيل المثال لا الحصر ، التحرر النسبي من الرطوبة المتبقية أو المواد المتطايرة الأخرى والمواد المسببة للحرارة. شوائب البروتين هي الملوثات الأكثر شيوعًا. قد تنشأ هذه من عملية التخمير أو الوسائط أو الكائن الحي المضيف. قد توجد الفيروسات القهقرية الذاتية في الأورام الهجينة المستخدمة لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. اختبار محدد لهذه المكونات أمر حتمي في المنتجات في الجسم الحي.تعد إزالة البروتينات المستضدية الدخيلة أمرًا ضروريًا لضمان سلامة وفعالية المنتج.

        الاختبارات التي يمكن مواجهتها:

        1. اختبارات شوائب البروتين:
          1. الكهربائي
            • صفحة SDS
            • IEF
            • 2-الأبعاد الكهربائي
          2. رسم خرائط الببتيد
          3. مولتيانتيجين إليسا
          4. HPLC استبعاد حجم HPLC عكس المرحلة HPLC
          1. تهجين الحمض النووي
          2. HPLC
          3. اختبار البيروجين / الذيفان الداخلي
            • يو اس بي. اختبار بيروجين الأرنب
            • Limulus Amebocyte Lysate (LAL) هـ
            • فحص البيروجين غير المنشأ
          • يو اس بي. اختبار بيروجين الأرنب
          • Limulus Amebocyte Lysate (LAL)
          • فحص البيروجين الداخلي
          • تأثير الاعتلال الخلوي في عدة أنواع من الخلايا
          • اختبار امتصاص الدم على البويضات الجنينية
          • تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
          • المستضد الفيروسي والمقايسة المناعية للأجسام المضادة
          • إنتاج الجسم المضاد للفأر (MAP)
          • تهجين الحمض النووي (لطخة نقطية)
          • تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
          • صفحة SDS
          • PLC
          • IEF
          • المقايسات المناعية
          • المقايسات المناعية الراديوية
          • إليسا
          • لطخة ويسترن
          • صفحة SDS
          • 2-الأبعاد الكهربائي
          • يو اس بي. اختبار العقم
          • عدد الصفائح غير المتجانسة وإجمالي الخمائر والقوالب
          • إجمالي عدد اللوحات
          • اختبار الميكوبلازما
          • LAL / بيروجين

          يتم تفسير "الفاعلية" على أنها تعني القدرة أو السعة المحددة للمنتج ، كما هو مبين في الاختبارات المعملية المناسبة أو من خلال البيانات السريرية الخاضعة للرقابة بشكل كاف والتي تم الحصول عليها من خلال إدارة المنتج بالطريقة المقصودة ، لتحقيق نتيجة معينة. يجب أن تتكون اختبارات الفاعلية إما من اختبارات في المختبر أو في الجسم الحي ، أو كليهما ، والتي تم تصميمها خصيصًا لكل منتج للإشارة إلى فعاليته. يجب إنشاء إعداد مرجعي للنشاط البيولوجي واستخدامه لتحديد النشاط الحيوي للمنتج النهائي. ملحوظة: عند الاقتضاء ، ينبغي مقارنة معايير الفاعلية البيولوجية الداخلية بالمراجع الدولية (منظمة الصحة العالمية (WHO) ، والمعهد الوطني للمعايير البيولوجية والتحكم (NIBSC)) أو الوطنية (المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، السرطان الوطني المعهد (NCI) ، إدارة الغذاء والدواء (FDA)) الاستعدادات المعيارية المرجعية ، أو معايير USP.

          الاختبارات التي يمكن مواجهتها:

          1. طريقة التحقق من الفاعلية
            • المقايسات الحيوية الحيوانية الكاملة
            • المقايسات الحيوية لخلية الثقافة
            • فحوصات الكيمياء الحيوية / البيوفيزيائية
            • المقايسات المناعية القائمة على المستقبلات
          2. حدود الفاعلية
          3. تحديد العوامل التي قد تؤثر سلبا على الفاعلية
          4. تقييم النشاط الوظيفي وخصوصية المستضد / الجسم المضاد
            • طرق الانتشار المناعي المختلفة (مفردة / مزدوجة)
            • المناعية / المقايسات المناعية المرتبطة بالراديو أو الإنزيم
          5. تم التحقق من صحة HPLC لربط قمم معينة بالنشاط البيولوجي

          "الاستقرار" هو قدرة المنتج على البقاء ضمن المواصفات الموضوعة لضمان هويته وقوته وجودته ونقاوته وسلامته وفعاليته كدالة زمنية. يجب إجراء دراسات لدعم فترة التأريخ المقترحة على المنتج النهائي. ستكون بيانات الاستقرار في الوقت الفعلي ضرورية لدعم فترة التأريخ المقترحة. قد يشمل الاختبار ثبات الفاعلية ، ودرجة الحموضة ، والوضوح ، واللون ، والجسيمات ، والاستقرار الكيميائي الفيزيائي ، والرطوبة ، والمواد الحافظة. يمكن استخدام بيانات اختبار الاستقرار المعجل كبيانات داعمة. الاختبارات المعجلة أو اختبارات الإجهاد هي دراسات مصممة لزيادة نسبة التحلل الكيميائي أو الفيزيائي لمادة أو منتج باستخدام ظروف تخزين مبالغ فيها. والغرض من ذلك هو تحديد المعلمات الحركية للتنبؤ بفترة التأريخ المؤقتة لانتهاء الصلاحية. كثيرًا ما يستخدم اختبار الإجهاد للمنتج لتحديد المشكلات المحتملة التي قد تتم مواجهتها أثناء التخزين والنقل ولتقديم تقدير لفترة تاريخ انتهاء الصلاحية. وينبغي أن يشمل ذلك دراسة لتأثيرات التقلبات في درجات الحرارة حسب الاقتضاء لظروف الشحن والتخزين. يجب أن تحدد هذه الاختبارات فترة تأريخ صالحة في ظل ظروف ميدانية واقعية مع الحاويات والإغلاق المخصص للمنتج المسوق.

          قد تتطلب بعض البروتينات الهشة نسبيًا المشتقة تقنيًا حيويًا خلطًا ومعالجة لطيفًا وترشيحًا واحدًا فقط عند ضغط منخفض. يجب أن تكون اتجاهات التصنيع محددة مع الحد الأقصى من ضغوط الترشيح المعطاة من أجل الحفاظ على الاستقرار في المنتج النهائي. يجب مراقبة محتوى المواد الحافظة للمنتجات التي تحتوي على مواد حافظة للتحكم في التلوث الجرثومي. يمكن تحقيق ذلك عن طريق إجراء اختبارات التحدي الميكروبي (مثل اختبار فعالية المواد الحافظة المضادة للميكروبات في جامعة جنوب المحيط الهادئ) أو عن طريق إجراء فحوصات كيميائية للمادة الحافظة. المجالات التي يجب معالجتها هي:

          • المراقبة الفعالة لبيئة اختبار الاستقرار (أي الضوء ودرجة الحرارة والرطوبة والرطوبة المتبقية)
          • نظام الحاوية / الإغلاق المستخدم لتخزين المواد السائبة (أي المواد المستخرجة ، والتعديل الكيميائي للبروتين ، والتغيير في تركيبات السدادة التي قد تغير المظهر الجانبي القابل للاستخراج)
          • تحديد المواد التي من شأنها أن تسبب عدم استقرار المنتج واختبار وجود التجميع ، والتمسخ ، والتجزئة ، ونزع الأمين ، والتحلل الضوئي ، والأكسدة
          • اختبارات لتحديد الركام أو منتجات التحلل.

          الاختبارات التي يمكن مواجهتها:

          1. صفحة SDS
          2. IEF
          3. HPLC
          4. كروماتوغرافيا التبادل الأيوني
          5. هجوم العمالقه
          6. رسم خرائط الببتيد
          7. طرق قياس الطيف الضوئي
          8. فحوصات الفاعلية
          9. اختبار أداء
          10. 2-الأبعاد الكهربائي

          يتمثل المعيار الأساسي لتحديد ما إذا كانت الشركة المصنعة تنتج منتجًا معياريًا وموثوقًا في إظهار تناسق دفعة إلى دفعة فيما يتعلق ببعض مواصفات الإصدار المحددة مسبقًا.

          • التوحيد: الهوية والنقاء والنشاط الوظيفي
          • الاستقرار: أداء مقبول خلال مدة الصلاحية ، الدقة ، الحساسية ، الخصوصية

          التغطية البيئية

          يجب إجراء التغطية البيئية / الاحتواء الحيوي لمرافق التكنولوجيا الحيوية كجزء من عمليات التفتيش المنتظمة لممارسات التصنيع الجيدة ، ولا سيما عمليات التفتيش المسبقة أو الترخيص المسبق. إدارة الغذاء والدواء (FDA) هي المسؤولة بموجب قانون السياسة البيئية الوطنية (NEPA) عن التحقق من الأثر البيئي الذي قد يحدث بسبب تصنيع واستخدام والتخلص من المنتجات التي تنظمها إدارة الغذاء والدواء. لا يمكن إبلاغ أي وكالة تنظيمية فيدرالية أو حكومية أخرى من قبل إدارة الغذاء والدواء بوجود تطبيق منتج غير معتمد. وبالتالي ، يجب أن تتأكد إدارة الغذاء والدواء من أن الجهة الراعية للمنتج تُجري التحقيقات بأمان.

            التقييمات البيئية

          عادة ، يصف راعي المنتج تدابير الرقابة البيئية في التقييمات البيئية (EAs) التي تشكل جزءًا من تطبيق المنتج. عند الموافقة على المنتج ، يتم طرح EA للجمهور. يجب أن تكون إدارة الغذاء والدواء قادرة على التحقق من دقة وملاءمة المعلومات الواردة في EA. يجب أن يكون لدى المحقق نسخة من التقييم البيئي للشركة ، يتناول تصنيع المنتج الذي يخضع لفحص GMP. يجب طلب EA من المكتب الأصلي إذا لم يتم توفيره.

          1. راجع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لأبحاث الحمض النووي المؤتلف (1987 ، 1988 ، 1991). إيلاء اهتمام خاص للملحق ك (1991) ، فيما يتعلق بوضع مبادئ توجيهية لمستوى الاحتواء المناسب للممارسات الصناعية الجيدة على نطاق واسع (انظر المراجع).
          2. تحديد أن المعدات والضوابط الموضحة في EA كجزء من أنظمة الاحتواء الحيوي ومعالجة النفايات قد تم التحقق من صحتها للعمل وفقًا للمعايير الموجودة بالمعدات وتشغيلها وصيانتها بشكل صحيح. قد تشتمل هذه المعدات ، على سبيل المثال ، على مرشحات HEPA ، وخزانات تجميع الانسكابات مع المعالجة بالحرارة أو الهيبوكلوريت ، والالتفاف حول المفاعلات الحيوية والمصارف المرتبطة بها. يجب استخدام إجراءات التشغيل الموحدة لتنظيف الانسكابات ، وللإجراءات التي يجب اتخاذها في حالة التعرض العرضي للأفراد ، ولفتح وإغلاق السفن ، وأخذ العينات ومناولة العينات ، وللإجراءات الأخرى التي تنطوي على خرق الاحتواء أو عند التعرض قد تحدث الخلايا الحية.
          3. تحديد ما إذا كان هناك مكان عمل و / أو برنامج مراقبة بيئي مصمم للتحقق من أن الكائنات الحية تخضع لممارسات الاحتواء الحيوي المناسبة. مراجعة إجراءات التشغيل الموحدة لأخذ العينات ، والعزل ، والعد ، والإبلاغ عن النتائج. الحصول على نسخ من إجراءات التشغيل الموحدة ذات الصلة وبيانات المراقبة لإدراجها في التقارير المقدمة إلى المقر الرئيسي.
          4. اطلب واحصل على نسخ من جميع التصاريح الفيدرالية والولائية والمحلية التي تحكم الانبعاثات والسلامة المهنية للمنشأة التي يتم فحصها. تحديد ما إذا كان أي من التصاريح قد انتهت صلاحيتها وما إذا كان هناك أي إجراء معلق يتعلق بانتهاكات التصاريح.
          5. بالنسبة للمنشآت في الدول الأجنبية ، يجب اتباع نفس الإجراءات. يجب إثبات الامتثال لمتطلبات الدولة الأجنبية.

          زائدة:

          طرق الاختبار

          كروماتوغرافيا التقارب - طريقة فصل كروماتوجرافي تعتمد على تفاعل كيميائي خاص بالأنواع المستهدفة. أنواع طرق التقارب هي: الامتصاص الحيوي - التعرف على الموقع (على سبيل المثال ، الجسم المضاد أحادي النسيلة ، البروتين أ) التفاعل الكارثي للماء - الاتصالات بين المناطق غير القطبية في المحاليل المائية ، ارتباط محدد للصبغة والجزيئات الكبيرة بالتريازين وصبغات تراي فينيل ميثان المخلبة المعدنية - معقدات مخلبة مرتبطة بالمصفوفة مع الجزيء المستهدف عن طريق تبادل الروابط المعدنية ذات الوزن الحبيبي المنخفض والرابط التساهمي ثنائي الكبريتيد القابل للانعكاس في ظل ظروف معتدلة.

          تحليل تكوين الأحماض الأمينية - يستخدم لتحديد تكوين الأحماض الأمينية و / أو كمية البروتين. عملية من خطوتين تتضمن تحللًا مائيًا كاملًا (كيميائيًا أو إنزيميًا) للبروتين في الأحماض الأمينية المكونة له متبوعًا بالفصل الكروماتوجرافي والكميات عبر HPLC. يجب أن تشتمل تركيبة الأحماض الأمينية الكاملة للببتيد أو البروتين على قيم دقيقة للميثيونين والسيستين والتربتوفان. يجب أن تكون تركيبة الأحماض الأمينية المقدمة متوسط ​​ثلاثة (3) على الأقل من التحلل المائي المنفصل لكل رقم دفعة. يمكن الحصول على قيم متكاملة لبقايا الأحماض الأمينية الموجودة عمومًا بكميات منخفضة ، مثل التربتوفان و / أو الميثيونين ، واستخدامها لدعم حجج النقاء.

          تسلسل الأحماض الأمينية - تسلسل جزئي (8-15 بقايا) للأحماض الأمينية داخل بروتين أو عديد ببتيد إما عن طريق تسلسل طرفي أميني أو كربوكسي طرفي. يتم إجراء هذه الطريقة للحصول على معلومات حول التركيب الأساسي للبروتين ، وتجانسه ، ووجود أو عدم وجود انقسامات متعددة الببتيد. يتم تقديم بيانات التسلسل التي يحددها تحليل HPLC في شكل جدول ويجب أن تتضمن إجمالي العائد لكل حمض أميني في كل دورة انقسام متسلسلة. غالبًا ما يتم إجراء التسلسل الكامل عن طريق تسلسل شظايا الببتيد المعزولة من تجزئة HPLC.

          الرحلان الكهربائي الشعري - يستخدم كمكمل لـ HPLC ، خاصة لرسم خرائط الببتيد. هذه التقنية أسرع وستفصل غالبًا الببتيدات التي تلتف باستخدام HPLC. يتم الفصل عن طريق التنقل النسبي للببتيدات في المخزن المؤقت استجابة للتيار الكهربائي.

          تحليل الكربوهيدرات - يستخدم لتحديد اتساق تكوين السكريات الأحادية المرتبطة تساهميًا في البروتينات السكرية. على عكس سلسلة البولي ببتيد للبروتين السكري حيث يتم التحكم في الإنتاج من خلال الشفرة الوراثية ، يتم تصنيع السكريات قليلة التعدد بواسطة إنزيمات ما بعد الترجمة. التجانس الجزئي لسلاسل الكربوهيدرات أمر شائع. يمكن أن يتم التحديد على السكريات غير المشبعة بعد التحلل المائي عن طريق فصل HPLC مع الكشف عن قياس التيار النبضي أو عن طريق كروماتوجرافيا الغاز بعد الاشتقاق.

          ازدواج اللون الدائري - مع التشتت الدوار البصري ، إحدى الطرق الطيفية الضوئية المستخدمة لتحديد البنية الثانوية ولحساب أشكال البنية المحددة (الحلزون ، الورقة المطوية B ، والملف العشوائي) داخل البروتين. تتم مقارنة الأطياف الناتجة مع تلك الموجودة في شكل البروتين الطبيعي أو بالمعيار المرجعي للمادة المؤتلفة.

          تحليل تهجين الحمض النووي (Dot Blot) - الكشف عن الحمض النووي إلى مستوى النانوجرام باستخدام تهجين الحمض النووي الخلوي مع تحقيقات DNA محددة. يمكن أن يكون المظهر من خلال 32P- وضع العلامات ، أو التلألؤ الكيميائي ، أو فحوصات الكروموجينيك أو فحوصات البيوتين.

          Edman Degradation - نوع من تسلسل البروتين من الطرف الأميني.

          الرحلان الكهربائي - طرق يتم فيها فصل الجزيئات أو المجمعات الجزيئية على أساس قدرتها النسبية على الهجرة عند وضعها في مجال كهربائي. يتم وضع المادة التحليلية على دعامة كهربي ، ثم يتم فصلها بشحنة (تركيز كهربي متساوي) أو بالوزن الجزيئي (SDS-PAGE). يتم تحقيق التخيل عن طريق تلطيخ البروتين بتقنيات غير انتقائية (Coomassie Blue) أو تقنيات صبغ انتقائية (فضية).

          طريقة ربط الصبغة باستخدام Coomassie blue هي تقنية قابلة للقياس الكمي عند استخدام مقياس كثافة الليزر لقراءة المواد الهلامية. تعتبر طريقة صبغ الفضة أكثر حساسية ، وبالتالي فهي تستخدم للكشف عن المستويات المنخفضة من شوائب البروتين ، ولكن نظرًا لتنوع التلوين من البروتين إلى البروتين ، لا يمكن استخدامها في التحديد الكمي.

          رحلان جل ثنائي الأبعاد - نوع من الرحلان الكهربائي يتم فيه فصل البروتينات أولاً في اتجاه واحد بواسطة شحنة متبوعة بفصل حجم في الاتجاه العمودي.

          الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) - اختبار متعدد المستضدات للبروتين الخلوي المتبقي (المضيف) غير المعروف وتأكيد البروتين المطلوب. يمكن استخدامه لتحديد فاعلية المنتج. إنها محددة وحساسة للغاية ، وبسيطة بشكل أساسي ، وغير مكلفة. يتطلب إعدادًا معياريًا مرجعيًا لشوائب بروتين الخلية المضيفة لتكون بمثابة مناعة لإعداد الأجسام المضادة متعددة النسيلة المستخدمة في الفحص.

          فحص البيروجين الداخلي - اختبار في المختبر يعتمد على إطلاق البيروجين الداخلي الناتج عن الذيفان الداخلي من الخلايا الوحيدة البشرية. يبدو أن هذا الاختبار أكثر حساسية من اختبار Pyrogen للأرنب USP ، ولكنه أقل حساسية بكثير من اختبار LAL. إنه يتمتع بميزة أنه يمكنه اكتشاف جميع المواد التي تسبب استجابة بيروجينية من الخلايا الوحيدة البشرية.

          نفاذ الهلام أو الترشيح (استبعاد الحجم) اللوني (GPC أو GFC أو SEC) - طريقة فصل تعتمد على الحجم الجزيئي أو الحجم الهيدروديناميكي للمكونات التي يتم فصلها. يمكن تحقيق ذلك باستخدام البروتينات في حالتها الطبيعية أو تغيير طبيعتها بالمنظفات.

          كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) - تقنية فصل آلية تستخدم لتوصيف أو لتحديد نقاء BDP عن طريق تمرير المنتج (أو الببتيدات المكونة أو الأحماض الأمينية) في شكل سائل فوق عمود كروماتوغرافي يحتوي على مصفوفة دعم صلبة. يتم تحديد طريقة الفصل ، أي المرحلة المعكوسة ، أو التبادل الأيوني ، أو الترشيح الهلامي ، أو التفاعل الكارثي للماء ، بواسطة مصفوفة العمود والمرحلة المتنقلة. يتم الكشف عادة عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية أو بالوسائل الكهروكيميائية.

          كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء (HIC) - يتم إنجاز HIC في وسط عالي الملح عن طريق ربط الأجزاء الكارهة للماء من البروتين بسطح كاره للماء قليلاً يحتوي على كيانات مثل فينيل ، أو هيدروكربونات قصيرة السلسلة. يمكن استخلاص البروتين بتدرج ملح متناقص ، مع التخلص من البروتينات الأكثر كارهة للماء من العمود الأخير.

          المقايسة المناعية - أسلوب فحص نوعي أو كمي يعتمد على قياس تفاعل الجسم المضاد عالي التقارب مع المستضد المستخدم لتحديد البروتينات وقياسها.

          التجلط المناعي - تقنية لنقل الجسم المضاد / المستضد من مادة هلامية إلى مرشح نيتروسليلوز حيث يمكن أن تتراكم مع المستضد / الجسم المضاد التكميلي.

          الانتشار المناعي (منفرد) - تقنية انتشار الهوية حيث يتم وضع المنتج (المستضد) في بئر مقطوع إلى وسط مثل الأجار الذي يحتوي على الجسم المضاد التكميلي. ينتشر المنتج في الوسط مكونًا راسبًا على شكل حلقة تكون كثافته دالة لتركيز المستضد.

          الانتشار المناعي (تقنية Ouchterlony المزدوجة) - تقنية يتم فيها وضع مستضد وجسم مضاد في بئرين متجاورين مقطعين إلى وسط مثل أجار. أثناء انتشارها عبر الوسط ، فإنها تشكل خطوط ترسيب مرئية لمجمعات مستضد / جسم مضاد عند النقطة التي تكون فيها التركيزات المعنية عند النسبة المثلى لتكوين اللاتيس.

          كروماتوغرافيا التبادل الأيوني (IEC) - فصل مدفوع بالتدرج يعتمد على شحنة البروتين وتقاربه النسبي للعمود الفقري الكيميائي للعمود. يشيع استخدام تبادل الأنيون / الكاتيون للبروتينات.

          التركيز الكهروضوئي (IEF) - طريقة كهربية تفصل البروتينات بواسطة pI. إنها تتحرك من خلال وسط تدرج الأس الهيدروجيني في مجال كهربائي حتى يتم تحديد موقعها عند نقطة تساوي الكهرباء حيث لا تحمل أي شحنة صافية. قبل الوصول إلى pI ، تعتمد حركة البروتين أيضًا على الحجم والتشكيل وانحدار تدرج الأس الهيدروجيني وتدرج الجهد. تستخدم هذه الطريقة لاكتشاف الأشكال غير الصحيحة أو المعدلة من البروتين وكذلك شوائب البروتين.

          اختبار Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) - اختبار حساس لوجود السموم الداخلية باستخدام قدرة الذيفان الداخلي على إحداث تفاعل تخثر في دم سلطعون حدوة الحصان. يعد اختبار LAL أسهل وأسرع وأقل تكلفة وأكثر حساسية بكثير من اختبار الأرنب ، ولكن يمكنه اكتشاف السموم الداخلية فقط وليس جميع أنواع البيروجينات ، وبالتالي يجب التحقق من صحته تمامًا قبل استخدامه لاستبدال اختبار USP Rabbit Pyrogen. تتضمن الأشكال المختلفة لاختبار LAL اختبار الجلطة الهلامية ، واختبار قياس القولون ، واختبار الكروموجينيك ، واختبار قياس العكر.

          قياس الطيف الكتلي - تقنية مفيدة في تحليل البنية الأولية عن طريق تحديد الكتلة الجزيئية للببتيدات والبروتينات الصغيرة. غالبًا ما تستخدم مع رسم خرائط الببتيد لتحديد المتغيرات في تكوين الببتيد. مفيد لتحديد روابط ثاني كبريتيد وتحديد التعديلات اللاحقة للترجمة.

          اللطخة الشمالية - تقنية لنقل شظايا الحمض النووي الريبي من هلام الاغاروز إلى مرشح النيتروسليلوز حيث يمكن تهجينهم إلى الحمض النووي التكميلي.

          رسم خرائط الببتيد - تقنية قوية تتضمن تكسير البروتينات إلى ببتيدات باستخدام إنزيمات محددة للغاية. تشق الإنزيمات البروتينات في مواقع الأحماض الأمينية التي يمكن التنبؤ بها والقابلة للتكرار ويتم فصل الببتيدات الناتجة عن طريق HPLC أو الرحلان الكهربائي. تتم مقارنة عينة خريطة الببتيد بخريطة تم إجراؤها على عينة مرجعية كخطوة تأكيدية في تحديد هوية المنتج. كما أنها تستخدم لتأكيد روابط ثاني كبريتيد ، وموقع ارتباط الكربوهيدرات ، وتحليل التسلسل ، ولتحديد الشوائب وتدهور البروتين.

          تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) - تقنية في المختبر لتضخيم الحمض النووي. تتضمن هذه التقنية سلسلة من الدورات المتكررة للتمسخ في درجات الحرارة المرتفعة ، والتلدين التمهيدي قليل النوكليوتيد بدرجة حرارة منخفضة وتمديد سلسلة درجة الحرارة المتوسطة. يمكن تضخيم الحمض النووي مليون مرة بعد 25-30 دورة.

          القياس الكمي للبروتين - يمكن تحديد الكمية الإجمالية للبروتين عن طريق عدد من المقايسات. لا توجد طريقة واحدة أفضل من البقية ولكل منها عيوبه الخاصة التي تتراوح من كمية البروتين المطلوبة لإجراء الاختبار إلى مشكلة التباين بين البروتينات. بعض الأنواع تشمل Lowry ، Bicinchonic Acid (BCA) ، Bradford ، Biuret ، Kjeldahl ، التحليل الطيفي فوق البنفسجي.

          تسلسل البروتين - (انظر تسلسل الأحماض الأمينية).

          اختبار بيروجين الأرنب. يو اس بي. - اختبار لوجود البيروجينات (لا يقتصر على السموم الداخلية كما هو الحال في اختبار LAL) يتضمن حقن مادة الاختبار في الأرانب التي يتم التحكم فيها جيدًا وذات التاريخ المعروف.يتم بعد ذلك مراقبة الأرانب لارتفاع درجة الحرارة على مدى ثلاث ساعات.

          المقايسة المناعية المشعة (RIA) - مصطلح عام للمقايسات المناعية التي لها ملصق (علامة) مشعة على المستضد أو الجسم المضاد. تشمل الملصقات الشائعة I125 و H3 والتي تستخدم للكشف عن المقايسة وتحديد الكميات. تعتبر RIA الكلاسيكية عبارة عن فحوصات ربط تنافسية حيث يتنافس مولد الضد والمستضد الموسوم للحصول على عدد ثابت محدود من مواقع الربط على الجسم المضاد. يتناسب المركب الموسوم المرتبط بالجسم المضاد عكسياً مع تركيز المستضد.

          كروماتوغرافيا الطور العكسي - طريقة فصل كروماتوغرافي تعتمد على طور ثابت للعمود مغطى لإعطاء سطح غير قطبي كاره للماء. يتناسب الاحتفاظ بالمحلل مع التفاعلات الكارهة للماء بين المذاب والسطح. الاحتفاظ يتناسب تقريبًا مع طول سلسلة الكربون المستعبدين.

          SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) - فصل كهربي للبروتينات على أساس أوزانها الجزيئية. يتم فرض شحنة سالبة صافية موحدة على الجزيئات عن طريق إضافة SDS. في ظل هذه الظروف ، تسمح الهجرة نحو القطب الموجب من خلال مصفوفة هلامية بالفصل عن طريق الحجم وليس الشحن ، مع انتقال الجزيئات الأصغر لأطول مسافة. لا يمكن الاعتماد على هذه التقنية للأحجام التي تقل عن ميغاواط من كاليفورنيا. 8000.

          يتم ملاحظة البروتينات عبر تلطيخ Coomassie باللون الأزرق أو الفضي أو يمكن نقلها إلى أغشية لاختبار خصوصية المستضد / الجسم المضاد.

          البقعة الجنوبية - تقنية لنقل شظايا الحمض النووي من هلام الاغاروز إلى مرشح النيتروسليلوز حيث يمكن تهجينها إلى DNA تكميلي.

          التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية - تقنية تقدير كمي للبروتينات باستخدام أطياف الامتصاص المميزة بسبب وجود حوامل صبغية جانبية السلسلة (فينيل ألانين ، تريبتوفان ، وتيروزين). نظرًا لأن هذا الامتصاص خطي ، يمكن تحديد كمية البروتينات عالية النقاء عن طريق الحسابات باستخدام معامل الانقراض المولي.

          لطخة ويسترن - يستخدم هذا الاختبار لاكتشاف ركائز الخلايا الملوثة وتقييم عديد الببتيدات المؤتلفة. بعد الفصل الكهربي ، يتم نقل البروتينات سالبة الشحنة (المستضدات) كهربائيًا من هلام بولي أكريلاميد إلى غشاء نيتروسليلوز موضوع على جانب الأنود للجيل. بعد احتضان الغشاء بجسم مضاد محدد ، يتم تمييزها بجسم مضاد آخر للكشف عنها.

          الكائنات الحية المفيدة - البكتيريا أو الخميرة أو العفن أو الميكوبلازما أو الفيروسات التي يمكن أن تلوث خلايا بدائيات النوى أو حقيقيات النوى المستخدمة في الإنتاج. تشمل المصادر المحتملة للكائنات العرضية المصل المستخدم في وسط زراعة الخلايا ، أو الخلايا المصابة بشكل دائم أو كامن ، أو البيئة.

          الملاءمة - الكمية الديناميكية الحرارية التي تحدد تفاعل الطاقة أو ارتباط جزيئين ، عادةً ما يكون الجسم المضاد مع محدد مولد الضد المقابل له.

          مضاد (IMMUNOGLOBULIN) - جزيء بروتين له بنية مميزة تتكون من نوعين من سلاسل الببتيد: ثقيل (H) وخفيف (L). تحتوي الأجسام المضادة على مناطق (مواقع ربط) تتلاءم بشكل خاص مع الموقع المحدد المقابل لها على مولد الضد ويمكن أن ترتبط به ، مما أدى إلى إنتاج هذا الجسم المضاد بواسطة الخلايا الليمفاوية البائية وخلايا البلازما في الأنواع الحية.

          أنتيجن - مادة ، عادة ما تكون بروتينًا أو كربوهيدرات غريبًا ، والتي عند إدخالها في الكائن الحي ، تنشط مستقبلات محددة على الخلايا الليمفاوية T و B ذات الكفاءة المناعية السطحية. بعد التفاعل بين المستضد والمستقبلات ، عادة ما يكون هناك تحريض لاستجابة مناعية ، أي إنتاج أجسام مضادة قادرة على التفاعل بشكل خاص مع المواقع المحددة على المستضد.

          المحدد المسبب للمضادات - الجزء المحدد من بنية المستضد الذي سيحفز استجابة مناعية ، أي سيكون مناسبًا للمستقبلات على الخلايا اللمفاوية التائية والبائية وسيكون أيضًا قادرًا على التفاعل مع الأجسام المضادة المنتجة.

          ANTISERUM - مصل الدم الذي يحتوي على أجسام مضادة ضد مستضد معين (أو مناعة). هذا يعني في كثير من الأحيان مصل من حيوان تم تطعيمه بالمستضد.

          ASCITES - تراكمات سائلة في التجويف البريتوني. يمكن تنقية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من استسقاء الفئران التي تحمل الورم الهجين المزروع.

          ثابت الارتباط - تفاعل بين الجسم المضاد ومحدده الذي يشتمل على مقياس تقارب. يتم قياس مقدار الثابت بواسطة ثوابت معدل قانون العمل الجماعي من أجل الارتباط والتفكك. التصوير الذاتي - الكشف عن الجزيئات ذات العلامات الإشعاعية على فيلم الأشعة السينية.

          AVIDITY - قوة الارتباط الكلية بين جميع مواقع الارتباط المتاحة لجزيء الجسم المضاد والمحددات المقابلة الموجودة على مولد الضد.

          BACTERIOPHAGE - فيروس يهاجم البكتيريا. كثيرا ما تستخدم بكتيريا لامدا كناقل في تجارب الجينات المؤتلفة.

          موقع الربط - جزء جزيء الجسم المضاد الذي سيربط المستضد على وجه التحديد.

          النشاط الحيوي - مستوى النشاط أو الفاعلية المحددة على النحو الذي يحدده النموذج الحيواني ، أو ثقافة الخلية ، أو المقايسة البيوكيميائية في المختبر.

          الاحتواء البيولوجي - الخصائص المميزة للكائن الحي التي تحد من بقائه و / أو تكاثره في البيئة.

          معدّل الاستجابة البيولوجية - مصطلح عام للهرمونات والمركبات النشطة عصبيًا والمركبات المناعية التي تعمل على المستوى الخلوي ، العديد من المرشحين المحتملين لإنتاج التكنولوجيا الحيوية.

          عامل بيولوجي - وعاء تحدث فيه التفاعلات المركزية لعملية التكنولوجيا الحيوية. عادةً ما يحتوي الوعاء على ميكروبات نمت تحت ظروف خاضعة للتحكم في درجة الحرارة والتهوية والخلط والحموضة والعقم.

          أجهزة الاستشعار الحيوية - تقترن أنظمة التعرف القوية على المواد الكيميائية البيولوجية (الإنزيمات والأجسام المضادة والحمض النووي) بالإلكترونيات الدقيقة لتمكين الكشف السريع والدقيق على المستوى المنخفض لمواد مثل السكريات والبروتينات (مثل الهرمونات) في سوائل الجسم والملوثات في الماء والغازات في الهواء.

          CALIBRATOR - مصطلح في الكيمياء السريرية يشير بشكل شائع إلى المعيار المستخدم "لمعايرة" أداة أو يستخدم في بناء منحنى قياسي (معاير).

          CELL CULTURE - النمو في المختبر للخلايا المعزولة من الكائنات متعددة الخلايا. عادة ما تكون هذه الخلايا من نوع واحد.

          التمايز الخلوي - العملية التي بموجبها يحقق المتحدرين من خلية أبوية مشتركة تخصصًا في البنية والوظيفة ويحافظون عليه.

          اندماج الخلايا - تكوين خلية هجينة مع نوى وسيتوبلازم من خلايا مختلفة ، يتم إنتاجها عن طريق دمج خليتين من نفس النوع أو نوع مختلف.

          CELL LINE - الخلايا التي تكتسب القدرة على التكاثر في المختبر إلى أجل غير مسمى.

          CHEMOTAXIS - حركة موجهة صافية في تدرج تركيز لمركبات معينة. يمكن أن تعمل السكريات والأحماض الأمينية المختلفة كجاذبات بينما تعمل بعض المواد مثل الأحماض أو القلويات كمواد طاردة في الانجذاب الكيميائي الميكروبي. تُظهر خلايا الدم البيضاء والضامة حركة كيميائية في وجود المنتجات البكتيرية والبروتينات المكملة والخلايا التائية المنشطة بالمستضد للمساهمة في التفاعل الالتهابي المحلي ومقاومة مسببات الأمراض.

          CISTRON - أصغر وحدة من المادة الوراثية المسؤولة عن تخليق بولي ببتيد معين.

          CLONE - خط خلوي ينشأ من خلية سلف واحدة ويعبر عادة عن نفس الجينات. إذا كان هذا استنساخًا للخلايا اللمفاوية البائية ، فسينتج عادةً أجسامًا مضادة متطابقة ، أي أجسام مضادة وحيدة النسيلة.

          CODON - مجموعة من ثلاث قواعد نيوكليوتيد في DNA أو RNA تحدد تكوين حمض أميني واحد في "بناء" البروتين ويمكن أيضًا ترميز إنهاء السلسلة.

          نهايات التماسك - جزيء DNA ذو نهايات مفردة الجديلة مع قواعد مكشوفة (متماسكة) مكملة.

          الحمض النووي التكميلي (cDNA) - الحمض النووي المكمل للرسول RNA المستخدم في الاستنساخ أو كمسبار في دراسات تهجين الحمض النووي.

          COSMID - ناقل مشابه للبلازميد ولكنه يحتوي أيضًا على المواقع المتماسكة (موقع كوس) من عاثيات لامدا للسماح بإدخال أجزاء كبيرة من الحمض النووي والتعبئة في المختبر في العاثية.

          رد الفعل المتقاطع - يمكن أن تتفاعل الأجسام المضادة ضد المستضد A مع المستضدات الأخرى إذا كان لدى الأخير محدد واحد أو أكثر مشترك مع المحددات الموجودة على المستضد A أو تحمل واحدًا أو أكثر من المحددات المتشابهة جدًا من الناحية الهيكلية مع المحددات الموجودة في المستضد A.

          سيتوكين CYTOKINE - بروتينات صغيرة غير غلوبولين مناعية تنتجها الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية التي تعمل كمواصلين بين الخلايا بعد الارتباط بمستقبلات محددة على الخلايا المستجيبة. تنظم السيتوكينات مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية.

          التأثير السيتوباثي - التغيرات المورفولوجية لخطوط الخلايا التي تنتج عندما تصاب الخلايا بفيروس. تتضمن أمثلة تأثيرات الاعتلال الخلوي تقريب الخلايا وتكتلها ، أو اندماج أغشية الخلايا ، أو تضخم أو استطالة الخلايا ، أو تحلل الخلايا.

          السمية السامة - إتلاف الخلايا.

          التكاثر - تتكشف جزيء البروتين في شكل غير نشط بيولوجيًا بشكل عام. أيضا تمزق الحمض النووي المزدوج إلى شقين منفصلين.

          DNA (DEOXYRIBONUCLEIC ACID) - المكون الكيميائي الحيوي الأساسي للكروموسومات ودعم الوراثة. يحتوي الحمض النووي على سكر الديوكسيريبوز وهو الحمض النووي الذي يتم فيه تخزين المعلومات الجينية (بصرف النظر عن بعض الفيروسات).

          استنساخ الحمض النووي - إنتاج العديد من النسخ المتطابقة من جزء محدد من الحمض النووي.

          مكتبة الحمض النووي - مجموعة من شظايا الحمض النووي المستنسخة والتي تمثل معًا الجينوم بأكمله أو نسخ نسيج معين.

          DNA POLYMERASE - إنزيم يحفز تخليق DNA مزدوج الشريطة من DNA أحادي الجديلة.

          توليف الحمض النووي - تكوين الحمض النووي عن طريق الإضافة المتسلسلة لقواعد النوكليوتيدات.

          DNase - إنزيم ينتج شقوقًا مفردة الجديلة في الحمض النووي. يستخدم DNase في ترجمة نيك.

          ELUTION - إزالة المواد الممتصة من مادة ماصة مثل إزالة منتج من إنزيم مرتبط بعمود.

          الغدد الصماء - الإنزيمات التي تشق الروابط داخل جزيئات الحمض النووي.

          ENDOTOXIN - عديدات السكاريد الدهنية المستقرة للحرارة المرتبطة بالغشاء الخارجي لبعض البكتيريا سالبة الجرام. لا يتم إفرازه ولا يتم إطلاقه إلا عندما تتعطل الخلايا. عند حقنها في البشر ، تنتج السموم الداخلية استجابة حموية ، مما يؤدي إلى مشاكل سريرية خطيرة ، بما في ذلك الوفاة. يتم تعريف وحدة الذيفان الداخلي (EU) بالمقارنة مع الدفعة المعيارية المرجعية الحالية لجامعة جنوب المحيط الهادئ EC- 5. قارورة واحدة من الدفعة EC- 5 تحتوي على 10000 EU. تم العثور على الاختبار الرسمي للذيفان الداخلي في USP.

          إنزيمات - بروتينات تعمل كمحفز في التفاعلات الكيميائية الحيوية.

          الخلايا الخارجية - الإنزيمات التي تحفز إزالة النيوكليوتيدات من نهايات جزيء الحمض النووي.

          التخمر - عملية حيوية لاهوائية. يستخدم التخمير في عمليات صناعية مختلفة لتصنيع منتجات مثل الكحول والأحماض والجبن بفعل الخمائر والعفن والبكتيريا. تُستخدم عملية التخمير أيضًا في إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

          اندماج البروتوبلاستس - اندماج خليتين تمت إزالة جدرانهما ، مما يجعل من الممكن إعادة توزيع التراث الجيني للكائنات الحية الدقيقة.

          الجين - الوحدة الأساسية للوراثة ، والتي تلعب دورًا في التعبير عن خاصية معينة. التعبير عن الجين هو الآلية التي يتم من خلالها نسخ المعلومات الجينية التي يحتويها وترجمتها للحصول على بروتين. الجين هو جزء من جزيء الحمض النووي الذي يوجه تركيب سلسلة بولي ببتيد معينة. وهي تتألف من العديد من الكودونات. عندما يتم اعتبار الجين كوحدة وظيفية بهذه الطريقة ، غالبًا ما يستخدم مصطلح cistron.

          نقل الجينات - استخدام التلاعب الجيني أو الفيزيائي لإدخال جينات غريبة في الخلايا المضيفة لتحقيق الخصائص المرغوبة في النسل.

          الهندسة الوراثية - تقنية تستخدم لتعديل المعلومات الجينية في خلية حية ، وإعادة برمجتها للغرض المطلوب (مثل إنتاج مادة لا تنتجها بشكل طبيعي).

          GENOME - جميع الجينات التي تحملها الخلية.

          GLYCOPROTEIN - البروتين الذي ترتبط به مجموعات السكريات. تعتبر بروتينات فصيلة الدم البشرية وبروتينات جدار الخلية وبعض الهرمونات أمثلة على البروتينات السكرية.

          الجليكوزيل - الارتباط التساهمي للسكريات بحمض أميني في جزء البروتين من بروتين سكري.

          حدث - مادة منخفضة الوزن الجزيئي يمكن أن تتفاعل وحدها مع الجسم المضاد المقابل لها. من أجل أن تكون مناعية ، يتم ربط الهابتن بجزيئات لها أوزان جزيئية أكبر من 5000. مثال على ذلك هو الديجوكسين الهابتن المرتبط تساهميًا بألبومين المصل البقري ، مكونًا مناعة الديجوكسين- BSA.

          الأجسام المضادة عالية التوافق - الأجسام المضادة ذات الألفة العالية للمستضد. هذه الأجسام المضادة هي في الغالب IgG ، ويتم إنتاجها أثناء استجابة ثانوية للمستضد. يمكن تحفيز الخلايا التي تنتج جسمًا مضادًا عالي التقارب عن طريق التركيز المنخفض للمستضد.

          تحليل كروماتوغرافي سائل عالي الأداء (HPLC أو LC) - (انظر طرق الاختبار)

          HOST - خلية يستخدم استقلابها في نمو وتكاثر فيروس أو بلازميد أو أي شكل آخر من أشكال الحمض النووي الغريب.

          تقنية الهيبريدوما - الاندماج بين خلية تشكيل الجسم المضاد (الخلايا الليمفاوية) وخلية الورم النخاعي الخبيث ("الخالدة") ، مما ينتج عنه استنساخ خلية ينمو باستمرار (الورم الهجين) ، والذي يمكن أن ينتج أجسامًا مضادة ذات خصوصية واحدة.

          خصائص المقايسة المناعية - خاصية أداء يتم تحديدها من خلال إجراء دراسات تفاعلية متصالبة مع مواد متشابهة هيكليًا قد تكون موجودة في مصفوفة التحليل. يتم تحديد دراسات النوعية مع كل دفعة جديدة من الأجسام المضادة متعددة النسيلة المستخدمة في المقايسة المناعية. بالنسبة للأجسام المضادة أحادية النسيلة ، فإن كل دفعة جديدة لاحقة تتميز عادةً بالتقنيات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية بدلاً من دراسات النوعية الشاملة.

          الكتل المناعي (IEP) - (انظر طرق الاختبار - الانتشار المناعي (مزدوج ، تقنيات Ouchterlony))

          IMMUNOTOXIN - الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مقترنة بالسموم القادرة على توصيل جزء السم إلى الخلية المستهدفة.

          التهجين في الموقع - التهجين باستخدام مسبار مناسب يتم إجراؤه مباشرة على إعداد الكروموسوم أو القسم النسيجي.

          في فيترو - التفاعلات البيولوجية التي تحدث خارج الجسم في نظام اصطناعي.

          IN VIVO - تفاعل بيولوجي يحدث داخل خلية أو كائن حي.

          محفز - تغيير كيميائي أو شرطي ينشط التعبير المؤدي إلى إنتاج المنتج المطلوب. جزيء صغير يتفاعل مع بروتين منظم ويطلق نسخ الجينات.

          LIGASE - إنزيم يستخدم للانضمام إلى جزيئات الحمض النووي.

          LOCUS - موقع الجين على الكروموسوم.

          LYMPHOKINES - المواد التي يتم إطلاقها في الغالب من الخلايا اللمفاوية بعد التفاعل مع المستضد المحدد. Lymphokines نشطة للغاية من الناحية البيولوجية وسوف تسبب الانجذاب الكيميائي وتنشيط الضامة وغيرها من التفاعلات المناعية الخلوية. جاما- الإنترفيرون هو ليمفوكين.

          LYSIS - العملية التي يحدث بها انهيار جدار الخلية مما يؤدي إلى إطلاق المحتوى الخلوي في البيئة المحيطة. تدمير البكتيريا بالعاثية المعدية.

          MASTER CELL BANK (MCB) - مجموعة بذور خلوية تتكون من قسامات من مزرعة واحدة (في معظم الحالات ، يتم توسيعها من خلية واحدة) وتخزينها مبردة لضمان الاستقرار الجيني. يجب أن تكون هناك أمبولات كافية من MCB لتوفير المواد المصدر لبنك البذور العامل.

          MESSENGER RNA (mRNA) - الحمض النووي الريبي الذي يعمل كقالب لتخليق البروتين يحمل الكود الجيني المنسوخ من الحمض النووي إلى مجمع تصنيع البروتين لتوجيه عملية تخليق البروتين.

          الجسيمات الدقيقة - اختلافات طفيفة في الجزيئات الكبيرة والمعقدة التي تؤدي إلى مجموعة من الهياكل وثيقة الصلة ولكن ليست متطابقة. يمكن أن تنشأ التغايرية الدقيقة للبروتين من عدة مصادر: المتغيرات الجينية ، النشاط التحلل للبروتين في الخلايا ، أثناء الترجمة إلى البروتين ، أثناء ربط السكريات وأثناء الإنتاج التجاري.

          مضادات الأجسام أحادية الخلية - الأجسام المضادة التي يتم إنتاجها بواسطة استنساخ خلوي وجميعها متطابقة.

          MUTAGENESIS - تحريض طفرة جينية بوسائل فيزيائية أو كيميائية للحصول على خاصية مرغوبة من قبل الباحثين.

          الطفرة - تغيير في المادة الجينية ، إما من زوج أساسي واحد (طفرة نقطية) أو في عدد أو بنية الكروموسومات.

          MYELOMA - خط الخلايا الورمية المستمدة من الخلايا الليمفاوية.

          ترجمة نيك - طريقة في المختبر تستخدم لإدخال النيوكليوتيدات الموصوفة إشعاعيًا في الحمض النووي.

          NICK - كسر في العمود الفقري للسكر والفوسفات في DNA أو RNA.

          OLIGONUCLEOTIDES - أجزاء قصيرة من DNA أو RNA ، أي سلسلة من عدد قليل من النيوكليوتيدات.

          المشغل - جين يقوم بتشغيل الجين (الجينات) الهيكلية المجاورة.

          OPERON - وحدة كاملة للتعبير الجيني البكتيري تتكون من جين (جينات) منظم ، وعناصر تحكم (محفز ومشغل) وجين (جينات) بنيوية مجاورة.

          باثوجين - عامل منتِج للأمراض ، يقتصر عادةً على عامل حي ، مثل البكتيريا أو الفيروسات.

          ببتيد بوند - رابطة كيميائية بين مجموعة الكربوكسيل (- COOH) من حمض أميني واحد ومجموعة أمينية (- NH2) من مجموعة أخرى.

          البلاك - منطقة واضحة في ثقافة بكتيرية مطلية بسبب تحلل الملتهمة.

          البلازميد - يتم استخدام جزء دائري خارج الصبغيات ، ذاتي التكاثر ، من بلازميدات الدنا (وبعض الفيروسات) كـ "نواقل" لاستنساخ الحمض النووي في الخلايا البكتيرية "المضيفة".

          متعدد الخلايا - مشتق من أنواع مختلفة من الخلايا.

          PROKARYOTE - كائن حي (مثل البكتيريا والفيروسات والطحالب الخضراء المزرقة) الذي لا يكون حمضه النووي محاطًا بغشاء نووي.

          بروتين - بولي ببتيد يتكون من أحماض أمينية. تعمل البروتينات ، في حالتها النشطة بيولوجيًا ، كمحفزات في عملية التمثيل الغذائي ، وإلى حد ما كعناصر هيكلية للخلايا والأنسجة.

          PYROGENICITY - ميل بعض الخلايا البكتيرية أو أجزاء من الخلايا للتسبب في تفاعلات التهابية في الجسم ، مما قد ينتقص من فائدتها كمنتجات صيدلانية.

          RECOMBINANT DNA - DNA الذي يحتوي على جينات من مصادر مختلفة تم دمجها بواسطة طرق الهندسة الوراثية بدلاً من تجارب التكاثر التقليدية.

          خريطة التقييد - الترتيب الخطي لمواقع إنزيم التقييد المختلفة.

          موقع التقييد - تسلسل أساسي يتعرف عليه الإنزيم.

          RETROVIRUS - فيروس RNA الذي يتكاثر عن طريق التحويل إلى DNA مزدوج.

          إنزيم النسخ العكسي - إنزيم يحفز تخليق الحمض النووي من الحمض النووي الريبي.

          الحمض النووي الريبي (RIBONUCLEIC ACID) - المكون الكيميائي الحيوي الأساسي للكروموسوم الموجود بشكل رئيسي في النواة والريبوسومات. ينقل Messenger RNA المعلومات الجينية من النواة إلى الريبوسومات في السيتوبلازم ويعمل أيضًا كقالب لتخليق polypeptides. ينقل نقل الحمض النووي الريبي الأحماض الأمينية المنشطة من السيتوبلازم إلى الرنا المرسال.

          RNA POLYMERASE - إنزيم يحفز تخليق الحمض النووي الريبي في النسخ.

          كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS- PAGE) (انظر طرق الاختبار)

          سلالة - مجموعة من الكائنات الحية من نفس النوع لها خصائص مميزة ، ولكن لا تعتبر عادة سلالة أو صنفًا منفصلاً.

          الخلايا التائية المساعدة - الخلايا اللمفاوية التائية ذات القدرة النوعية لمساعدة الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا الليمفاوية البائية ، على تكوين الأجسام المضادة. الخلايا التائية المساعدة مطلوبة أيضًا لتحريض أنشطة الخلايا اللمفاوية الأخرى. المرادف هو الخلية المحرضة T أو الخلية T4 أو الخلايا الليمفاوية CD 4.

          T- SUPPRESSOR CELLS - الخلايا اللمفاوية التائية ذات القدرة النوعية على تثبيط وظيفة الخلايا التائية المساعدة.

          النسخ - المرحلة الأولى في التعبير عن الجين عن طريق المعلومات الجينية التي تنتقل من الحمض النووي في الكروموسومات إلى الرنا المرسال.

          الترجمة - المرحلة الثانية في التعبير عن الجين عن طريق المعلومات الجينية التي تنتقل من mRNA إلى تخليق البروتين.

          ناقل - بلازميد أو فج أو كوزميد يمكن إدخال الحمض النووي الغريب فيه للاستنساخ.

          اللطخة الغربية - (انظر طرق الاختبار).

          WORKING CELL BANK (WCB) - كمية من الخلايا مشتقة من أمبولة أو أكثر من أمبولات بنك الخلايا الرئيسية وتستخدم لبدء دفعة الإنتاج.


          زائدة

          خدمات المختبر

          تعتبر الأعداد التالية من الخدمات المختبرية لكل دورة ضرورية من الناحية الطبية.

          الجدول: خدمات المختبر لكل دورة
          المراقبة الطبيعية مراقبة كلوميد كلوميد IUI دورة إنج مون إنج IUI اطفال انابيب هدية مجانية كود FET مساء
          الموجات فوق الصوتية عبر المهبل 2 6 6 8 10
          استراديول 2 6 6 8 10 10 10 10
          FSH 2 6 6 8 10 10 10 10
          LH 2 6 6 8 10 10 10 10
          البروجسترون 2 هوامش لهرمون البروجسترون * 2 هوامش لهرمون البروجسترون * 2 هوامش لهرمون البروجسترون * 8 10 10 10 10 3
          قوات حرس السواحل الهايتية 2 2 2 2 2 2 2 2 3

          المفتاح: IUI: التلقيح داخل الرحم الحقن: الإثنين: الإخصاب في المختبر شهريًا: الإخصاب في المختبر هدية: نقل الأمشاج داخل فالوب FET: نقل الأجنة المجمدة PM: مراقبة الحمل FSH: الهرمون المنبه للجريب LH: الهرمون اللوتيني hCG: موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية .

          حواشي البروجسترون *ملحوظة: قد يكون أكثر من قياسين من البروجسترون ضروريًا من الناحية الطبية للنساء المصابات بالعقم اللواتي يعانين من دورات شهرية غير منتظمة وطويلة. بالنسبة للنساء المصابات بالعقم اللائي لديهن دورات شهرية منتظمة ، يعتبر قياس هرمون البروجسترون في منتصف الدم الأصفر (اليوم 21 من دورة مدتها 28 يومًا) ضروريًا من الناحية الطبية. بالنسبة للنساء المصابات بالعقم مع دورات الحيض غير المنتظمة ، يجب تكرار هذا الاختبار في مرحلة منتصف الجسم الأصفر وأسبوعيًا بعد ذلك حتى تبدأ الدورة الشهرية التالية.

          Gonadotropins / Menotropins (الحواشي السفلية للدورة الأولية للدورة الأولية *)

          أقل من 35 سنة: 20 أمبولة (حتى 35 أمبولة إذا كان مستوى هرمون FSH أكبر من 12 وأقل من 19)

          العمر من 35 إلى 39 سنة: 20 إلى 30 أمبولة (حتى 40 أمبولة إذا كان مستوى هرمون FSH أكبر من 12 وأقل من 19)

          سن 40 سنة وما فوق: 40 أمبولة (حتى 50 أمبولة إذا كان مستوى هرمون FSH أكبر من 12 وأقل من 19)

          أقل من 35 سنة: 30 إلى 40 أمبولة (حتى 50 أمبولة إذا كان مستوى هرمون FSH أكبر من 12 وأقل من 19)

          العمر من 35 إلى 39 سنة: 35 إلى 45 أمبولة (حتى 55 أمبولة إذا كان هرمون FSH أكبر من 12 وأقل من 19)

          سن 40 سنة وما فوق: 45 إلى 60 أمبولة (تخضع طلبات الحصول على أكثر من 60 أمبولة للمراجعة السريرية إذا كان مستوى FSH أكبر من 12 وأقل من 19 ، اطلب بروتوكول الدواء والمراجعة السريرية (مؤشر كتلة الجسم ، متلازمة تكيس المبايض))

          حواشي سفلية لبيض المتبرع لبيض المتبرع ** (جميع الأعمار): 30 إلى 40 أمبولة (حتى 50 أمبولة إذا كان مستوى هرمون FSH أكبر من 12 وأقل من 19)

          الهرمون اللوتيني (الحواشي السفلية للدورة الأولية للدورة الأولية *)

          أقل من 35 سنة: 1-10 أمبولات

          من 35 إلى 39 سنة: من 10 إلى 15 أمبولة

          سن 40 سنة وما فوق: 15 الى 20 امبولة

          اقل من 35 سنة: 10 امبولات

          من 35 إلى 39 سنة: من 10 إلى 20 أمبولة

          سن 40 سنة وما فوق: 20 الى 30 امبولة

          الحقن تحت الجلد HCG (الحواشي السفلية للدورة الأولية للدورة الأولية *)

          حقن العضل HCG (حواشي الدورة الأولية للدورة الأولية *)

          المفتاح: ART: التكنولوجيا الإنجابية المتقدمة مؤشر كتلة الجسم: مؤشر كتلة الجسم FSH: هرمون تحفيز الجريب HCG: موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية IU: الوحدات الدولية MDV: قارورة متعددة الجرعات PCOS: متلازمة المبيض المتعدد الكيسات PFS: حقنة مملوءة مسبقًا U: وحدات.

          الحواشي السفلية للدورة الأولية * إعادة التعبئة بناءً على الوثائق الموجودة في أوراق الدورة.

          هوامش لبيض المتبرع ** بعض الخطط تستبعد خدمات العقم لفشل المبايض ، يرجى التحقق من أوصاف خطة المزايا.

          هوامش كمية التلقيح † تفترض أن دورة التلقيح داخل الرحم تستخدم الدواء لمدة 10 أيام

          الحواشي السفلية لـ ART Quantity تفترض أن دورة ART تستخدم الدواء لمدة 10 أيام.

          الحواشي السفلية للأمثلة § لتركيزات مختلفة استخدم 75 وحدة دولية كأساس.

          ماركات

          طول فترة الموافقة

          450 وحدة MDV ، 1050 وحدة MDV

          150 ، 300 ، 600 ، 900 وحدة خرطوشة متعددة الجرعات

          بعد تطبيع مستويات هرمون التستوستيرون في الدم ، استخدم Gonal F بالتزامن مع hCG: 150 وحدة ثلاث مرات في الأسبوع أقصى جرعة 300 وحدة ثلاث مرات في الأسبوع لمدة تصل إلى 18 شهرًا

          بعد تطبيع مستويات هرمون التستوستيرون في الدم ، استخدم Follistim AQ بالتزامن مع قوات حرس السواحل الهايتية: 450 وحدة في الأسبوع (أو 225 وحدة مرتين في الأسبوع أو 150 وحدة ثلاث مرات في الأسبوع).

          الحقن العضلي hCG

          أمثلة: بريجنيل ، نوفاريل ، قوات حرس السواحل الهايتية

          500-1000 وحدة ثلاث مرات في الأسبوع × 3 أسابيع متبوعة بنفس الجرعة مرتين في الأسبوع × 3 أسابيع

          4000 وحدة ثلاث مرات في الأسبوع لمدة 6-9 أشهر ، وبعد ذلك يمكن تقليل الجرعة إلى 2000 وحدة ثلاث مرات في الأسبوع لمدة 3 أشهر إضافية

          الحواشي السفلية لـ follitropin * يجب أن تستمر المعالجة المصاحبة لـ follitropin المؤتلف وعلاج موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية لمدة 3 إلى 4 أشهر على الأقل قبل توقع حدوث تحسن في تكوين الحيوانات المنوية.

          تعريفات

          لأغراض هذه السياسة ، سيتم استخدام التعريفات التالية:

          تصنيف اضطرابات التبويض:

          يعتبر قلة التبويض واضطراب التبويض من اضطرابات التبويض التي تشير التقديرات إلى أنها تسبب 21٪ من مشاكل الخصوبة لدى الإناث. تصنف منظمة الصحة العالمية اضطرابات الإباضة إلى 3 مجموعات.

          المجموعة الأولى:
          المجموعة الثانية:
          المجموعة الثالثة:

          جودة الجنين في دورات ART:

          يعتبر الجنين ذا جودة معقولة (الدرجة B أو ما يعادلها) إذا كان به تجزئة أقل من 50٪ (انظر ، على سبيل المثال ، Ebner ، وآخرون ، 2001 Rhenman ، وآخرون ، 2015 Shaw-Jackson ، وآخرون. ، 2013) ..

          معدلات الإخصاب في دورات التلقيح الاصطناعي:

          تعتبر معدلات الإخصاب ضعيفة إذا أدت دورات التلقيح الصناعي إلى أقل من 50٪ إخصاب.

          احتياطي المبيض استجابة لتحفيز الغدد التناسلية:

          يعتبر احتياطي المبيض طبيعيًا إذا نمت 3 حويصلات أو أكثر وكانت مستويات الإستروجين أكبر من 500 ميكرو وحدة / مل بعد فرط تحفيز المبيض باستخدام الجونادوتروبين. يشار إلى تناقص احتياطي المبيض من خلال ذروة مستويات هرمون الاستروجين التي تقل عن 500 ميكرومتر / مل أو أقل من 3 بصيلات ناضجة متوفرة في وقت التحفيز والاسترجاع.

          جودة وكمية السائل المنوي:

          يعتبر النقص في كمية السائل المنوي شديدًا إذا كان هناك أقل من 10 ملايين حيوان منوي متحرك لكل قذفة (عينة غير مغسولة) أو أقل من 3 ملايين حيوان منوي متحرك (عينة مغسولة) في مناسبتين منفصلتين بفاصل أسبوعين على الأقل. يعتبر النقص في جودة السائل المنوي شديدًا إذا كان هناك أقل من 4 ٪ من الأشكال الطبيعية باستخدام مورفولوجيا كروجر الصارمة. في الرجال الذين استوفوا تعريف عقم الذكور الحاد مع جودة أو كمية غير طبيعية للحيوانات المنوية بعد أكثر من أسبوعين في الماضي ثم نجحوا في استئصال دوالي القيلة مما أدى إلى جودة أو كمية طبيعية للحيوانات المنوية ، يعتبر الحقن المجهري غير ضروري من الناحية الطبية.

          تحليل السائل المنوي: القيم المرجعية لمنظمة الصحة العالمية
          • الرقم الهيدروجيني: 7.2 أو أكثر
          • تركيز الحيوانات المنوية: 15 مليون حيوان منوي لكل مل أو أكثر
          • مورفولوجيا الحيوانات المنوية (النسبة المئوية للأشكال الطبيعية): 4٪ أو أكثر
          • حجم السائل المنوي: 1.5 مل أو أكثر
          • الحركة الكلية (النسبة المئوية للحركة التقدمية والحركة غير التقدمية): 40٪ أو أكثر للحركة أو 32٪ أو أكثر مع الحركة التقدمية
          • إجمالي عدد الحيوانات المنوية: 39 مليون حيوان منوي لكل قذف أو أكثر
          • الحيوية: 58٪ أو أكثر من الحيوانات المنوية الحية
          مراحل الانتباذ البطاني الرحمي

          جراحيًا ، يمكن إجراء الانتباذ البطاني الرحمي من الأول إلى الرابع (التصنيف المنقح للجمعية الأمريكية للطب التناسلي). تظهر المراحل المختلفة هذه النتائج:

          المرحلة الأولى (الحد الأدنى) -

          المرحلة الثانية (خفيفة) -

          المرحلة الثالثة (متوسطة) -

          المرحلة الرابعة (شديدة) -

          المصدر: مقتبس من ASRM، 1997.


          استخدام RNAi كأداة أولية لفحص المستقبلات المفترضة للسموم القاتلة للنيماتودا Bacillus thuringiensis

          Bacillus thuringiensis هو عامل تحكم محتمل للنيماتودا المتطفلة على النبات. مستقبلات الديدان الخيطية المعوية للسموم من نوع Cry21 غير معروفة جيدًا. لذلك ، تم اختبار استراتيجية كأداة فحص أولية للعثور على مستقبلات سموم Cry المحتملة ، باستخدام سلالة Bt القاتلة للنيماتودا وتقنية RNAi على أنواع معينة انيقة. تم اختيار ستة جينات ترميز بروتينات غشاء الأمعاء (abt-4 ، bre-1 ، bre-2 ، bre-3 ، asps-1 ، abl-1) كأهداف محتملة لبروتينات Cry. تم تضخيم كسور كل جين محدد بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم استنساخ الأمبليكون في ناقل L4440 لتحويل ملف بكتريا قولونية سلالة HT155 (DE3). تم استخدام البكتيريا المحولة لإسكات الجينات المختارة باستخدام طريقة التغذية RNAi. تم اختبار الديدان الخيطية ذات الجينات الصامتة باستخدام سلالة Bt LBIT-107 ، التي تؤوي بروتين مبيد للنيماتودا Cry21Aa3 ، من بين أشياء أخرى. أشارت النتائج إلى أن الديدان الخيطية مع الصمت أبت -4 كان الجين 69.5٪ أكثر مقاومة لسلالة LBIT-107 بشكل عام و 79٪ لسم Cry21Aa3 على وجه التحديد.

          هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


          الاستنتاجات

          يحتاج اختيار جرنا للتجربة إلى تحقيق التوازن بين تعظيم النشاط المستهدف مع تقليل النشاط غير المستهدف ، والذي يبدو واضحًا ولكنه قد يتطلب غالبًا قرارات صعبة. على سبيل المثال ، هل سيكون من الأفضل استخدام جرنا أقل نشاطًا يستهدف موقعًا فريدًا حقًا في الجينوم ، أو جرنا أكثر نشاطًا مع موقع هدف إضافي واحد في منطقة من الجينوم بدون وظيفة معروفة؟ لإنشاء نماذج خلايا مستقرة لاستخدامها في الدراسة طويلة المدى ، قد يكون الخيار الأول هو الخيار الأفضل. ومع ذلك ، لكي تقوم مكتبة على مستوى الجينوم بإجراء فحوصات وراثية ، فمن المرجح أن تكون المكتبة المكونة من الأخيرة أكثر فعالية ، طالما تم الحرص على تفسير النتائج من خلال طلب تسلسلات متعددة تستهدف الجين للتسجيل من أجل استدعاء ذلك الجين الضرب.

          هذا وقت مثير لعلم الجينوم الوظيفي ، مع قائمة دائمة التوسع من الأدوات لفحص وظيفة الجين. أفضل الأدوات جيدة مثل الشخص الذي يستخدمها ، وسيعتمد الاستخدام المناسب لتقنية كريسبر دائمًا على التصميم التجريبي الدقيق والتنفيذ والتحليل.

          شكرا جزيلا لمدوننا الضيف جون دونش!

          John Doench هو مدير R & ampD في منصة الاضطرابات الوراثية في معهد Broad وقد عمل مع العديد من Addgenies للمساعدة في تحسين فهم مواردنا CRISPR ومعالجتها وشرحها. إنه حقًا يحب الحمض النووي الريبي الصغير.