معلومة

كيف تحسب العيار المتوسط ​​الهندسي (GMT) للعيار من مقايسة التراص الدموي (الأنفلونزا)؟

كيف تحسب العيار المتوسط ​​الهندسي (GMT) للعيار من مقايسة التراص الدموي (الأنفلونزا)؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

حصلت على قائمة عيارات الأجسام المضادة الخاصة بالإنفلونزا من مقايسة تثبيط التراص الدموي.

يبدون هكذا:

  • 40
  • 640
  • 160
  • <10

يقول موقع واحد: مقياس HI لإنفلونزا الخنازير هندسي: 20 ، 40 ، 80 ، 160 ، 320 ، 640 (تزداد القيم المتتالية بمعامل 2). المقياس الهندسي لوغاريتمي. من الأفضل التعبير عن متوسط ​​عيار الإنفلونزا HI كمتوسط ​​هندسي. يتم حساب المتوسط ​​الهندسي عن طريق حساب متوسط ​​لوغاريتمات قيم الاختبار ثم تحويل المتوسط ​​إلى رقم حقيقي. وهذا يمنع بعض القيم الإيجابية العالية الواضحة من جعل المتوسط ​​كبيرًا بشكل غير واقعي ".

ماذا يعني ذلك لعينتي؟ كيف أتعامل معها<10في هذا الحساب؟ هذا بالتأكيد ليس علم الصواريخ ، لكن بصراحة لا أفهمه الآن.


عادةً يتم تحويل "<10" إلى رقم أقل من حد الكشف ؛ في كثير من الأحيان "9". بعد ذلك ، باتباع التعليمات ببساطة ، ستحصل على 77.9 بتوقيت جرينتش. إذا كنت تستخدم تطبيقات جداول البيانات مثل Excel أو Google Sheets ، فمن شبه المؤكد أنها توفر وظائف "GEOMEAN" التي ستعطي الرقم مباشرة.


الحدود في علم المناعة

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.


  • تحميل المادة
    • تحميل PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • تكميلي
      مادة
    • ملاحظة ختامية
    • مدير المراجع
    • ملف TEXT بسيط
    • BibTex


    مشاركه فى

    مقدمة

    في جميع أنحاء العالم ، تشير التقديرات إلى أن أوبئة الأنفلونزا السنوية تؤدي إلى 250000 إلى 500000 حالة وفاة وما يصل إلى 5 ملايين حالة من الأمراض الوخيمة [1]. البالغون البالغون من العمر 65 عامًا أو أكبر معرضون بشكل خاص لمضاعفات عدوى الإنفلونزا ، ويمثلون 90٪ من جميع الوفيات المرتبطة بالإنفلونزا في الولايات المتحدة [2]. التطعيم هو الإستراتيجية الأساسية لمنع وتقليل المراضة والوفيات المرتبطة بالإنفلونزا [3] ، وتوصي منظمة الصحة العالمية (WHO) بالتطعيم السنوي للمجموعات المعرضة لخطر كبير من المضاعفات ، بما في ذلك كبار السن والأطفال الصغار والنساء الحوامل والصحة- عمال الرعاية والأفراد الذين يعانون من حالات طبية أساسية [1]. ومع ذلك ، فقد ثبت أنه من الصعب تحفيز الاستجابات المناعية القوية لدى الأفراد المسنين ، وتظهر الدراسات التي أجريت على الفئران والقوارض والبشر أن الاستجابات المناعية لمستضد معين تتراجع مع تقدم العمر [4-9]. وفقًا لذلك ، تم إجراء مراجعة كمية بواسطة Goodwin et al. يُظهر أن فعالية اللقاح السريري للقاحات الأنفلونزا عن طريق الحقن كانت 17-53٪ في كبار السن [10] مقارنة بـ 70-90٪ لدى البالغين الأصغر سنًا [11] ، وأنه بعد التطعيم ضد الإنفلونزا ، كان لدى البالغين الأصغر سنًا ما يصل إلى 4 أضعاف مستويات الأجسام المضادة مقارنة مع كبار السن [10].

    تتضمن استراتيجيات زيادة الاستجابة المناعية لدى كبار السن استخدام طرق بديلة لإيصال اللقاح ، أو جرعة أعلى من المستضد ، أو إضافة مادة مساعدة. تم تصميم لقاح الإنفلونزا عالي الجرعة Fluzone ® (Sanofi Pasteur Inc.) للأشخاص الذين تبلغ أعمارهم 65 عامًا أو أكثر ، ويحتوي على أربعة أضعاف كمية الهيماجلوتينين (HA) الموجودة في لقاحات الجرعات القياسية [12 ، 13]. تم تطوير لقاح الإنفلونزا المساعد عن طريق الحقن Fluad ® (بواسطة شركة Novartis) لكبار السن. أظهر كل من Fluzone® High-Dose و Fluad® استجابات مناعية خلطية معززة مقارنة بالجرعات القياسية من اللقاحات غير المساعدة [12-15]. ومع ذلك ، فإن اللجان الاستشارية للتحصين مثل اللجنة الاستشارية لممارسات التحصين (ACIP) في الولايات المتحدة ، واللجنة الاستشارية الوطنية للتحصين (NACI) في كندا ، تعتبر أنه لا يوجد حاليًا دليل كافٍ لتقديم توصية لاستخدامها الروتيني في السكان المسنين. يوجد حاليًا لقاح واحد فقط من لقاح الأنفلونزا داخل الأنف في السوق الغربية ، وهو لقاح حي موهن ضد الإنفلونزا (LAIV) يسمى Fluenz® / Flumist® (MedImmune ، AstraZeneca). ومع ذلك ، فإن LAIV غير مرخص للبالغين و GT18 عامًا في أوروبا ، ولا يوصى به للأفراد 50 عامًا في الولايات المتحدة. وقد تم التكهن بأن فعالية LAIV المحدودة في البالغين وكبار السن قد تكون بسبب عدم قدرتها على إصابة الأفراد بمناعة موجودة مسبقًا [16-18]. بعد التطعيم بلقاح LAIV ، يمكن أن يحدث تساقط فيروسي وهناك احتمال أن تنتقل سلالة اللقاح [19] ، مما قد يكون مشكلة إذا اتصل متلقو LAIV بأشخاص يعانون من نقص المناعة الشديد.

    سعينا هنا إلى تقييم لقاح يعتمد على مستضد الإنفلونزا المنقسمة مع مادة Endocine ™ المساعدة القائمة على الدهون في الفئران المسنة. Endocine ™ هو مادة مساعدة مخاطية ثبت أنها آمنة وجيدة التحمل في كل من الدراسات قبل السريرية والدراسات السريرية [20-24]. لقد أثبتنا سابقًا أن اللقاحات المُصاغة باستخدام Endocine ™ تعزز كلا من الاستجابات المناعية الخلطية والخلايا في الفئران بعد التطعيم داخل الأنف [20] ، وأظهرت دراسة أُجريت على قوارض أن Endocine ™ يحفز التتر عالي HI وتحييد الفيروسات ، ويحمي القوارض تمامًا من تكاثر الفيروس في الرئتين [22]. علاوة على ذلك ، دراسة حديثة أجراها Falkeborn et al. أظهر أن لقاح الإنفلونزا المستحضر Endocine ™ تسبب في مصل IgG وعيار تحييد الفيروس إلى مستويات مماثلة مثل ذيفان الكوليرا (CT) في الفئران ، وأحدث عيارات IgA في المصل والأنفلونزا المخاطية أعلى بكثير من لقاح الشب المعزز بالحقن [25 ]. في الدراسة الحالية ، اختبرنا ما إذا كان Endocine ™ يمكنه تعزيز الاستجابات المناعية الجهازية والمخاطية الخلطية لمستضد الإنفلونزا في الفئران المسنة.


    أساليب

    الدراسات السريرية

    تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في ستانفورد وتم إجراؤها وفقًا للإرشادات الخاصة بأبحاث الخلايا البشرية. تم ترخيص جميع اللقاحات المستخدمة في الولايات المتحدة للاستخدام في المجموعات السكانية المدروسة. تم الحصول على عينات الدم المحيطي في وحدة البحوث السريرية والتحويلية في جامعة ستانفورد بعد الحصول على موافقة / موافقة خطية مستنيرة من المشاركين. تمت معالجة العينات وحفظها بالتبريد بواسطة Stanford HIMC BioBank وفقًا لبروتوكولات التشغيل القياسية المتاحة عبر الإنترنت على موقع HIMC على الويب (https://iti.stanford.edu/himc/protocols.html).

    جمع البيانات

    تم الوصول إلى البيانات المتعلقة بالأفراد المسجلين في دراسات لقاح الأنفلونزا في برنامج لقاح ستانفورد- LPCH من Stanford Data Miner (SDM) الذي يحتفظ بالبيانات التي تمت معالجتها بواسطة HIMC من 2007 حتى الآن 22. تم تجميع مجموعة FluPRINT عن طريق تصفية SDM للمقايسات المتاحة في الدراسات التي تتضمن لقاح الإنفلونزا. نتج عن ذلك مجموعة بيانات تحتوي على بيانات من 740 متبرعًا سليمًا مسجلين في دراسات لقاح الأنفلونزا التي أجراها برنامج لقاح ستانفورد-إل بي سي إتش من 2007 إلى 2015 في الدراسات التالية: SLVP015 ، SLVP017 ، SLVP018 ، SLVP021 ، SLVP024 ، SLVP028 ، SLVP029 و SLVP030. يوفر الجدول 1 المتاح عبر الإنترنت فقط ملخصًا لجميع الدراسات بما في ذلك معلومات حول أرقام تعريف التجارب السريرية على www.clinicaltrials.gov والبروتوكولات السريرية وأرقام الانضمام إلى ImmPort للوصول إلى البيانات الأولية وتقارير الجودة ، وأخيرًا المراجع للأعمال المنشورة حيث تم استخدام البيانات. ImmPort هي بوابة إلكترونية تحتوي على بيانات من دراسات المناعة والتجارب السريرية الممولة من NIAID (https://immport.niaid.nih.gov/) 23. يتم توفير جميع البيانات الموجودة في مجموعة بيانات FluPRINT مجانًا من خلال بوابة البيانات المشتركة في مستودع ImmPort. في جميع الدراسات ، باستثناء الدراسة SLVP015 ، تم إعطاء اللقاح مرة واحدة فقط. كانت الدراسة SLVP015 عبارة عن دراسة طولية حيث تلقى 135 مشاركًا اللقاح في سنوات متتالية من 2007-2015. في جميع الدراسات ، تم تضمين المشاركين الأصحاء بشكل عام ، وفي بعض الدراسات (SLVP017 للأعوام 2010 و 2011 و 2013 ، SLVP021 و SLVP029) تم استبعاد أولئك الذين تم تطعيمهم في موسم الإنفلونزا السابق. تم تنزيل ما مجموعه 121 ملف CSV تحتوي على بيانات معالجة من فحوصات ودراسات مختلفة من SDM. يتوفر الارتباط إلى 121 ملف CSV على Zenodo 24. يقدم الجدول 1 ملخصًا للخصائص الديموغرافية لسكان دراسة FluPRINT. يمتد السكان على نطاق عمري واسع ، من 1 سنة إلى 90 سنة ، بمتوسط ​​عمر 27 سنة. من بين 740 فردًا تتوفر لديهم بيانات تجريبية ، 446 من الإناث و 294 من الذكور. غالبية الأفراد (491) كانوا قوقازيين (أصل أمريكي أوروبي). المعلومات الديموغرافية الكاملة متاحة على Zenodo 25. تم تقسيم الأفراد إلى مستجيبين مرتفعين ومنخفضين ، اعتمادًا على عيارات الأجسام المضادة HAI التي تم قياسها قبل التطعيم وبعده ، كما هو موضح أدناه. يوضح الشكل 2 المعلومات الديموغرافية لسكان دراسة FluPRINT ، بما في ذلك الجنس والعرق وحالة الفيروس المضخم للخلايا (CMV) والعمر حسب نتيجة التطعيم. من بين 363 فردًا مع استجابات HAI المقاسة ، تم تحديد 111 كمستجيبين مرتفعين و 252 كمستجيبين منخفضين. بشكل عام ، لم يلاحظ أي اختلافات كبيرة في الجنس ، وتوزيع العرق ، أو حالة الفيروس المضخم للخلايا (الشكل 2 أ) أو العمر (الشكل 2 ب) بين المستجيبين المرتفع والمنخفض.

    الخصائص الديموغرافية لسكان دراسة FluPRINT مقسمة حسب نتيجة التطعيم. توزيع الأفراد في فئات المستجيبين المرتفعين (الأحمر ، ن = 111) والمنخفض (الرمادي ، ن = 252) فيما يتعلق بـ (أ) الجنس والعرق ووضع CMV (ب) التوزيع العمري بين المستجيبين المرتفع والمنخفض. العمر محدد بالسنوات.

    فحوصات ومعالجة البيانات

    تم تحليل جميع البيانات المستخدمة ومعالجتها في HIMC 26. يوضح الشكل 1 ب توزيع المقايسات التي يتم إجراؤها عبر الدراسات السريرية والسنوات. بشكل عام ، كانت SLVP015 هي أطول دراسة ، امتدت من 2007 إلى 2014 ، وشملت 135 فردًا فريدًا ، بينما جاءت غالبية العينات (249) من دراسة SLVP018 (الشكل 1). تتوفر البيانات الأولية ، بما في ذلك ملفات التقارير ، والمعايير ، والضوابط ، والأجسام المضادة المستخدمة في ImmPort (https://immport.niaid.nih.gov/) تحت أرقام التعريف لكل دراسة متوفرة في الجدول المتوفر عبر الإنترنت فقط. جدول متاح عبر الإنترنت فقط 2 يوفر معلومات حول جميع المقايسات التي تم إجراؤها والبروتوكولات وعمليات التحقق المستخدمة والمراجع إلى المخطوطات المنشورة باستخدام البيانات. البروتوكولات الخاصة بجميع الفحوصات متاحة عبر الإنترنت على موقع HIMC (https://iti.stanford.edu/himc/protocols.html).

    مقايسة السيتوكينات المتعددة

    تم إجراء Multiplex ELISA باستخدام Luminex باستخدام حبة البوليسترين (لـ 51/52-plex) أو مجموعات الخرزة المغناطيسية (62/63-plex) (eBioscience / Affymetrix). يتم تطبيع بيانات Luminex المعالجة المتوفرة في FluPRINT على مستوى اللوحة للتخفيف من تأثيرات الدُفعة واللوحة 26. تم حساب متوسط ​​قيمتي شدة التألق المتوسطة (MFI) لكل عينة لكل تحليل ، ثم تحول السجل الأساسي 2. تم حساب درجات Z ((القيمة - الوسط) / الانحراف المعياري) ، مع حساب المتوسطات والانحرافات المعيارية لكل تحليل لكل لوحة. وهكذا ، كانت وحدات القياس Zlog2 لمصل Luminex. تم استخدام بعض بيانات Luminex في المنشورات السابقة 9،10،22،27،28. في عامي 2009 و 2010 ، لدراستي SLVP015 و SLVP018 ، تم تحليل تحليلات المصل باستخدام مجموعات MSD 4 و 9-plex (V-PLEX Human Proinflammatory Panel II ، Mesoscale ، Cat No. K15053D and Human ProInflammatory 9-Plex Ultra-Sensitive Kit ، مقياس متوسط ​​، Cat No. K15007C) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء الاختبار المسمى "Luminex الأخرى" فقط للدراسة SLVP015 في عام 2007 باستخدام مجموعة Human 42-Plex Polystyrene Kit (EMD Millipore ، H42 MPXHCYTO060KPMX42) وتمت معالجة البيانات بنفس طريقة فحوصات Luminex الموصوفة أعلاه (تم الإبلاغ عن وحدات القياس. Zlog2) 28.

    مقايسة تثبيط التراص الدموي

    تم قياس عيار الأجسام المضادة في المصل قبل التطعيم واليوم 28 بعد التطعيم باستخدام مقايسة HAI القياسية 29 باستخدام سلالات الأنفلونزا الموجودة في اللقاحات 9،10،27. تم حساب متوسط ​​التتر الهندسي (GMT) لجميع سلالات الفيروس الموجود في اللقاح ، بينما تم حساب تغير الطية على النحو التالي: GMT لجميع سلالات اللقاح في اليوم 28 / GMT لجميع سلالات اللقاح في اليوم 0. تم تحديد المستجيبين المرتفعين كأفراد التي تم تحويلها مصليًا (ارتفاع 4 أضعاف أو أكبر في عيار HAI) وتم حمايتها مصليًا (GMT HAI ≥ 40).

    المقايسات الفيروسية

    تم إجراء تحليل فيروس CMV و Epstein-Barr (EBV) باستخدام CMV IgG ELISA (Calbiotech ، Cat No. CM027G) و EBV-VCA IgG ELISA (Calbiotech ، Cat No. EVO10G) ، باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة 10،27،30.

    التنميط المناعي

    تم إجراء التنميط المناعي إما باستخدام قياس التدفق الخلوي (Lyoplate) 27،30 أو قياس الكتلة الخلوية (CyTOF) 30،31،32. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo باستخدام القوالب القياسية. تم تعديل البوابات على أساس المانحين المحدد ، إذا لزم الأمر ، للتحكم في أي اختلافات في الخلفية أو كثافة التلوين الإيجابية. تم تصدير الإحصائيات لكل مجموعة ذات بوابات إلى جدول بيانات. يتم تحديد النسبة المئوية لكل نوع خلية والإبلاغ عنها كنسبة مئوية من نوع الخلية الأصل.

    القياس الخلوي الخاص بالفسفرة

    تم إجراء فحوصات تدفق الفسفور إما باستخدام قياس التدفق الخلوي على PBMC (للدراسات SLVP015 و SLVP018 و SLVP021 من 2007 إلى 2012) 9،10،27،28،30 أو قياس الكتلة الخلوية على الدم الكامل (للدراسات SLVP015 و SLVP018 و SLVP021 في عام 2013 ) 33،34. يتم تحديد النسبة المئوية لكل نوع خلية والإبلاغ عنها كنسبة مئوية من نوع الخلية الأصل. تم الإبلاغ عن القيم المتوسطة لتقدير مستوى الفسفرة لكل بروتين استجابة للتحفيز. بالنسبة لبيانات تدفق الفوسفور المكتسبة على مقياس التدفق الخلوي ، تم حساب قيمة تغيير أضعاف مثل القراءة المحفزة مقسومة على القراءة غير المحفزة (على سبيل المثال ، النسبة المئوية 90 من MFI لـ CD4 + pSTAT5 IFNα المحفزة / النسبة المئوية التسعين من الخلايا غير المحفزة CD4 + pSTAT5) ، بينما بالنسبة للبيانات المكتسبة باستخدام القياس الخلوي الكتلي ، تم حساب تغير الطية عن طريق طرح arcsinh (الشدة) بين المحفز وغير المحفز (arsinh stim - arcsing unstim).

    المستورد الآلي وتنسيق البيانات

    بعد جمع البيانات ، تم إنشاء نص PHP مخصص لتحليل كل ملف من ملفات CSV البالغ عددها 121 واستيراد البيانات إلى قاعدة بيانات MySQL. شفرة المصدر للبرنامج النصي متاحة عبر الإنترنت على https://github.com/LogIN-/fluprint. يقوم البرنامج النصي بتحسين عملية تنسيق البيانات الضرورية لدمج البيانات من دراسات مختلفة. لم يتم استيراد بيانات التحكم والهراء ، مثل "خلايا CXCR3-FMO CD8 + T" ، و "nonNK-nonB-non-non-monocyte nonbasophils" ، و "قابلة للحياة" ، وما إلى ذلك لتوحيد البيانات ، تم تنظيف إدخالات CSV الأصلية في MySQL تنسيق قاعدة البيانات المقروء (مثل استبدال علامات الاقتباس والأقواس بشرطة سفلية ، "+" بالنص "إيجابي" ، وما إلى ذلك). بالإضافة إلى ذلك ، تم حل تصنيفات العرق (الجدول 2) وأسماء اللقاحات (الجدول 3) وتاريخ التطعيم (الجدول 4) في أشكال قياسية ، بينما تم ترقيم المقايسات (الجدول 5). على سبيل المثال ، تم تعيين "حقنة جرعة وحيدة من Fluzone" و "حقنة جرعة وحيدة من Fluzone 2009-2010" إلى "Fluzone" وإعطائها الرقم 4 (الجدول 3). في جميع الدراسات ، تم إعطاء اللقاحات في العضل من أجل IIV وداخل الأنف من أجل LAIV ، باستثناء دراسة واحدة حيث تم إعطاء تركيبة مرخصة مميزة من IIV داخل الأدمة وتم تصنيفها على أنها Fluzone Intradermal وأعطيت رقم 2. أثناء دمج البيانات ، استبدلنا السلاسل النصية بـ القيم الثنائية. على سبيل المثال ، بالنسبة لمتغير الجنس ، تم استبدال الإناث والذكور بصفر وواحد. للتمكن من التمييز بين الزيارات في سنوات متتالية ، تم حساب تعريف الزيارة الفريد. بالنسبة لبيانات الزيارة الداخلية الأصلية ، تم تصنيف كل زيارة في عام واحد على أنها V1 لليوم صفر و V2 لليوم السابع. ومع ذلك ، إذا جاء نفس الشخص في عام متتالي ، فسيتم تسمية اليوم صفر مرة أخرى باسم V1 ، واليوم السابع هو زيارة V2 ، مما يتسبب في تكرار القيم. لتجنب مثل هذه التكرارات في قاعدة البيانات ، قمنا بإنشاء معرف زيارة فريد. لذلك ، بالنسبة للمثال أعلاه ، سيتم تصنيف الزيارة الأولى في السنة الأولى باسم V1 لليوم صفر و V2 لليوم السابع ، ولكن بالنسبة للسنة التالية ، سيتم تصنيف الزيارات على أنها V3 لليوم صفر و V4 لليوم السابع. للتمييز بين فحوصات Luminex ، تم إعطاء البادئة L50 لكل تحليل تم تحليله باستخدام مجموعة Luminex 51/52-plex. أخيرًا ، قمنا بحساب القيم الجديدة وحساب معلمة نتيجة اللقاح باستخدام عيار الأجسام المضادة لـ HAI. تم تحديد المستجيبين المرتفعين كأفراد لديهم عيار الأجسام المضادة HAI لجميع سلالات اللقاح ≥40 بعد التطعيم وتغيير GMT HAI أضعاف 4 ، باتباع إرشادات إدارة الغذاء والدواء لتقييم فعالية اللقاح 2. تم التعبير عن نتيجة اللقاح كقيمة ثنائية: تم إعطاء المستجيبين المرتفعين قيمة واحدة والمستجيبين المنخفضين القيمة صفر.

    جداول توليد

    لبناء قاعدة بيانات FluPRINT ، أنشأنا أربعة جداول ، كما هو موضح في الشكل 3. يوضح الجدول 6 خصائص قاعدة بيانات FluPRINT. في الطاولة جهات مانحة، يمثل كل صف فردًا يعطى رقم تعريف فريدًا مشفرًا (معرف المتبرع للدراسة). تقدم المجالات الأخرى معلومات حول الدراسة السريرية التي تم تسجيل الفرد فيها (معرف الدراسة والمعرف الداخلي للدراسة) والجنس والعرق. الجدول الثاني ، المسمى زيارات المتبرعين يصف معلومات حول عمر المتبرع وحالة CMV و EBV ومؤشر كتلة الجسم (BMI) واللقاح الذي تم تلقيه في كل زيارة سريرية. تم منح كل زيارة سريرية تعريفًا فريدًا (معرف الزيارة) بالإضافة إلى معرف الزيارة الداخلية (المقدم من الدراسة السريرية) للتمييز بين الزيارات في السنوات المتتالية. لكل زيارة ، قمنا بحساب استجابة اللقاح عن طريق قياس استجابة الأجسام المضادة HAI. تتوفر معلومات حول نتائج اللقاح على شكل عيار متوسط ​​هندسي (geo_mean) ، والاختلاف في التتر المتوسط ​​الهندسي قبل التطعيم وبعده (delta_geo_mean) ، والاختلاف لكل سلالة لقاح (delta_single). في الحقل الأخير ، يتم تصنيف كل فرد على أنه مستجيب مرتفع ومنخفض (اللقاح_المستجيب). في كل زيارة ، تم تحليل العينات وتخزين المعلومات حول المقايسات التي تم إجراؤها (مجال الفحص) وقيمة التحليلات المقاسة (الوحدات والبيانات) في بيانات تجريبية طاولة. وأخيرا، فإن تاريخ طبى يصف الجدول المعلومات المرتبطة بكل زيارة سريرية حول استخدام الستاتين (statin_use) وما إذا كان لقاح الأنفلونزا قد تم تلقيه في الماضي (تاريخ لقاح الأنفلونزا) ، إذا كانت الإجابة بنعم ، فكم عدد المرات (total_vaccines_received، self report). نقدم أيضًا معلومات عن نوع لقاح الأنفلونزا الذي تم تلقيه في السنوات السابقة (من 1 إلى 5 سنوات قبل التسجيل في الدراسة السريرية). أخيرًا ، يتم توفير معلومات حول عدوى الأنفلونزا (تقرير تشخيص MD) والاستشفاء المرتبط بالإنفلونزا (تقرير مشارك).

    نموذج قاعدة بيانات FluPRINT. يُظهر الرسم التخطيطي مخطط قاعدة بيانات FluPRINT. الجداول الأساسية ، المتبرعون (الأحمر) ، زيارات المتبرعين (الأصفر) ، البيانات_التجريبية (الزرقاء) والتاريخ_الطبي (الأخضر) مترابطة فيما بينها. ترتبط الجداول التجريبية_البيانات والتاريخ_الطبي بالجدول الأساسي لزيارات المانحين.يتم سرد حقول البيانات لكل جدول ، بما في ذلك الاسم ونوع البيانات. CHAR و VARCHAR ، بيانات السلسلة كأحرف INT ، البيانات الرقمية كأعداد صحيحة FLOAT ، قيم البيانات الرقمية التقريبية DECIMAL ، قيم البيانات الرقمية الدقيقة DATETIME ، قيم البيانات الزمنية TINYINT ، البيانات الرقمية كأعداد صحيحة (النطاق 0-255) BOOLEAN ، البيانات الرقمية مع القيم المنطقية (صفر واحد). يتم الإشارة إلى الحد الأقصى لعدد الأحرف المسموح به في حقول البيانات كرقم بين قوسين.


    المواد والأساليب

    يبني

    الجينات الاصطناعية لـ HA كامل الطول (تحتوي على تسلسل HA1 و HA2 بما في ذلك منطقة الغشاء والحكاية السيتوبلازمية) لفيروس الأنفلونزا A / California / 07/2009 (A / Cal accession & # x00023 EPI177294 ، 567 من الأحماض الأمينية) ، A / New Caledonia / 20/99 (A / NC accession & # x00023 EPI139303، 565 amino acids)، A / Uruguay / 716/2009 (A / Uru accession & # x00023 EPI152544، 567 amino acids)، B / Brisbane / 60 / 2008 (B / Bri accession & # x00023 EPI394898، 586 amino acids)، B / Jiangsu / 10/2003 (B / Jia accession & # x00023 EPI242836، 584 amino acids) and B / Malaysia / 2506/04 (B / Mal تم تحسين الانضمام & # x00023 EPI175755 ، 585 من الأحماض الأمينية) (https://www.gisaid.org/) (GeneArt & # x000AE ، تقنيات الحياة & # x02122 التعاون). تم استنساخ كل من الجينات الاصطناعية في نسخة معدلة من ناقل التعبير التكاملي pKOIX حيث تم استبدال جوانب التكامل بتسلسلات موضع GRL3 لـ T. ثيرموفيلا وفقًا للطرق الموضحة في Weide et al. (التفاصيل حول المتجه متوفرة في Cilian AG) (20). حمل شريط التعبير النهائي جزء 1 كيلو بايت من محفز الكادميوم MTT1 المنطقة النشطة للمروج (24) ، BTU2-terminator ، وجين HA المقابل.

    سلالات والتحول وزراعة T. ثيرموفيلا

    T. ثيرموفيلا تم استخدام السلالات الفطرية (B1868 / 4 و B1868 / 7 و B2086 / 1 و SB1969 المتوفرة في Tetrahymena Stock Center أو American Type Culture Collection) كمضيفين للتحويل. تم تحويل الخلايا المقترنة مع نواقل التعبير التكاملي عبر القصف البيولوجي باستخدام البروتوكولات القياسية (25 ، 26). تم زراعة المحولات الفردية بشكل روتيني عند 30 & # x000B0 درجة مئوية دون إثارة في وسط SPO 1.5 مل (1 ٪ ببتون البطاطس ، 0.5 ٪ مستخلص الخميرة ، 0.1 ٪ محلول كلاب كبريتات الحديدوز ، 0.2 ٪ جلوكوز) أو في وسط SPP (1 ٪ ببتون بروتين ، 0.5 ٪ مستخلص الخميرة ، 0.1٪ محلول كبريتات الحديدوز ، 0.2٪ جلوكوز). تمت إضافة المضاد الحيوي Paromomycin (500 & # x003BCg / ml) إلى كل وسط لعدة ممرات لدعم عملية تشكيلة الأليلات. تمت زراعة المحولات المتنوعة بمقياس 1.5 مل بدون مضاد حيوي عند 30 & # x000B0C و 80 دورة في الدقيقة في شاكر حضانة Multitron AJ (Infors).

    تم إنتاج HA من سلالات الفيروسات A / California و A / New Caledonia و A / Uruguay و B / Brisbane B / Jiangsu و B / Malaysia في T. ثيرموفيلا. يتم تلخيص عملية الإنتاج والتنقية في الشكل 1 أ.

    شكل 1. يتم التعبير عن إنتاج وتوصيف rHA المؤتلف في رباعي الغشاء ثيرموفيلا. (أ) رسم تخطيطي للإنتاج والتنقية انظر الجدول S1 للحصول على تفاصيل الشروط المستخدمة لمختلف rHA. تم تحليل كل rHA المنقى بواسطة SDS-PAGE وتلطيخ الفضة (ب ، د) أو لطخة غربية (ج ، هـ). A / Cal ، ciliate مشتق rHA A / California / 07/09 B / Bri ، ciliate مشتق rHA B / Brisbane / 60/2008 PC ، تحكم إيجابي إما مستضد A / California / 07/09 (12/168 ، NIBSC) أو B / Brisbane / 60/2008 (13/234 ، NIBSC) حسب الاقتضاء M ، علامة الوزن الجزيئي. (F) مثال لمقايسة التراص الدموي لـ rHA A / Cal ، عينات من شقين مخفف ، (ز) مثال على قيمة التراص الدموي لـ rHA A / Cal.

    تمت زراعة المحولات التي تحمل وحدة التعبير عن مستضد A / Cal أو B / Bri أو B / Jia أو B / Mal في وسط 400 مل SPO أو SPP مكمل بـ 1 ٪ من الكازين المائي عند 30 & # x000B0C و 80 دورة في الدقيقة في قوارير Erlenmeyer (تصميم Fernbach 1800 مل). تم إحداث التعبير عن كل مستضد بإضافة 94 & # x003BCM كادميوم (CdCl2، Sigma-Aldrich) لثقافة متنامية لوغاريتميًا. تم إجراء حصاد الخلية 15 & # x0201317 ساعة بعد الحث بالطرد المركزي عند 15 & # x000B0C لمدة 8 دقائق عند 1،200 & # x000D7 جم. تم تعليق بيليه الخلية في محلول فوسفات الصوديوم سعة 20 ملي مولار مكمل بـ 2.5 مجم / لتر إي -64 (PeptaNova) وتم تخزينه في & # x0221280 & # x000B0C.

    بالنسبة لمحولات التخمير على نطاق تجريبي التي تحمل وحدة التعبير عن المستضد A / NC أو A / Uru ، تمت زراعتها في جهاز تخمير UD 50 L (Biostat & # x000AE Sartorius) في 50 لترًا من وسط SPP المضاف إليه 1 ٪ من الكازين المائي. تم الحفاظ على درجة الحرارة عند 30 & # x000B0C و pO2 تم التحكم فيه عند 20٪ من مستوى تشبع الهواء. تم تنظيم قيمة الأس الهيدروجيني إلى 7.0 درجة الحموضة. تم إحداث التعبير عن كل مستضد بإضافة 47 & # x003BCM كادميوم (CdCl2، Sigma-Aldrich) لثقافة متنامية لوغاريتميًا. تم إجراء حصاد الخلية 15 & # x0201317 h بعد الحث باستخدام وحدة ألياف مجوفة (Spectrum 0.5 & # x003BCm polyethersulfone). تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول فوسفات الصوديوم 20 ملي مولار مكمل بـ 2.5 مجم / لتر E-64 وتخزينه في & # x0221280 & # x000B0C.

    إجراء التنقية

    اختلفت عملية التخمير والتنقية بشكل طفيف لكل HA من السلالات الفيروسية المختلفة. يتم تقديم تفاصيل عملية A / Cal هنا ، ويتم وصف الاختلافات وتفاصيل المخازن المؤقتة في الجدول S1.

    تم استخراج rHA من الخلايا المعطلة باستخدام المخزن المؤقت A عن طريق التحريك على محرك مغناطيسي عند 4 & # x000B0C بين عشية وضحاها. تم توضيح المستخلص باستخدام وحدة ألياف مجوفة (GE Healthcare 0.45 & # x003BCm polyethersulfone). تم تعديل الأس الهيدروجيني للراشح إلى الرقم الهيدروجيني 7.13 باستخدام المخزن المؤقت B. تم تحميل الراشح على Capto SP ImpRes (تمت معايرته باستخدام المخزن المؤقت C) عند 6.5 مل / دقيقة. بعد التحميل ، تم غسل العمود باستخدام المخزن المؤقت C. rHA وتم التصفية التتابعية باستخدام المخزن المؤقت D. تم تركيز الشطف وترشيحه باستخدام المخزن المؤقت E عن طريق ترشيح التدفق المتقاطع (Sartorius MWCO 50 كيلو دالتون بولي إيثر سلفون). تم تحميل المحلول على عمود Fetuin-Agarose (تمت معايرته بمخزن مؤقت مبرد مسبقًا F) عند 1.5 مل / دقيقة. تم غسل العمود باستخدام محلول منظم مبرد مسبقًا F. تمت إزالة rHA من عمود Fetuin-Agarose مع المخزن المؤقت G عند درجة حرارة الغرفة وتم تركيز تحضير rHA وترشيحه باستخدام المخزن المؤقت H عن طريق ترشيح التدفق المتقاطع (MWCO 50 كيلو دالتون). تم تحميل المحلول على Capto SP ImpRes HiScreen (تمت معايرته باستخدام المخزن المؤقت I) بمعدل 1.6 مل / دقيقة. بعد التحميل ، تم غسل العمود باستخدام المخزن المؤقت I. تم التصفية من rHA باستخدام المخزن المؤقت J. تم تركيز الشطف وترشيحه باستخدام المخزن المؤقت K عند 16 & # x000B0C بواسطة مُركّز طرد مركزي (Sartorius MWCO 50 كيلو دالتون بولي إيثر سلفون) إلى تركيز نهائي قدره 0.86 مجم / مل (مجموعة فحص البروتين بيرس & # x02122 BCA ، الحرارية العلمية). في الخطوة النهائية ، تم ترشيح المحلول باستخدام مرشح معقم (Carl Roth 0.22 & # x003BCm ، فلوريد البولي فينيلدين).

    SDS-Page ، تحليل البقعة الغربية ، وتلطيخ الفضة

    تم التحقق من تعبير البروتين عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) على 4 & # x0201320٪ bis-tris gels (Anamed Elektrophorese) (27). عولجت العينات بمخزن عينة يحتوي على 4٪ SDS ، ولم يتم إضافة عامل اختزال. تم مسح المواد الهلامية إما على أغشية النيتروسليلوز أو تلطيخها وفقًا لـ Pierce & # x000AE Silver Stain Kit (Thermo Scientific). تم حظر أغشية النيتروسليلوز المنقط في محلول ملحي بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.05 ٪ توين 20 و 1 ٪ حليب منزوع الدسم (PBS-TM) لـ A / Cal ، B / Bri. تم الكشف عن التعبير عن HA المؤتلف المعني في ciliates المحولة بواسطة مضاد إنفلونزا HA مناسب من الأغنام متعدد النسيلة من NIBSC (مصل مضاد لـ A / California / 07/2009-HA & # x0221214 / 310 ، NIBSC: anti-B / Brisbane / 60/2008 - مصل HA & # x0221213 / 254 ، NIBSC) وفجل الحصان بيروكسيديز (HRP) - أرنب مقترن - مضاد IgG مضاد للأغنام. تم تطوير اللطخات باستخدام اللمعان الكيميائي وتم تصورها باستخدام نظام وبرامج التصوير الانصهار (Peqlab).

    فحص التراص الدموي لتقييم جودة المستضد

    تم إجراء فحص التراص الدموي باستخدام كريات الدم الحمراء لخنزير غينيا لـ A / Cal (تعليق 1 ٪) وكريات الدم الحمراء للدجاج لـ A / NC و A / Uru و B / Bri و B / Jia و B / Mal (0.5 ٪ أو 1 ٪ تعليق). تم غسل كريات الدم الحمراء وتعديلها إلى التركيز المقابل باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل بـ 0.05٪ BSA (الرقم الهيدروجيني 7.4). تمت معايرة عينات rHA المنقى في صفيحة ميكروترية 96 بئر مع آبار على شكل حرف V (كارل روث) وحضنت عند 4 & # x000B0C لمدة ساعة واحدة.

    الرئيسيات غير البشرية دراسة التحصينات وأخذ العينات

    تم تحصين مجموعات من 2 من قرود المكاك في الأسابيع 0 و 3 و 6 إما عن طريق الحقن العضلي (المجموعة 1) أو الحقن تحت الجلد (المجموعة 2) مع 45 & # x003BCg من كل rHA A / NC ، A / Uru ، ب / جيا ، وب / مال. تم جمع عينات الدم في الأسبوع 0 و 3 و 4 و 6 و 7 و 10 لتحليل استجابة الجسم المضاد المصل.

    حمض بولي اللاكتيك & # x02014Nod2 تخليق وتوصيف الجسيمات

    i-Particles & # x000AE من Adjuvatis (فرنسا) هي جسيمات PLA مصنوعة بواسطة طريقة الترسيب النانوي بإضافة محلول نقطي من بوليمر حمض اللاكتيك متعدد D و L-lactic المذاب على الأسيتون (2٪ وزن / حجم) إلى مرحلة مائية مكونة من الماء والإيثانول ، مع التحريك المعتدل (250 دورة في الدقيقة). لم تكن هناك حاجة إلى خافض للتوتر السطحي أو مثبت لتثبيت محلول الغروانية. تمت إزالة المذيبات عن طريق التبخر تحت ضغط منخفض باستخدام بخار Buchi rotavapor بما في ذلك حمام مائي عند 30 & # x0201334 & # x000B0C ومبرد تم الحفاظ عليه عند & # x0221210 & # x000B0C. كان تركيز الجسيمات النهائي حوالي 7٪ من مستوى المادة الصلبة وتم تحديده بدقة عن طريق وزن المواد الرطبة والمجففة. تم توفير PLA NP-Nod2 أيضًا بواسطة Adjuvatis بواسطة تقنية الترسيب النانوي كما هو موضح سابقًا (23). يجند Nod2 ، ميفامورتيد ، مشتق اصطناعي من الموراميل ثنائي الببتيد (سيغما الدريتش). تمت إضافة هذا الترابط إلى محلول PLA-acetone بنسبة كتلة 1٪ وزن / وزن يجند: PLA.

    تم الحصول على كفاءة تغليف ليجند Nod2 من خلال تحديد كمية الترابط الحر المتبقي في المادة الطافية بعد عمليات الطرد المركزي لمحلول الجسيمات النانوية (10 دقائق عند 10000 & # x000D7 جم). تمت تربية المواد الطافية باستخدام خطوط خلايا مراسل HEK-Blue & # x02122-hNOD (InvivoGen) في لوحات 96 ميكروويل (50000 خلية / بئر في نسختين) لدراسة تحفيز مستقبل Nod2 من خلال مراقبة تنشيط مسار NF - & # x003BAB الذي يحفز إنتاج الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز (SEAP) واستخدام وسيط كشف يتحول إلى اللون الأزرق في وجود الفوسفاتيز القلوي. تم قياس امتصاص العينات عند 650 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (ThermoScientific). تم اختبار حلول Nod2 ligand مبدئيًا باستخدام خلايا HEK-Blue & # x02122-hNOD لرسم منحنى المعايرة. تم حساب كفاءة تغليف بروابط Nod2 من خلال نسبة كتلة يجند في NPs على الكتلة الكلية للرابط في الوصفة.

    امتزاز مستضد HA على جزيئات PLA-Nod2

    HA من رباعية الغشاء تم امتصاصه على جسيمات PLA-Nod2 عن طريق خلط أحجام متساوية من تشتت الجزيئات (المخفف في الماء عند مستوى 3٪ من المادة الصلبة) ومحلول البروتين (عند 30 & # x003BCg / ml) مع التحريك العلوي المعتدل ، لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة . في نهاية الحضانة ، تمت إزالة جزء من الجسيمات المطلية بـ HA للتوصيف. تم طرد أربعمائة ميكرولتر عالي السرعة (10 دقائق عند 10000 & # x000D7 جم) وتم قياس كمية المادة الطافية التي تحتوي على جزء HA غير الممتز (Pierce & # x02122 BCA Protein Assay Kit) لاستنتاج تركيز HA الممتز. تمت إضافة محلول كلوريد الصوديوم المركّز المعقم إلى محاليل جزيئات HA لضبط تركيز الأسمول إلى 300 ملي أوسمول وتركيز المستضد إلى 90 & # x003BCg / ml من تركيبات اللقاح. تم تحديد القطر الهيدروديناميكي وتوزيع الحجم وإمكانات زيتا للجسيمات المصنعة. تم قياس امتصاص العينات عند 562 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (Multiskan FC ، Thermo Scientific).

    تحصين الفأر

    للتجارب التي تهدف إلى توصيف استجابة الجسم المضاد في الفئران ، تم شراء فئران BALB / c عمرها 7 أسابيع من تشارلز ريفر (ليكو ، إيطاليا) وتم الاحتفاظ بها في أقفاص مزودة بالطعام والماء بالشهرة الإعلانية، مع الإثراء البيئي والتعشيش. تم تحصين مجموعات من 6 فئران. و s.c. مع 15 & # x003BCg / فأرة rHA A / Cal بحجم 50 & # x003BCl / mouse ، أو مع 30 & # x003BCg / فأرة rHA B / Bri بحجم 100 & # x003BCl / mouse ، على التوالي. تم إعطاء اللقاحات ثلاث مرات بفاصل 3 أسابيع (الأسبوع 0 ، 3 ، 6). تم أخذ عينات الدم من الضفيرة الزمنية للفئران الفردية في الأسابيع & # x022121 و 3 و 6 و 8 ، وحضنت لمدة 30 دقيقة عند 37 & # x000B0C وطردها عند 1200 & # x000D7 جم عند 4 & # x000B0C لمدة 15 دقيقة لجمع الأمصال التي تم تخزينها في & # x0221280 & # x000B0C.

    لإجراء تجارب لاختبار الحماية من العدوى ، تم الحصول على فئران CB6F1 من الإناث البالغ عمرها 6 & # x0201310 أسبوعًا من Harlan UK Ltd (Barking ، المملكة المتحدة) وتم الاحتفاظ بها خالية من مسببات الأمراض المحددة. اتبعت الدراسات إرشادات ARRIVE. تم تحصين الفئران IM. مع 1.5 أو 15 & # x003BCg ciliate مشتق من rHA A / Cal أو مع 3 أو 30 & # x003BCg rHA B / Bri وحده في 50 & # x003BCl في نظام تعزيز رئيسي. تم استخدام 1.5 & # x003BCg مشتق من البيض A / Cal HA (GSK ، سيينا ، إيطاليا) كعنصر تحكم إيجابي. عند الاستخدام ، تم دمج جزيئات NOD مع 0.015 & # x003BCg rHA A / Cal وتم تسليمها s.c. بالنسبة للعدوى ، تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين وإصابتها بالعدوى. مع فيروس الأنفلونزا 100 & # x003BCl أو برنامج تلفزيوني معقم. تم إعدام الفئران باستخدام 100 & # x003BCl بينتوباربيتون داخل الصفاق (جرعة 20 مجم ، Pentoject ، Animalcare Ltd. UK) والأنسجة التي تم جمعها كما هو موضح سابقًا (28). تم نشر الفيروسات في خلايا Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) ، في DMEM الخالي من المصل المضاف إليه التربسين 1 & # x003BCg / ml. تم تقييم الحمل الفيروسي للإنفلونزا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كما هو موضح سابقًا (29). تم تقييم النتيجة السريرية كما هو موضح سابقًا (30). تمت معايرة جرعة التحدي من الفيروس (30) لتقليل معاناة الحيوانات ، وتحديداً كان نموذجًا غير قاتل ، لتتناسب مع إرشادات الصقل.

    فيروسات الانفلونزا

    فيروسات الأنفلونزا المعدية المستخدمة لتثبيط HA ، وتحييد الفيروس في المختبر المقايسات و في الجسم الحي كان التحدي هو سلالات الأنفلونزا الموسمية التي تم الحصول عليها من NIBSC: A / California / 7/2009 (H1N1، 15/252) و B / Brisbane / 60/2008 (نسب فيكتوريا ، 15/146). تم تكاثر الفيروسات خلال 11 يومًا من بيض الدجاج المُضغ.

    مقايسة تثبيط التراص الدموي

    جميع عينات المصل ، بما في ذلك مصل الأغنام المفرط المناعة (A / California / 7/2009: رمز NIBSC 09/152 ، B / Brisbane / 60/2008: رمز NIBSC 11/136) كعناصر تحكم إيجابية ومصل بشري بدون IgA و IgM و و IgG كعنصر تحكم سلبي (Sigma-Aldrich ، S5393) ، تمت معالجتهما مسبقًا بإنزيم تدمير المستقبل (RDE) (نسبة 1: 5) من Vibrio Cholerae (Sigma Aldrich) لمدة 18 ساعة عند 37 & # x000B0C في حمام مائي ثم معطل الحرارة لمدة ساعة عند 56 درجة مئوية و # x000B0C في حمام مائي مع 8٪ سيترات الصوديوم (نسبة 1: 4). تم طرد خلايا الدم الحمراء في تركيا مرتين ، وغسلها بمحلول ملحي (0.9٪) وتعديلها إلى تخفيف نهائي بنسبة 0.35٪. تم تخفيف عينات المصل مرتين في نسختين بمحلول ملحي (0.9 ٪) في لوحة 96 بئراً من تخفيف أولي قدره 1:10. تمت إضافة خمسة وعشرين ميكرولتر من مستضد فيروسي معياري (4 وحدات HA / 25 & # x003BCl) إلى كل بئر وتم تحضين الخليط عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تمت إضافة خلايا الدم الحمراء في تركيا وبعد ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة ، تم تقييم الصفائح لوجود تثبيط تراص. يتم التعبير عن عيار الجسم المضاد كمقابل لأعلى تخفيف مصل يظهر تثبيطًا كاملاً للتراص. نظرًا لأن تخفيف البداية هو 1:10 ، فإن الحد الأدنى لعيار الجسم المضاد القابل للاكتشاف هو 10. عندما يكون العيار تحت الحد القابل للاكتشاف ، تم التعبير عن النتائج تقليديًا على أنها 5 لأغراض الحساب ، أي نصف الحد الأدنى للكشف.

    فحص ELISA

    تم تقييم IgG المصل الخاص بـ A / Cal و B / Bri عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) كما هو موضح سابقًا (31). باختصار ، تم طلاء ألواح ميكروتر MaxiSorp (Nunc) مع المؤتلف A / Cal- و B / Bri- (2 & # x003BCg / ml Cilian كما هو موصوف أعلاه) طوال الليل عند 4 & # x000B0C ، محجوبًا بـ PBS و 1٪ BSA ، ثم تمت إضافته مع عينات مصل معايرة في تخفيفين. تم تحضين العينات بعد ذلك باستخدام الفوسفاتيز القلوي المتقارن من الماعز IgG (المخفف 1: 1000 ، Southern Biotechnology) لمدة ساعة واحدة عند 37 & # x000B0C وتم تطويرها بإضافة 1 مجم / مل من ركيزة الفوسفاتيز القلوية (Sigma-Aldrich). تم تسجيل الكثافة الضوئية باستخدام مقياس ضوئي للصفيحة الرقيقة من Multiskan FC (علمي حراري).

    فحص تحييد الفيروس

    نمت مزارع الخلايا MDCK عند 37 & # x000B0C في 5 ٪ CO2. عينات المصل ، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية ، التي تم تعطيلها مسبقًا بالحرارة عند 56 و # x000B0C لمدة 30 دقيقة ، تم تخفيفها مرتين باستخدام وسط استزراع MDCK الفائق مع 2 & # x003BCg / مل من التربسين من البنكرياس البقري (TPCK ، Sigma-Aldrich) في لوحة 96 بئراً ومختلطة مع حجم متساوٍ من الفيروسات (100 TCID50 / بئر). بعد ساعة حضانة عند 37 & # x000B0C في 5٪ CO2، يضاف الخليط إلى تعليق خلية MDCK (1.5 & # x000D7 10 5 خلايا / مل). تمت قراءة اللوحات لتأثير الاعتلال الخلوي بعد 3 أيام من الحضانة عند 37 & # x000B0C في 5 ٪ CO2.

    تحليل احصائي

    تم إجراء الحسابات كما هو موضح في أشكال الرسم التوضيحي باستخدام Prism 6 (GraphPad Software Inc.).

    توافر البيانات

    يتم تضمين جميع البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها خلال هذه الدراسة في هذه المقالة المنشورة (وملفات المعلومات التكميلية الخاصة بها).

    بيان الأخلاق

    الكبار cynomolgus المكاك (حاشية مكاكا) تم استيرادها من موريشيوس وتم وضعها في مرافق مركز نماذج الأمراض المعدية والعلاجات المبتكرة (IDMIT) (CEA ، Fontenay-aux-Roses ، فرنسا). تم تضمين اثنين من ذكور الحيوانات في كل مجموعة تجريبية. تم استخدام NHPs في CEA وفقًا للوائح الفرنسية وتحت إشراف المفتشين البيطريين الوطنيين (رقم تصريح CEA A 92-032-02). يتوافق CEA مع معايير العناية البشرية واستخدام حيوانات المختبر ، على النحو المنصوص عليه من قبل مكتب رعاية حيوانات المختبر (OLAW ، الولايات المتحدة الأمريكية) وهو معتمد بموجب رقم ضمان OLAW & # x00023A5826-01. يتوافق استخدام NHP في CEA مع التوصيات الواردة في التوجيه الأوروبي 2010/63 (التوصية N & # x000B09). تم استخدام الحيوانات تحت إشراف الأطباء البيطريين المسؤولين عن المنشأة الحيوانية. تمت الموافقة على هذه الدراسة واعتمادها بموجب البيان رقم (A15 007) من قبل لجنة الأخلاقيات & # x0201CComit & # x000E9 d & # x00027Ethique en Exp & # x000E9rimentation Animale du CEA ، & # x0201D رقم التسجيل 44 لوزارة الأبحاث الفرنسية. تم إيواء الحيوانات في أزواج في وحدات تسمح بالتفاعل الاجتماعي ، تحت رطوبة محكومة ودرجة حرارة وظروف إضاءة (12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورات مظلمة). كانت المياه متوفرة بالشهرة الإعلانية. تمت مراقبة الحيوانات وإطعامها 1 & # x020132 مرة يوميًا بطعام القرد التجاري والفاكهة من قبل موظفين مدربين. تم تزويد قرود المكاك بالمحفزات البيئية بما في ذلك الألعاب والمواد الغذائية والموسيقى تحت إشراف هيئة رعاية الحيوان CEA & # x00027s.أجريت الإجراءات التجريبية (التعامل مع الحيوانات ، وبروتوكولات التحصين ، وأخذ عينات الدم) بعد تخدير الحيوانات باستخدام كلوريد الكيتامين (Rh & # x000F4ne-M & # x000E9rieux ، ليون ، فرنسا ، 10 مجم / كجم).

    تم علاج دراسات الفئران في إيطاليا وفقًا للإرشادات الوطنية (Decreto Legislativo 26/2014). تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في منشأة حيوانية بمختبر الأحياء الدقيقة الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية (LA.M.M.B.) ، قسم التقنيات الحيوية الطبية في جامعة سيينا ، إيطاليا. تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على الحيوانات من قبل وزارة الصحة الإيطالية بتصريح n & # x000B0 1004/2015-PR ، 22 سبتمبر 2015. أجريت دراسات على الفئران في المملكة المتحدة وفقًا لإرشادات وزارة الداخلية في المملكة المتحدة و # x00027s وتمت الموافقة على جميع الأعمال من قبل مجلس رعاية الحيوان والمراجعة الأخلاقية (AWERB) في إمبريال كوليدج لندن.


    مركب مساعد يعزز المناعة عند الجرعات الجزئية من لقاح شلل الأطفال المعطل سابين (sIPV) مع حماية طويلة الأمد في نموذج الفئران

    مراسلة Weidong Li ، قسم تنظيم المنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، طريق جياولينغ 935 ، 650118 كونمينغ ، مقاطعة يونان ، الصين. البريد الإلكتروني: [email protected]

    Guoyang Liao ، القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، طريق جياولينغ 935 ، 650118 كونمينغ ، مقاطعة يونان ، الصين. بريد إلكتروني: [email protected]

    القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    مراسلة Weidong Li ، قسم تنظيم المنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، طريق جياولينغ 935 ، 650118 كونمينغ ، مقاطعة يونان ، الصين. البريد الإلكتروني: [email protected]

    Guoyang Liao ، القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، طريق جياولينغ 935 ، 650118 كونمينغ ، مقاطعة يونان ، الصين. بريد إلكتروني: [email protected]

    القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    قسم الحصول على الشهادات مع منظمة الصحة العالمية ، ومعهد البيولوجيا الطبية ، والأكاديمية الصينية للعلوم الطبية ، وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    القسم الرابع للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    القسم السادس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    القسم التنظيمي للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    مراسلة Weidong Li ، قسم تنظيم المنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، طريق جياولينغ 935 ، 650118 كونمينغ ، مقاطعة يونان ، الصين. البريد الإلكتروني: [email protected]

    Guoyang Liao ، القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، طريق جياولينغ 935 ، 650118 كونمينغ ، مقاطعة يونان ، الصين. بريد إلكتروني: [email protected]

    القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، كونمينغ ، الصين

    مراسلة Weidong Li ، قسم تنظيم المنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، طريق جياولينغ 935 ، 650118 كونمينغ ، مقاطعة يونان ، الصين. البريد الإلكتروني: [email protected]

    Guoyang Liao ، القسم الخامس للمنتجات البيولوجية ، معهد البيولوجيا الطبية ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية طب اتحاد بكين ، طريق جياولينغ 935 ، 650118 كونمينغ ، مقاطعة يونان ، الصين. بريد إلكتروني: [email protected]

    تسجيل الدخول المؤسسي
    قم بتسجيل الدخول إلى مكتبة Wiley Online

    إذا سبق لك الحصول على حق الوصول باستخدام حسابك الشخصي ، فيرجى تسجيل الدخول.

    شراء الوصول الفوري
    • شاهد المقال بصيغة PDF وأي ملاحق وأرقام مرتبطة به لمدة 48 ساعة.
    • المادة يمكن ليس أن تتم طباعتها.
    • المادة يمكن ليس يمكن تنزيلها.
    • المادة يمكن ليس يتم إعادة توزيعها.
    • عرض غير محدود لمقال PDF وأي ملاحق وأرقام مرتبطة به.
    • المادة يمكن ليس أن تتم طباعتها.
    • المادة يمكن ليس يمكن تنزيلها.
    • المادة يمكن ليس يتم إعادة توزيعها.
    • عرض غير محدود للمقال / الفصل PDF وأي ملاحق وأرقام مرتبطة.
    • يمكن طباعة المقال / الفصل.
    • يمكن تحميل المادة / الفصل.
    • المادة / الفصل يمكن ليس يتم إعادة توزيعها.

    الملخص

    خلفية

    في نفس الجرعة ، فإن الجيل الجديد من لقاح فيروس شلل الأطفال المعطل سابين (sIPV) أقل مناعة من جرعة لقاح شلل الأطفال الفموي التقليدي (OPV) في الصين. قد تكون المادة المساعدة المفيدة استراتيجية ضرورية لتقوية تأثيرات الحماية المناعية.

    أساليب

    في هذه الدراسة ، أنتجنا مركبًا مساعدًا (يُسمى KML05) يمكنه تعزيز المناعة والجرعات الكسرية من sIPV مع فترة حماية طويلة في نموذج الفئران. كان للمادة المساعدة المركبة مزايا ووظيفة MF59 و carbopol971P.

    نتائج

    يمكن أن يمتد تأثير التحويل المصلي لحيوانات التجارب المحصنة بـ KML05 إلى ثُمن الجرعة. وفقًا لنتيجة التتر المتوسط ​​الهندسي (GMTs) ، يمكن أن يوفر مساعد KML05 ثمانية أضعاف كمية استخدام مستضد sIPV D ، ولكن يمكن أن يوفر مساعد هيدروكسيد الألومنيوم مرتين في نفس التتر. بالإضافة إلى ذلك ، وجد أن هناك فرقًا كبيرًا في عيار GMT لفيروس شلل الأطفال من النوع 2 بين الحيوانات المحصنة بواسطة KML05 ومساعد الشب (ص & lt 0.05). في 12 شهرًا بعد التطعيم ، تم الحفاظ على عيار التعادل المحفز بواسطة IPV-KML05 على مدى فترة زمنية أطول في الحيوانات المحصنة.

    استنتاج

    طور فريق البحث لدينا مادة مساعدة KML05 ، والتي تجمع بين carbopol971P و MF59 ، مما أدى إلى زيادة استجابات الجسم المضاد لـ sIPV لفترة أطول من الحماية في نموذج الفئران.


    مقارنة عيارات الأجسام المضادة للإنفلونزا بين النساء اللواتي تم تطعيمهن في الثلث الثاني والثالث من الحمل

    قارنا عيار الأجسام المضادة لدم الحبل السري في النساء الحوامل غير الملقحات بتلك التي تم تطعيمها بلقاح الأنفلونزا الموسمية خلال الثلث الثاني والثالث من الحمل.

    أساليب

    تم جمع دم الحبل السري عند الولادة لفحص تثبيط التراص الدموي ضد الفيروسات المرجعية للقاح: A / California / 07/2009 (H1N1) pdm09 ، A / سويسرا / 9715293/2013 (H3N2) ، و B / Phuket / 3073/2013 (Yamagata النسب). تم حساب نسب متوسط ​​العيار الهندسي (GMT) بمقارنة النساء الحوامل الملقحات مقابل غير الملقحات ، والنساء اللواتي تم تطعيمهن في الثلث الثاني والثالث من الحمل. تمت مقارنة نسب النساء اللائي حققن عيارًا محددًا باستخدام اختبار 2.

    نتائج

    من بين 307 امرأة ، لم يتم تلقيح 190 (62٪). تم تطعيم خمسين و 67 خلال الثلثين الثاني والثالث على التوالي. كان متوسط ​​عمر الالتحاق 29 سنة (المدى بين الشرائح الربعية 24-34). ستة عشر (5 ٪) من النساء كانت لديهن ظروف موجودة مسبقًا ، لكن لم يكن أي منها منقوصًا في المناعة. كانت نسب توقيت غرينتش التي تقارن بين النساء اللواتي تم تلقيحهن وغير الملقحات 5.90 (فاصل الثقة 95٪ [CI] 5.06-6.96) للأنفلونزا أ / كاليفورنيا ، 5.39 (95٪ فاصل الثقة 4.18-6.08) للأنفلونزا أ / سويسرا ، و 5.05 (95٪ فاصل الثقة 4.43– 5.85) للأنفلونزا ب / بوكيت. وبالمثل ، كانت نسب توقيت جرينتش التي تقارن النساء اللواتي تم تلقيحهن في الثلث الثالث والثاني من الحمل 2.90 (فاصل الثقة 95٪ 2.54-3.39) و 2.82 (فاصل الثقة 95٪ 2.56-3.13) و 2.83 (فاصل الثقة 95٪ 2.56-3.14) على التوالي. لم تختلف نسب النساء اللواتي لديهن عيارات محددة للفيروسات المرجعية للقاح الثلاثة بين النساء اللواتي تم تلقيحهن في الثلث الثاني والثالث من الحمل (التتر 40: 68-92٪ مقابل 70-93٪ 110: 32٪ مقابل 33-63٪ و 330: 4-10٪ مقابل 3-21٪).

    الاستنتاجات

    كان لدى النساء الحوامل اللائي تم تطعيمهن ضد الإنفلونزا نقل أكثر من المشيمة للأجسام المضادة للإنفلونزا إلى أطفالهن مقارنة بالنساء غير الملقحات. كان نقل الأجسام المضادة من المشيمة أعلى بين أولئك الذين تم تلقيحهم في الثلث الثالث من الحمل مقارنة بالثلوث الثاني من الحمل. لم يكن هناك فرق في نسب النساء اللائي حصلن على عيار الأجسام المضادة المقابلة للحماية من الأنفلونزا عند الأطفال. تدعم النتائج توصية منظمة الصحة العالمية الحالية التي تقضي بتلقيح النساء الحوامل في الثلث الثاني أو الثالث من الحمل.


    كيف تحسب العيار المتوسط ​​الهندسي (GMT) للعيار من مقايسة التراص الدموي (الأنفلونزا)؟ - مادة الاحياء

    تم الكشف عن وجود أجسام مضادة لفيروس مرض نيوكاسل في الدجاج عن طريق الاختبارات المصلية. نتائج هذه الاختبارات تستخدم لثلاثة أغراض.

    1. لتقييم فعالية لقاح مرض نيوكاسل في التجارب المعملية والميدانية.

    2. لتقييم مستوى الأجسام المضادة لفيروس مرض نيوكاسل في الميدان.

    3. يستخدم المصل المعروف باحتوائه على أجسام مضادة لفيروس مرض نيوكاسل لتأكيد وجود فيروس مرض نيوكاسل في عينة اختبار من السائل السقائي. يمكن الحصول على هذه العينة أثناء عزل فيروس مرض نيوكاسل الخبيث. انظر القسم 15.

    هناك نوعان من الاختبارات المستخدمة بشكل شائع لإجراء الاختبارات المصلية للأجسام المضادة لفيروس مرض نيوكاسل.

    1. اختبار تثبيط التراص الدموي (HI). اختبار HI هو اختبار مناسب وشائع الاستخدام يتطلب كواشف رخيصة ويمكن قراءته بالعين.

    2. ELISA (مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم). هذا اختبار قياس الألوان ويتطلب استخدام أداة متطورة لقراءة الكثافة الضوئية للتفاعلات. يتم تحضير مجموعات ELISA للكشف عن الأجسام المضادة لفيروس مرض نيوكاسل وبيعها تجاريًا. يتم تزويد التعليمات التفصيلية بالمجموعات. عادة ما تكون باهظة الثمن.

    في هذا الدليل ، سيتم استخدام بروتوكول لاختبار HI استنادًا إلى الاختبار الموصوف بواسطة Allan and Gough للاختبارات المصلية. (ألان وجوف ، 1974 أ.)

    يتم جمع عينات المصل لفحص وجود الأجسام المضادة لفيروس مرض نيوكاسل. يتم جمع الدم كما هو موصوف في القسم 7. يشكل الدم جلطة في المحقنة في غضون دقائق قليلة. بمجرد تجلط الدم ، يمكن الاحتفاظ بحقن الدم مع الإبرة في وضع مستقيم لمنع ملء المصل بغطاء الإبرة. سينفصل المصل عن الجلطة في غضون ساعات قليلة في درجة حرارة الغرفة أو في غضون ساعتين تقريبًا عند 37 & # 176 درجة مئوية. التخزين في 37 & # 176 درجة مئوية سيساعد المصل على فصل الجلطة.

    • الحقن بعينات الدم.
    • ماصات زجاجية معقمة باستور.
    • أنابيب ميكروفوج.
    • أنابيب التخزين. (1.8 مل من أنابيب Nunc cryotubes مثالية لكن الأنابيب الصغيرة هي بديل أرخص.)
    • حاوية الأدوات الحادة وأكياس التخلص من النفايات البيولوجية.

    1. قم بإزالة المكبس من المحقنة. نقل المصل إلى أنبوب microfuge عن طريق صب أو استخدام الزجاج ماصة باستور.

    2. التخلص من الإبر والمحاقن والجلطات والماصات في حاويات مناسبة.

    3. غالبًا ما يحتوي المصل على خلايا الدم الحمراء. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي دقيق أو السماح بالاستقرار تحت الجاذبية طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية لتكوير الخلايا. لا تجمد العينات في هذه الخطوة. التجميد سوف يزيل خلايا الدم الحمراء.

    4. نقل المصل الصافي إلى الأنبوب الثاني.

    5. تذكر تسمية كل أنبوب بعد نقل المصل. وهذا يضمن إمكانية تطبيق نتائج المصل على الطيور والمجموعات الفردية.

    قم بتخزين أمبولات المصل عند -20 & # 176 درجة مئوية.

    يُسمح بالتخزين في 4 & # 176C لفترة قصيرة تصل إلى أسبوعين.

    قد ينتهي الأمر بالعينات التي يتم جمعها في الحقل في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها وغالبًا لا تنفصل جيدًا.

    لوحظ في مختبر جون فرانسيس لعلم الفيروسات أنه في بعض العينات لا ينفصل المصل عن الجلطة. في هذه الحالات ، يتم طرد الجلطة بأكملها. ينتج عن هذا عادة كمية صغيرة من فصل المصل.

    من المهم أن تكون عينات المصل واضحة. تحتوي العينات الوردية على خلايا الدم الحمراء المفسدة. عند اختبار العينات الوردية ، لاحظ عينات الاختبار والمراقبة بعناية لتحديد تأثير اللون على نتائج الاختبار.

    يمكن أن تؤثر العينات ذات اللون الوردي على نتائج اختبار ELISA ، وهو اختبار قياس الألوان.

    نظرة عامة على اختبار تثبيط التراص الدموي (HI)

    يمكن قياس استجابة الجسم المضاد لبروتين الهيماجلوتينين في غلاف فيروس مرض نيوكاسل عن طريق اختبار HI.

    عندما يختلط المصل الذي يحتوي على هذه الأجسام المضادة مع فيروس مرض نيوكاسل ، ترتبط الأجسام المضادة ببروتين الهيماجلوتينين في غلاف الفيروس. هذا يمنع بروتين الهيماجلوتينين من الارتباط بموقع المستقبل على خلايا الدم الحمراء للدجاج.

    وهكذا يتم منع تفاعل التراص الدموي بين الفيروس وخلايا الدم الحمراء.

    من خلال إجراء تخفيفات متسلسلة ذات شقين على المصل قبل الاختبار ، يمكن التعبير عن تركيز الأجسام المضادة في المصل كمعيار HI لقاعدة السجل 2.

    توحيد اختبار HI

    من المهم أن يكون هناك ارتباط بين نتائج الفحوصات التي يقوم بها فنيين مختلفين وفي المختبرات المختلفة. لهذا السبب ، يجب توحيد اختبارات HI داخل المختبر وبين المختبرات.

    يتم تحقيق التقييس باتباع بروتوكول قياسي. سيشمل ذلك:

    استخدام 4 وحدات HA قياسية من مستضد فيروس مرض نيوكاسل.

    استخدام مصل مضاد للسيروم الإيجابي القياسي والسالب.

    بما في ذلك مراقبة مصل لكل مصل اختبار للكشف عن وجود الراصات غير النوعية.

    استخدام تخفيف قياسي بنسبة 1٪ من خلايا الدم الحمراء.

    استخدام مصل التحكم في اختبار HI

    يتم اختبار الأمصال الضابطة الإيجابية والسلبية لتجنب الأخطاء في تفسير نتائج اختبار HI. قد يكون سبب التناقضات في نتائج اختبار HI هو الاختلافات في الكواشف والإجراءات.

    تتضمن أمثلة الاختلافات المحتملة ما يلي:

    المصدر والنسبة المئوية الدقيقة لحجم خلايا الدم الحمراء.

    المقدار الدقيق للمستضد المستخدم في اختبار HI.

    دقة التخفيف.

    درجة حرارة.

    الوقت المسموح به لحدوث تفاعلات الأجسام المضادة / المستضد.

    جودة عينات مصل الاختبار (قد تكون عينات مصل الدم المتحللة مسؤولة عن التفاعلات غير النوعية)

    يتم استخدام اثنين من الأمصال القياسية.

    1. مصل تحكم سلبي قياسي معروف أنه لا يحتوي على أجسام مضادة لفيروس مرض نيوكاسل. لا تحتوي على عيار HI ولا تتراكم خلايا الدم الحمراء للدجاج.

    2. مصل قياسي للتحكم الإيجابي يُعرف أيضًا باسم مصل مضاد قياسي. سيتم إنشاء عيار HI للمضاد عن طريق المعايرة المتكررة.

    التباين في عيار HI للمصل الإيجابي القياسي

    يُلاحظ أحيانًا أن عيار HI القياسي للمصل المضاد القياسي الذي تم اختباره في نفس اليوم باستخدام نفس إعداد وبروتوكول المستضد قد يختلف. يمكن اعتبار الاختلاف في عيار HI لتخفيف واحد وهو سجل أساسي واحد 2 (2 1) بسبب أخطاء عشوائية وتغير متأصل في الاستجابات البيولوجية. ومع ذلك ، إذا اختلف عيار المصل الإيجابي القياسي بأكثر من تخفيف واحد أو قاعدة السجل 2 ، فسيتم إبطال الاختبار. في هذه الحالة ، يجب تحضير مستضد جديد واختباره وتكرار اختبار HI.

    ثلاث فئات من الأمصال القياسية

    1. المصل المرجعي الدولي. تقوم بعض المعامل بإعداد المصل المرجعي وفقًا لمعايير عالية جدًا. يتوفر مصل مضاد لمرض نيوكاسل المرجعي القياسي للشراء. يتم استخدامه كمصل مرجعي في تحضير الأمصال المعيارية الوطنية والمخبرية.

    يمكن للمعهد الوطني للمعايير البيولوجية والتحكم (NIBSC) في المملكة المتحدة توفير مصل مرجعي قياسي دولي. تم تحديد فعالية المصل المرجعي الدولي من قبل المورد ويتم التعبير عنها بالوحدات الدولية (IU) لكل أمبولة من المصل المجفف بالتجميد.

    البريد الإلكتروني [البريد الإلكتروني & # 160 محمي]
    هاتف 44 (0) 1707 654753
    فاكس 44 (0) 1707 646730
    الموقع الإلكتروني http://www.nibsc.ac.uk

    2. يتم تحضير المصل المعياري الوطني من قبل مختبر وطني وتوزيعه على المختبرات المتعاونة حسب الحاجة. يتم تحضير هذا المصل عن طريق خلط الأمصال مع معايير HI المعروفة. يتم إجراء سلسلة من اختبارات HI لتحديد عيار HI للمعيار الوطني. تتم مقارنة هذا مع عيار HI للمصل المرجعي القياسي الدولي إذا كان متاحًا. ثم يتم تخزين المصل القياسي الوطني في قسامات متعددة وتوزيعه على المختبرات المتعاونة داخل البلد.

    3. يتم تحضير المصل المعياري للمختبر من قبل بعض المعامل من أجل الحفاظ على إمدادات المصل القياسي الوطني. يتم تحضير معيار المختبر بخلط عينات المصل مع مقاييس HI المعروفة. يتم استخدام اختبار HI المقارن لمعيار المختبر والمعيار الوطني لإنشاء عيار HI لمعيار المختبر.

    إعداد الأمصال القياسية الوطنية والمخبرية

    سيتطلب كل مختبر إمدادًا بمصل التحكم السلبي والإيجابي من أجل إجراء اختبارات HI على عينات المصل.

    مجموعة من المصل السلبي HI

    جمع المصل من الدجاج الذي لم يتعرض لفيروس مرض نيوكاسل. يجب ألا يُظهر المصل أي تثبيط لنشاط التراص الدموي الفيروسي عند اختباره بواسطة اختبار HI. غالبًا ما يكون من الصعب العثور على مصل بدون أي نشاط HI. في هذه الحالة ، استخدم مصلًا مع معايير HI منخفضة تبلغ 2 1.

    مجموعة من المصل الإيجابي HI

    قد يكون هناك مصل مخزّن مناسب لهذا الغرض. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتطعيم العديد من الدجاج بلقاح I-2 لمرض نيوكاسل. بعد أسبوعين من التطعيم الأولي ، أعط لقاحًا معززًا. بعد أسبوعين ، خذ عينة مصل من كل دجاجة واختبر HI Titre. اجمع مصلًا إضافيًا من الدجاج مع عيار 2 5 أو أعلى. يعتمد حجم الدم الذي يتم جمعه من كل دجاجة على حجم الدجاج. اجمع جميع عينات المصل باستخدام عيار HI من 2 5 أو أعلى واختبر عيار HI للمصل المجمع.

    اختبار HI المقارن للمرجع الدولي والأمصال المعيارية الوطنية

    أشارت المعلومات التي قدمتها NIBSC في عام 2001 إلى أن مرجعها القياسي الدولي يحتوي على 320 وحدة دولية لكل أمبولة.

    يمكن إعادة تكوين المصل في برنامج تلفزيوني. سيكون الحجم المناسب من PBS 2 مل ، مما سيعطي 4 وحدة دولية في عينة الاختبار 25 & # 181L. الرجوع إلى التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.

    استخدم اختبار HI القياسي الموضح في هذا القسم لتحديد عيار المعيار المرجعي الدولي والمعيار الوطني.

    اختبار كلتا العينات في ثلاث نسخ على نفس لوحة ميكروويل.

    قم بإجراء سلسلة من ثلاثة اختبارات على الأقل في أيام مختلفة.

    بمجرد إنشاء عيار HI للمصل القياسي الدولي والمصل القياسي الوطني ، قم بإعداد سلسلة من التخفيفات ذات الشقين من المصل التي تنتشر حول نقطة النهاية المستخدمة لإنشاء عيار HI. عاير التخفيفات التي تتراوح من التثبيط الكامل إلى عدم التثبيط كفحص إضافي لمعايير HI. ستؤكد نتائج اختبار هذه التخفيفات عيار HI للمصل غير المخفف.

    مثال لتأكيد عيار HI للعينات القياسية عن طريق اختبار سلسلة من التخفيفات للعينة.

    أدى الاختبار المتكرر للمصل المجمع إلى إنشاء عيار HI عند 2 5.

    تحضير 1/8 ، 1/16 ، 1/32 و 1/64 تخفيف من المصل المجمع.

    اختبر كل تخفيف لمعيار HI.

    النتائج التوكيدية: النتائج الواردة في الجدول تؤكد أن عيار HI من المصل المستخدم لتحضير التخفيفات كان له عيار 2 5.

    الجدول 3: النتائج التي تؤكد HI عيار المصل = 2 5

    ستعطي نتائج الاختبار عيار HI لكل من المصل المرجعي الدولي ومصل المختبر الوطني الذي يتم اختباره. يمكن استخدام عيار HI لـ 4 IU من المصل المرجعي الدولي لتحديد عدد IU في المصل المرجعي الوطني.

    اختبار HI القياسي 25 & # 181L للمصل المرجعي الدولي الذي يحتوي على 4 IU وله عيار HI يبلغ 8 (2 3). اختبر المصل الوطني عيار HI البالغ 64 (2 6).

    كم وحدة دولية يحتويها المصل الوطني؟

    4 وحدة دولية في عينة ذات عيار HI 8.

    كم (؟) وحدة دولية في عينة ذات عيار عالي 64.

    لا تستخدم جميع المختبرات نفس البروتوكول لاختبار عيار HI و IU مستقلة عن نظام الاختبار المستخدم.

    يجب أن تعطي النتائج المصلية للعينات المعبر عنها بوحدة IU نتائج مكافئة عند اختبارها بواسطة أنظمة مختلفة.

    من خلال مقارنة HI titre للمصل الوطني القياسي مع HI titre للمصل المرجعي الدولي ، يمكنك التعبير عن نتائج اختبارات HI في IU. ومع ذلك ، فليس كثيرًا ما يُطلب منك التعبير عن نتائج اختبار HI في IU.

    تصف معظم منشورات نتائج مصل مرض نيوكاسل المقايسة المستخدمة وتعبر عن معاير HI إلى قاعدة السجل 2.

    تحضير مصل معمل معياري

    يجب أن يتلقى كل مختبر مصلًا قياسيًا وطنيًا من مختبر مركزي. سيتم تحديد عيار HI والنشاط في الوحدات الدولية من المصل من خلال اختبار صارم كما هو موضح أعلاه. للحفاظ على إمداد المصل القياسي الوطني ، ستقرر بعض المختبرات إعداد مصل مختبري ثانوي قياسي.

    جمع المصل الإيجابي كما هو موضح أعلاه. القيام باختبار مقارن للمختبر والمعايير الوطنية. اختبر كل عينة في ثلاث نسخ على نفس لوحة ميكروويل. كرر عدة مرات وقم بتحليل معايير HI لكلتا العينات. سجل عيار HI لمعيار المختبر.

    قم بتخزين قسامات 1 مل من معيار المختبر في -20 & # 176 درجة مئوية. يتم استخدام هذا المعيار في كل مرة يتم فيها إجراء اختبار HI ويجب دائمًا إظهار نفس عيار HI عند اختباره باستخدام 4 وحدات HA من المستضد.

    تحضير مصل قياسي وطني بدون مصل ذو مرجع دولي

    لن تتمكن العديد من المختبرات من الحصول على مصل دولي مرجعي لمقارنة مصلها القياسي الوطني. في هذه الحالة ، ستكون هناك حاجة إلى اختبار HI أكثر صرامة لعينات المصل الإيجابية المجمعة HI لإنشاء عيار HI للمصل القياسي. يقترح أن يتم اختبار المصل حتى عشر مرات. استخدم 4 وحدات HA محضرة حديثًا لكل اختبار وقم بإجراء الاختبار في أيام مختلفة إن أمكن. ستكون النتائج عبارة عن مجموعة من معايير HI. يمكن اعتبار العيار الأكثر تكرارا هو عيار HI للمصل القياسي. يجب أن تعطي جميع اختبارات HI المستقبلية التي يتم إجراؤها على المصل القياسي هذا العيار.

    تخزين المصل القياسي

    بمجرد اختبار الأمصال القياسية الإيجابية والسلبية ، يمكن تحضير قسامات ووضع العلامات عليها وتخزينها مجمدة. التخزين في درجة حرارة -70 & # 176 درجة مئوية هو الأمثل (ولكن -20 & # 176 درجة مئوية كافية). لا تذوب وتعيد تجميد العينات بشكل متكرر. يجب إذابة العينات التمثيلية واختبارها للتأكد من عدم فقدان العيار في عملية التخزين.

    تحضير مستضد فيروس مرض نيوكاسل لاستخدامه في اختبارات HI

    يتم تحضير المستضد عن طريق تلقيح البويضات الجنينية بعينة من فيروس مرض نيوكاسل وحصاد السائل السقائي بعد أربعة أيام. يمكن تخصيص جزء من الدفعة الأولى من لقاح مرض نيوكاسل I-2 المحضر من البذور العاملة I-2 للتخزين كمستضد. حجم 50 مل إلى 100 مل كافٍ لعدد كبير من الاختبارات. قم بالطرد المركزي للعينة عند 1200 جرام لتوضيح وإزالة أي خلايا دم حمراء ملوثة. قم بتخزين المستضد في جزء مليلتر واحد عند -20 & # 176 درجة مئوية.

    تحضير وحدات 4HA من مستضد فيروس مرض نيوكاسل

    الكمية القياسية لفيروس مرض نيوكاسل المستخدمة في اختبار تثبيط التراص الدموي (HI) هي وحدات 4HA. من الضروري تحضير واختبار معلق لفيروس مرض نيوكاسل يحتوي على وحدات 4HA من أجل إجراء اختبار HI. هذا يتضمن سلسلة من الخطوات التالية.

    1. عاير التعليق المخزن للفيروس لاستخدامه كمستضد في اختبار HI. انظر القسم 10 احسب عيار HA.

    2. احسب معامل التخفيف المطلوب لإنتاج 4 وحدات HA. طريقة بسيطة هي قسمة عيار HA على 4.

    3. قم بتطبيق عامل التخفيف وقم بتخفيف التعليق الأصلي للمستضد في برنامج تلفزيوني لإنتاج حجم كافٍ من مستضد 4HA لإجراء اختبار HI. السماح 2.5 مل لكل لوحة ميكروويل.

    4. عاير التعليق المخفف (4HA) للفيروس. هذه معايرة رجعية للتحقق من احتواء المستضد المخفف على 4 وحدات HA.

    5. قراءة HA titre. يجب أن تساوي وحدات 4HA. إذا لم يتم ضبط التخفيف والمعايرة مرة أخرى.

    6. استخدم وحدة التخفيف 4HA للمستضد في اختبار HI لاختبار المصل الإيجابي والسلبي القياسي. يجب أن يساوي عيار HI للمصل الموجب المعياري للمختبر العيار المحدد مسبقًا.

    يتم استخدام كل من نتائج المعايرة الخلفية لمولد الضد المخفف ومعيار HI للمعيار الإيجابي لتأكيد أن المستضد قد تم تخفيفه إلى تركيز مكافئ لوحدات HA القياسية 4.

    إذا كان عيار HI لمصل التحكم الإيجابي أقل من العيار القياسي ، يكون المستضد شديد التركيز. تحضير مخفف جديد واختباره مرة أخرى.

    على العكس من ذلك ، إذا كان عيار HI لمصل التحكم الإيجابي مرتفعًا جدًا ، يكون المستضد مخففًا جدًا. تحضير مخفف جديد واختباره مرة أخرى.

    تحضير وحدات 4HA من المستضد لاختبار HI في 10 لوحات ميكروويل:

    تم اختبار عيار HA للمستضد وفقًا للبروتوكول الموصوف أعلاه. عيار HA = 128

    حساب عامل التخفيف لتحضير 4 وحدات HA: 128/4 = 32

    مطلوب حساب حجم 4HA وحدة التخفيف من المستضد:

    السماح 2.5 مل لكل لوحة الحجم الإجمالي المطلوب = 10 & # 215 2.5 مل = 25 مل

    تطبيق عامل التخفيف = 25 مل / 32 = 0.781 مل = 781 & # 181 لتر

    تحضير المستضد المخفف: امزج 781 & # 181 لتر من تعليق الفيروس الأصلي مع 24.219 مل من المادة المخففة. PBS هو مخفف مناسب.

    ملحوظة: في هذه الحالة سيكون من الأسهل تحضير 32 مل من مستضد 4HA. سيستخدم هذا 1 مل من التعليق الأصلي المخفف في 31 مل من برنامج تلفزيوني.

    • عينات مصل مذاب في الرفوف
    • ألواح وأغطية ميكروويل على شكل حرف V
    • برنامج تلفزيوني
    • 1 في المائة من خلايا الدم الحمراء المغسولة
    • حوض كاشف V- القاع
    • ماصات ونصائح 25 و # 181L أحادية ومتعددة القنوات
    • ورقة تسجيل لوحة Microwell.
    • مستضد فيروس مرض نيوكاسل مخفف إلى 4 وحدات HA لكل 25 & # 181 لتر
    • المصل الإيجابي والسلبي القياسي

    1. املأ أوراق التسجيل لتسجيل كيفية توزيع العينات في لوحات ميكروويل.

    2. احسب عدد اللوحات المطلوبة ورقم كل لوحة.

    3. الاستغناء عن 25 & # 181L من برنامج تلفزيوني في كل بئر من اللوحات.

    4. رج كل عينة مصل ووزع 25 & # 181 لتر في البئر الأول والأخير (تحكم) لصف من صفيحة ميكروويل.

    5. استخدم ماصة متعددة القنوات لعمل تخفيفات متسلسلة ذات شقين على طول الصف حتى البئر الثاني الأخير من النهاية. آخر بئر هو التحكم في المصل. لا تمييع هذا جيدا. انظر الملحق 4 للحصول على إرشادات حول إجراء التخفيفات التسلسلية ذات شقين.

    6. أضف 25 & # 181L من التخفيف 4HA للمستضد لكل بئر باستثناء آبار التحكم في العمود الأخير. انظر القسم 10 لتحضير وحدات 4HA من المستضد

    7. اضغط برفق على جوانب لوحات ميكروويل لخلط الكواشف. تغطية لوحات بغطاء. اتركه للوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

    8. أضف 25 & # 181L من 1 بالمائة من خلايا الدم الحمراء المغسولة لكل بئر بما في ذلك آبار التحكم في العمود الأخير.

    9. اضغط برفق على جوانب لوحات ميكروويل لخلط الكواشف. قم بتغطية الأطباق بغطاء. دعه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

    10. اقرأ أنماط الاستقرار لكل عينة مصل. اقرأ مصل التحكم جيدًا أولاً ثم اقرأ الأنماط الموجودة في الآبار الأخرى.

    11. سجل النمط الذي لوحظ في كل بئر على ورقة تسجيل لوحة ميكروويل. حدد نقطة النهاية. هذه هي النقطة التي يوجد فيها تثبيط كامل للتراص الدموي.

    12. سجل مستوى الجسم المضاد لكل عينة مصل. يتم التعبير عن هذا كقاعدة سجل 2. للتسهيل ، غالبًا ما يتم تسجيل العيار على أنه فهرس السجل فقط. على سبيل المثال ، يتم تسجيل العيار 2 6 على أنه 6.

    تفسير النتائج

    في الآبار التي توجد بها الأجسام المضادة سيكون هناك تثبيط للتلوث الدموي. ستستقر خلايا الدم الحمراء كزر.

    في الآبار حيث لا توجد أجسام مضادة ، تتراكم خلايا الدم الحمراء.

    نقطة نهاية المعايرة هي البئر الذي يظهر تثبيطًا كاملاً للتراص الدموي. في بعض الأحيان ليس من السهل تحديد ذلك. انظر إلى حجم الزر كمؤشر على درجة تثبيط التراص الدموي. استخدم عنصر التحكم كنقطة مقارنة. كن متسقًا في تحديد نقطة النهاية.

    سيؤدي إنزيم النيورامينيداز الموجود في جسيم الفيروس في النهاية إلى كسر الرابطة بين الفيروس وخلايا الدم الحمراء. هذه العملية تسمى الشطف.

    عندما يحدث الشطف ، لا تتراكم خلايا الدم الحمراء. يقومون بتدوير جانب صفائح الميكروويل على شكل V لتشبه نمط الاستقرار السلبي ، وهو زر ضيق.

    تتم إزالة بعض سلالات فيروس مرض نيوكاسل بسرعة أكبر ويجب قراءة الاختبار قبل حدوث ذلك.

    عادة ما يستغرق الشطف أكثر من 45 دقيقة. التحكم الجيد بالفيروسات وخلايا الدم الحمراء مفيد لتحديد وقت الشطف.

    قد تحتوي بعض الأمصال على مواد أخرى غير الأجسام المضادة التي تثبط الهيماجلوتينين الفيروسي. توصف هذه المواد بأنها مثبطات غير نوعية ونادرًا ما يتم ملاحظتها في مصل الدجاج ومرض نيوكاسل.

    تحتوي بعض مصل الدجاج على مواد تعمل على تلصق خلايا الدم الحمراء للدجاج. يشبه نمط الاستقرار للخلايا المتراصة النمط الذي ينتجه فيروس مرض نيوكاسل. توجد هذه الراصات الطبيعية بتركيز منخفض. سيشير بئر مصل التحكم إلى وجود الراصات الطبيعية.

    امتزاز الراصات الطبيعية

    إذا كانت الراصات الطبيعية موجودة في عينة المصل ، فيمكن إزالتها عن طريق الامتزاز بخلايا الدم الحمراء للدجاج. يمكن بعد ذلك إعادة اختبار المصل في اختبار HI.

    • تعليق 10٪ من خلايا الدم الحمراء للدجاج المغسولة.
    • أنبوب Microfuge (Eppendorf)
    • الماصة الدقيقة ، 200 & # 109 لتر إلى 1000 & # 109 لتر ونصائح
    • تجاهل الدرج
    • أجهزة الطرد المركزي Microfuge
    • عينات المصل

    1. ضع 200 & # 109L من 10 بالمائة من خلايا الدم الحمراء المغسولة في أنبوب microfuge.

    2. جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية.

    3. إزالة المادة طافية.

    4. رج عينة المصل وأزل 500 & # 109 لتر من المصل. قد تحتوي بعض العينات على حجم أقل. استخدم نصيحة جديدة لكل عينة.

    5. أضف المصل إلى خلايا الدم الحمراء في أنبوب الميكروفوج. تخلط بلطف.

    6. الوقوف لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في 4 & # 176 درجة مئوية.

    7. جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية.

    8. قم بإزالة المصل (طاف) على الفور وانقله إلى أنبوب microfuge نظيف.

    9. قم بتخزين الأمصال الممتزجة في 4 & # 176C طوال الليل أو عند -20 & # 176C لفترات أطول.


    أساليب

    بيان الأخلاق

    كانت العينات التي تم الحصول عليها جزءًا من دراسة رصدية أجريت في مركز فريدريك لأبحاث السرطان وتطويره في المعهد الوطني للسرطان (NCI). تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة والموافقة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية NCI (بروتوكول OH99-N046). ClinicalTrials.gov معرف: NCT00339911.

    الفيروسات

    تم تضخيم فيروسات A / California / 07/2009 (H1N1pdm09) و A / Texas / 50/2012 (H3N2) و B / Massachusetts / 2/2012 (International Reagent Resource Manassas، VA) على بيض الدجاج المخصب (Charles River Laboratories ، ويلمنجتون ، ماساتشوستس). تم تحضين البيض عند 37 درجة مئوية مع الرطوبة و 0٪ من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة ، قبل النقل إلى 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة إضافية. تم بعد ذلك جمع سائل Allantoic ، ولفه لأسفل لإزالة الحطام ، ومعايرته في البداية بخلايا الدم الحمراء للديك الرومي (Lampire Biological Laboratories Pipersville ، PA). تجدر الإشارة إلى أن B / Massachusetts / 2/2012 لم يتم تقسيم الأثير قبل إجراء الاختبارات المصلية.

    عينات

    تم جمع عينات الدم من ثلاثين متبرعًا سليمًا سبق تحصينهم ضد فيروسات الأنفلونزا باستخدام ستة أنابيب جمع مختلفة وتم تحضير الأمصال أو البلازما وفقًا لتعليمات الشركات المصنعة. المصل: (1) أنابيب فاصل مصل Vacutainer® (SST) ، (Becton Dickinson and Company (BD) ، Franklin Lakes ، NJ) و (2) مصل Vacutainer® Plus Plastic "مصل أحمر علوي" (RT) أنابيب (BD) . البلازما: (3) Vacutainer® أنابيب K2 ethylenediaminetraacetic acid (EDTA) المطلية بالرش ، 7.2 مجم (BD): (4) أنابيب Vacutainer® Sodium Heparin (بلازما Hep) (BD ، # 36781) تحتوي على هيبارين الصوديوم 95 USP ≥180 USP وحدات / مجم (5) أنابيب Vacutainer® Citrate (Cit plasma) (BD) التي تحتوي على 0.5 مل من محلول حامض الستريك (8.0 جم / لتر) و (6) أنابيب Vacutainer® Glass Blood Collection مع دكستروز حمض السترات (ACD) (BD ، # 34606) تحتوي على سترات الصوديوم (22.0 جم / لتر) وحمض الستريك (8.0 جم / لتر) وسكر العنب (24.5 جم / لتر).

    فحص HAI

    تم فحص العينات بحثًا عن عيارات الأجسام المضادة لإنفلونزا HA مقابل فيروسات A / California / 07/2009 (H1N1pdm09) و A / Texas / 50/2012 (H3N2) و B / Massachusetts / 2/2012 باستخدام اختبار يعتمد على منظمة الصحة العالمية / مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها HAI الفحص [21 ، 23 ، 24]. تم وصف الطرق المحددة المتبعة لإجراء HAI في مكان آخر [21].

    فحص MN

    استند اختبار MN المستخدم على بروتوكول منظمة الصحة العالمية كما هو موصوف سابقًا [25]. باختصار ، فإن وجود الأجسام المضادة في المصل لبروتين هيماجلوتينين سيؤدي إلى تثبيط عدوى خلايا كلاب مادين داربي (MDCK) (مجموعة الثقافة الأمريكية ، CCL-34 Manassas ، VA) بالفيروس. تم إجراء الاختبار على مرحلتين تتكونان من: (1) خطوة تفاعل الجسم المضاد للفيروس ، حيث تم خلط كمية معينة من الفيروس واحتضانها بمصل مخفف تسلسليًا و (2) خطوة تلقيح يتم فيها تلقيح الخليط في نظام مضيف مناسب - خلايا MDCK. يشكل غياب العدوى تفاعلًا إيجابيًا معادلًا ويشير إلى وجود أجسام مضادة معادلة خاصة بالفيروس في المصل. بالنسبة لخطوة تفاعل الجسم المضاد للفيروس ، تم إجراء تخفيف متسلسل مضاعف للمصل / البلازما عبر صفوف صفيحة بئر 96 مسطحة القاع (BD). ثم تمت إضافة الفيروس إلى الآبار (تم تخفيفه إلى جرعة معدية بنسبة 100 50٪ من زراعة الأنسجة ((TCID50)). تم تحضين الألواح بعد ذلك لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم تمت إضافة خلايا MDCK إلى اللوحة عند 2.5 × 10 4 خلايا / بئر. نمت مزارع الخلايا MDCK في Minimal Essential Medium w / Earles salts و L-glutamine (Gibco Langley ، OK) مع 5 ٪ من مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) (Quality Biological Gaithersburg ، MD) و 1 ٪ من البنسلين / الستربتومايسين (P / ق) (كورنينج كورنينج ، نيويورك). بالنسبة للعدوى ، تم تخفيف الفيروس في نفس الوسائط المكملة بـ tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) (Accurate Chemical Westbury ، NY) عند 2 ميكروغرام من وسط TPCK / 1 مل. قبل ELISA ، تم إصلاح الخلايا بنسبة 80 ٪ من الأسيتون. لإجراء ELISA ، تم تخفيف أنفلونزا الفئران A المضادة لـ NP (من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها ، # 90-0026) الجسم المضاد الأولي 1: 5000 في محلول منع (100 مل PBS ، 5 ​​جم حليب مقشود ، و 0.3 مل توين -20). تم غسل الأطباق ثلاث مرات ، واحتضانها بالجسم المضاد الأولي لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. تم تخفيف الجسم المضاد الثانوي ، IgG HRP الماعز المضاد للفأر (Kirkegaard and Perry Laboratories (KPL) ، Gaithersburg ، MD) بنسبة 1: 5000 في عازلة الحجب. تم غسل الأطباق ثلاث مرات ، واحتضانها بالجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تم بعد ذلك غسل الألواح 6 مرات ، وتم تحضينها لمدة 15 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول الركيزة (KPL). تمت إضافة 1 عياري محلول توقف حامض الكبريتيك إلى كل بئر وتمت قراءة الامتصاصية عند 450 نانومتر. تجمع المنهجية بين الاستزراع والكشف عن المستضد بواسطة ELISA وتقدير تقليل المستضد الفيروسي بنسبة 50٪ كنقطة نهاية. يتم تحديد نقاط نهاية الجسم المضاد لتحييد الفيروس لكل عينة مصل / بلازما على النحو التالي: ((متوسط ​​آبار التحكم في الفيروسات) + متوسط ​​آبار التحكم السلبية)) / 2.

    تحليل احصائي

    تم إجراء الإحصائيات باستخدام برنامج GraphPad Prism (GraphPad La Jolla ، كاليفورنيا). تم تقييم الاتفاق ، بما في ذلك التحيز وفاصل الثقة 95٪ ، بين قيم عيار SST المتطابقة وقيم العيار لطرق الجمع الأخرى باستخدام طريقة وصفها بلاند وألتمان [26]. تم رسم العيار المتوسط ​​الهندسي (GMT) لقيمة SST وقيمة طريقة التجميع الأخرى التي تم تقييمها على المحور X. تم رسم فرق عامل التخفيف بين القيمتين على المحور ص. يتم رسم قيم القطع 2 و - 2. تم إجراء اختبار t بالنسبة لتحليل العتبة (TREAT) [27] ، مع تعيين عتبة إلى عاملي تخفيف يعادل أربعة أضعاف أو فرق أكبر في العيار (إما إيجابيًا أو سلبيًا) ، لتقييم الأهمية.


    مناقشة

    هذه هي المراجعة المنهجية الأولى التي تبحث في العلاقة بين عدوى الفيروس المضخم للخلايا الكامنة والاستجابة المناعية للتطعيم ضد الإنفلونزا. منذ ما يقرب من عقدين من الزمن ، ارتبط الفيروس المضخم للخلايا (CMV) بـ "التورم المناعي" [58]. منذ ذلك الحين ، تم إجراء دراسات متعددة على المناعة التي يسببها الفيروس المضخم للخلايا. تستند فكرة أن الفيروس المضخم للخلايا يقلل من قدرة الجهاز المناعي على الاستجابة لمسببات الأمراض الأخرى أو التطعيم [59 ، 60] أساسًا على الدراسات التي تبحث في استجابة لقاح الإنفلونزا [61]. في الواقع ، أفادت دراسات مختلفة عن وجود ارتباط سلبي بين عدوى الفيروس المضخم للخلايا الكامنة واستجابات لقاح الأنفلونزا ، في حين افتقرت دراسات أخرى لإيجاد تأثير الفيروس المضخم للخلايا أو حتى أبلغت عن تأثير إيجابي للفيروس المضخم للخلايا. وبالتالي ، فإن الإجماع على تأثير الفيروس المضخم للخلايا غير موجود. ومع ذلك ، يُفترض عمومًا تأثير الفيروس المضخم للخلايا على استجابة لقاح الأنفلونزا لدى كبار السن [29 ، 61 ، 62]. من خلال المراجعة المنهجية للدراسات المتاحة ودمجها ، نظهر هنا أنه لا يوجد دليل قاطع على تأثير الفيروس المضخم للخلايا على استجابة لقاح الأنفلونزا.

    اخترنا بشكل منهجي دراسات على CMV واستجابات لقاح الأنفلونزا واستخلصنا ثلاثة متغيرات معيارية لنتائج الأجسام المضادة للإنفلونزا. كشفت نسبة متوسط ​​العيار الهندسي (GMR) قبل / بعد التطعيم ضد الإنفلونزا مع (الشكل 4 أ) وبدون (الشكل 4 ب) 95 ٪ CI عدم وجود فرق بين الأفراد الموجودين في الفيروس المضخم للخلايا والأفراد سلبيين من الفيروس المضخم للخلايا (النتيجة أ). من الجدير بالملاحظة أيضًا أنه عندما تم تلخيص العيار المتوسط ​​الهندسي بعد التطعيم فقط (بعد توقيت جرينتش) ، لم يلاحظ أي اتجاه عام لتأثير حالة مصل الفيروس المضخم للخلايا (الشكل التكميلي 5). قمنا في المقام الأول بتقييم GMR وليس ما بعد GMT لأن المشاركين في الدراسات لم يكونوا جميعًا سلبيين الإنفلونزا قبل التطعيم.عادة ما تكون المناعة الموجودة مسبقًا موجودة في حالة التطعيم ضد الأنفلونزا الموسمية. وبالتالي ، فإن التتر بعد التطعيم كنتيجة سوف يبالغ في تقدير استجابة الجسم المضاد للقاح ، وبالتالي ، تكون أقل أهمية. تحليل الانحدار الخطي ، كما تم إجراؤه في بعض الدراسات [42 ، 63] ، هو أفضل طريقة لتصحيح عيار ما قبل التطعيم [46] ، ولكن هذا لا يمكن تحليله على أساس البيانات المستخرجة من الدراسات المشمولة في هذه المراجعة . وهكذا ، مع GMR ، أفضل نتيجة متاحة ، لم يلاحظ أي تأثير للإيجابية المصلية للـ CMV على استجابة لقاح الأنفلونزا.

    كشف التحليل التلوي لمعدل الاستجابة للتطعيم ضد الإنفلونزا (النتيجة ب) (الشكل 5) عن اتجاه صغير (وإن كان غير مهم) بأن المشاركين المصابين بفيروس CMV يستجيبون في كثير من الأحيان للتطعيم ضد الإنفلونزا مقارنة بالأفراد المصابين بفيروس CMV. اقترح تحليل مخطط قمع أن تحيز النشر يكمن على الأرجح وراء هذا الاتجاه في الأدبيات (الشكل 6).

    لسوء الحظ ، لم يكن من الممكن استخلاص نتيجة معيارية للارتباط بين مستوى الأجسام المضادة لـ CMV واستجابة الجسم المضاد للأنفلونزا للتلقيح (النتيجة ج) ، نظرًا لتنوع طرق الدراسات وعدم توفر بيانات أولية. بشكل عام ، أشارت نتائج الارتباط المبلغ عنها (الجدول 4) للدراسات إلى وجود ارتباط سلبي صغير بين مستويات التتر للأجسام المضادة لـ CMV ومستويات الأجسام المضادة للإنفلونزا بعد التطعيم ، مما يشير إلى أن الأفراد الذين عانوا من تفاعلات متعددة للفيروس المضخم للخلايا أثناء الحياة قد يعانون من ضعف استجابات لقاح الأنفلونزا. ومع ذلك ، ينبغي تفسير الارتباطات المجدولة بحذر. تزداد مستويات الأجسام المضادة للفيروس المضخم للخلايا مع تقدم العمر ويعتقد أنها تعكس إعادة تنشيط الفيروس المضخم للخلايا أو إعادة العدوى [7]. لذلك ، قد تكون مستويات الأجسام المضادة المرتفعة المضادة للفيروس المضخم للخلايا مرتبطة بالتطور المناعي المحسن للـ CMV وضعف استجابات لقاح الإنفلونزا [42]. ومع ذلك ، لاحظنا أنه في معظم الدراسات تم تضمين الأفراد السلبيين المصلي للـ CMV في الارتباط بين عيار الأجسام المضادة لـ CMV وتتر الأجسام المضادة للإنفلونزا ، مما قد يؤثر على معامل الارتباط أو أهمية الارتباط. من الأهمية بمكان ، في دراسة واحدة فقط أن مستويات الأجسام المضادة لـ CMV كانت مرتبطة بزيادة أضعاف في عيار الأجسام المضادة للإنفلونزا [47] في جميع الدراسات الأخرى ، وقد ارتبطت مع عيار ما بعد التطعيم ، وبالتالي المبالغة في تقدير استجابة اللقاح. معًا ، هذا يشكك في أهمية الارتباطات الضعيفة المبلغ عنها بين مستويات الأجسام المضادة لـ CMV وعيار الأجسام المضادة للإنفلونزا في التطعيم.

    لتوضيح الجدل في الأدبيات ، قمنا أيضًا بتلخيص الاستنتاجات المبلغ عنها للدراسات المختلفة حول استجابة الجسم المضاد للإنفلونزا (الشكل 3). جمعت مراجعتان سابقتان بشكل مباشر النتائج المختلفة في الأدبيات حول تأثير عدوى الفيروس المضخم للخلايا الكامنة على استجابة الجسم المضاد لتلقيح الأنفلونزا [4 ، 29]. فراسكا وآخرون (2015) وميراني وآخرون. (2017) تشير إلى بعض الدراسات المتضمنة في مراجعتنا المنهجية ووصف تأثير الفيروس المضخم للخلايا على استجابات لقاح الأجسام المضادة للإنفلونزا بأنها مثيرة للجدل أو غامضة. على الرغم من ذلك ، توصل كلا المراجعين إلى استنتاج مفاده أن الفيروس المضخم للخلايا يؤثر على الاستجابة المناعية للتطعيم ضد الإنفلونزا [4 ، 29]. بالإضافة إلى ذلك ، Merani et al. مناقشة الطرق الممكنة للحد من تأثير التورم المناعي على استجابات لقاح الأنفلونزا من خلال استراتيجيات مكافحة الفيروس المضخم للخلايا [29]. يبرز الجدل في الأدبيات وصعوبة مقارنة نتائج الأجسام المضادة للإنفلونزا المختلفة في دراسات مختلفة أن النهج المنهجي ضروري.

    تكمن قوة مراجعتنا في نهجها المنهجي. سمح لنا ذلك بتجميع جميع الأدلة المتاحة (حتى 27 يونيو 2017) حول هذا السؤال بالذات والقضاء على تأثير تحيز النشر المحتمل. بدلاً من مجرد تلخيص الاستنتاجات الواردة في الأدبيات ، قمنا باستخراج البيانات المنشورة في ثلاثة متغيرات نتائج معيارية لاستجابة الجسم المضاد للإنفلونزا ، مفصولة لكل فئة عمرية. علاوة على ذلك ، كلما أمكن ذلك ، قمنا بتقييم معطيات كل دراسة لكل سلالة إنفلونزا. من خلال ذلك ، قمنا بتضمين سجلات متعددة لكل دراسة وليس فقط السجل الذي استند إليه استنتاجات المؤلفين. على حد علمنا ، ظهرت مقالتان جديدتان فقط بحثتا في تأثير عدوى الفيروس المضخم للخلايا الكامنة على استجابة الجسم المضاد للإنفلونزا منذ البحث المنهجي لهذه المراجعة (27 يونيو 2017). Merani et al. (سبتمبر 2017) خلص إلى أنه لا يوجد فرق في الإنفلونزا GMR بين الأفراد المصابين بالفيروس المضخم للخلايا والأفراد المصابين بالفيروس المضخم للخلايا ، في حين أن الأفراد المصابين بفيروس CMV يظهرون ضعف استجابة جرانزيم B الخلوي لتحدي فيروس الأنفلونزا [64]. نشرنا في Van den Berg et al. (يناير 2018) أنه لا يوجد تأثير سلبي لعدوى الفيروس المضخم للخلايا على استجابة الجسم المضاد لسلالة لقاح الأنفلونزا الجديدة لدى البالغين [65]. لن تغير كلتا الدراستين استنتاج هذه المراجعة المنهجية بأنه لا يوجد دليل قاطع على تأثير عدوى الفيروس المضخم للخلايا على استجابة الجسم المضاد لتلقيح الأنفلونزا.

    في هذه المراجعة ، تم التحقق من الارتباط المباشر بين عدوى الفيروس المضخم للخلايا واستجابة لقاح الأنفلونزا. تم افتراض عدة آليات للتأثير السلبي المحتمل ، بناءً على التأثيرات المعروفة لعدوى الفيروس المضخم للخلايا على جهاز المناعة والتأثير المحتمل اللاحق على استجابة لقاح الأنفلونزا [47 ، 58]. تؤدي عدوى الفيروس المضخم للخلايا إلى زيادة مستويات السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، والتي بدورها ترتبط بانخفاض استجابات لقاح الإنفلونزا [29]. وبالمثل ، تؤدي عدوى الفيروس المضخم للخلايا إلى زيادة تمايز الخلايا التائية ، والتي ارتبطت بضعف استجابات التطعيم ضد الإنفلونزا [25 ، 53]. كما تم الإبلاغ عن أن عدوى الفيروس المضخم للخلايا ترتبط بنقص تبديل الخلايا البائية قبل التطعيم ضد الإنفلونزا ، وبالتالي انخفاض استجابات لقاح الأنفلونزا [32]. في المقابل ، De Bourcy et al. اقترح (2017) آلية محتملة للتأثير الإيجابي لـ CMV على استجابة لقاح الأنفلونزا من الأجسام المضادة التي تم الإبلاغ عنها في فورمان وآخرون: استنادًا إلى تحليلات ذخيرة الخلايا B ، ترتبط عدوى الفيروس المضخم للخلايا بخلايا B أكثر نشاطًا بعد التطعيم ضد الإنفلونزا.

    هذه المراجعة المنهجية لها أيضًا بعض القيود. من الناحية المثالية ، تعتمد المراجعة المنهجية على التجارب المعشاة ذات الشواهد (RCT) ، ولكن نظرًا لأسباب أخلاقية وعملية واضحة ، لم يتم إجراء أي تجارب معشاة ذات شواهد لدراسة العلاقة بين عدوى الفيروس المضخم للخلايا واستجابات لقاح الأنفلونزا. وبالتالي ، تم تضمين الدراسات القائمة على الملاحظة فقط. افترضنا أن الأحجام المبلغ عنها لمجموعات الدراسة كانت صحيحة طوال مدة الدراسات ، حتى لو لم يتم الإدلاء ببيان حول عدد المشاركين الذين فقدوا للمتابعة. علاوة على ذلك ، كانت هذه المراجعة المنهجية محدودة بعدد الدراسات التي وُجد أنها مؤهلة للاشتمال ، مما أدى إلى التحليل التلوي لـ 5 دراسات فقط مما أدى إلى 13 سجلاً. القيد الآخر هو التصحيح غير الكامل للإرباك. قمنا بتعديل مستويات الأجسام المضادة قبل التطعيم فقط من خلال فحص GMR وتعديلها جزئيًا حسب العمر من خلال فصل النتائج للشباب وكبار السن. ومع ذلك ، يرتبط العمر باستجابات مختلفة للأجسام المضادة للإنفلونزا ، ليس فقط بسبب التقلص المناعي ، ولكن أيضًا بسبب البصمة المناعية والتعرض المختلف للأنفلونزا خلال العمر. وبالتالي ، قد لا يكون مجرد تعيين الأفراد في فئة عمرية صغيرة وكبيرة كافيًا للتكيف مع العمر كمؤثر. يزداد تعقيد البحث حول تأثير الفيروس المضخم للخلايا على استجابة لقاح الأنفلونزا من قبل مجموعات الدراسة المختلفة ، وسلالات الأنفلونزا المختلفة ، كما تم تلخيصها سابقًا [29]. لا يوجد أساس بيولوجي للتأثير التفاضلي للفيروس المضخم للخلايا على سلالات الأنفلونزا المختلفة ، لكن استجابات لقاح الإنفلونزا تختلف كثيرًا في كل موسم ونوع فرعي [66]. لسوء الحظ ، بيانات من Reed et al. لا يمكن إدراجها في هذه المراجعة. أبلغوا عن وجود ارتباط سلبي بين الإيجابية المصلية للـ CMV والاستجابة للقاح الأجسام المضادة للأنفلونزا في دراسة شملت المواسم المختلفة وسلالات الإنفلونزا. ومع ذلك ، لا يمكن استخراج بياناتهم لتحليل إحدى نتائج هذه المراجعة المنهجية ، حيث تم الإبلاغ عنها فقط كنتيجة لنموذج متعدد العوامل.

    تعد الشمولية في بيانات الأجسام المضادة للإنفلونزا المبلغ عنها في مجال التنكس المناعي للـ CMV ضرورية للكشف عن التأثير المحتمل لـ CMV على استجابة لقاح الأنفلونزا من الجسم المضاد. نوصي بمزيد من الدراسات التي تبحث في تأثير عدوى الفيروس المضخم للخلايا على استجابة لقاح الأجسام المضادة للأنفلونزا لاتباع إرشادات EMA [24] وكحد أدنى ، للإبلاغ دائمًا عن الإنفلونزا قبل توقيت جرينتش وبعد توقيت جرينتش (مع 95٪ CI) و عدد المشاركين لكل مجموعة. من المهم أخذ سلالة الإنفلونزا والموسم في الاعتبار عن طريق قياس العيار والإبلاغ عنه بشكل منفصل لكل سلالة إنفلونزا. معدل الاستجابة مهم أيضًا ، ولكن لا ينبغي أن يكون النتيجة الوحيدة المبلغ عنها. يمكن تعريف معدل الاستجابة بعدة طرق [24] ويعتمد الارتباط بين حماية 40 على البالغين ، مما يجعل استخدامها في كبار السن مشكوكًا فيه [24 ، 67]. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري إجراء تحليل الانحدار لتصحيح المناعة الموجودة مسبقًا. خاصة عندما يكون تأثير عدوى الفيروس المضخم للخلايا على استجابة الجسم المضاد للإنفلونزا صغيرًا ، يوصى بشدة بتصحيح عوامل الإرباك ، مثل العمر (كمتغير مستمر) ، أو المناعة الموجودة مسبقًا ، أو تاريخ التطعيم ، أو استخدام الأدوية أو الأمراض المصاحبة.

    في الختام ، نوضح أنه استنادًا إلى GMR ، والذي يعتبر في تصورنا أفضل نتيجة متاحة ، لا يوجد دليل على تأثير إيجابية الفيروس المضخم للخلايا على استجابة لقاح الأجسام المضادة للإنفلونزا ، وأن تحيز النشر ربما يفسر الاتجاه في الأدبيات القائلة بأن يبدو أن الأفراد المصابين بالفيروس المضخم للخلايا يستجيبون في كثير من الأحيان للقاحات الإنفلونزا أقل من استجابة الأفراد المصابين بفيروس CMV. نشك في أنه في الماضي ، لم يتم نشر العديد من الدراسات لأنها لا تتناسب مع الفكرة السائدة بأن الفيروس المضخم للخلايا يحرض التقلص المناعي. تؤكد مراجعتنا المنهجية أن تأثير عدوى الفيروس المضخم للخلايا على الوظيفة المناعية ذات الصلة سريريًا لدى البشر ، مثل استجابات لقاح الإنفلونزا ، ليس أبيض وأسود كما هو مقترح سابقًا. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات الكبيرة التي تبحث في العلاقة بين مستويات الأجسام المضادة للفيروس المضخم للخلايا واستجابات لقاح الأنفلونزا بقوة كافية لاكتشاف التأثير الصغير المحتمل لعدوى الفيروس المضخم للخلايا ، والتي تؤخذ أيضًا في الاعتبار العوامل المربكة بالإضافة إلى العمر. فقط إذا كان هناك دليل لا لبس فيه على استجابات لقاح الأنفلونزا المصاحبة للـ CMV ، فيمكننا البدء في معالجة ما إذا كانت استجابة لقاح الفيروس المضخم للخلايا لدى كبار السن هي مجرد علامة على التورم المناعي ، أو ما إذا كان الفيروس المضخم للخلايا يسبب النقص المناعي.



تعليقات:

  1. Valdemar

    في رأيي أنها البداية فقط. أقترح عليك محاولة النظر في google.com

  2. Winton

    نعم ... لم يتم تطويره بعد ، لذلك سيتعين علينا الانتظار قليلاً.

  3. Aethelbert

    تعجبني مشاركاتك ، فهي تجعلني أفكر)

  4. Ohcumgache

    الرد الفوري)))

  5. Winfred

    أقترح عليك زيارة الموقع بعدد هائل من المقالات حول الموضوع الذي يثير اهتمامك.

  6. Theron

    إنه مثير للاهتمام. لن تطالب بي ، أين أتعلم المزيد عنها؟

  7. Kovar

    موضوع لا يضاهى ، يسعدني :)



اكتب رسالة