معلومة

هل يمكن تمييز بروتين الإشريكية القولونية الفلورية؟

هل يمكن تمييز بروتين الإشريكية القولونية الفلورية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هي النسبة من العدد الإجمالي للبروتينات في الإشريكية القولونية التي يمكن تمييزها بالفلورية لتصوير PALM / STORM؟


واحدًا تلو الآخر ، من المحتمل أن تقوم بتسمية كل منهم.

إذا كنت تسأل عن عدد البروتينات التي يمكنك تصنيفها مرة واحدة ، فمن المحتمل أن يكون المجهر هو أكبر قيد لديك. للتمييز بين الأنواع المختلفة من البروتينات ، تحتاج إلى ملصقات فلورية مختلفة الألوان (الأصباغ ، البروتينات الفلورية ، إلخ). حتى أرقى المجاهر الفلورية تميل إلى الإعداد لإثارة / تسجيل الملصقات في أقل من 10 أطوال موجية مميزة.

من الناحية العملية ، رأيت فقط تجارب تم فيها تتبع 3 أنواع مختلفة من البروتينات في وقت واحد.


يكشف التحليل الكمي للبروتينات لبكتيريا Escherichia coli المقاومة للمضادات الحيوية والمعرضة للتتراسيكلين عن العديد من العمليات الأيضية والببتيدوغليكان المتأثرة

التتراسيكلين هي من بين المضادات الحيوية الأكثر استخدامًا التي تُعطى لحيوانات المزرعة لعلاج الأمراض والوقاية منها ، مما يساهم في زيادة مقاومة المضادات الحيوية في مسببات الأمراض الحيوانية والبشرية على مستوى العالم. على الرغم من أن آليات مقاومة التتراسيكلين معروفة جيدًا ، إلا أن دور التمثيل الغذائي في التفاعل البكتيري مع إجهاد المضادات الحيوية لا يزال مهمة مهمة ويمكن أن يساهم في فهم استجابة الإجهاد المرتبطة بالتتراسيكلين. في هذه الدراسة ، تم تطبيق البروتينات الكمية الخالية من الملصقات المعتمدة على التعداد الطيفي لدراسة الاستجابة للتتراسيكلين لعزل Escherichia coli EcAmb278 البروتين القابل للذوبان. تم تحديد ما مجموعه 1484 بروتينًا عن طريق قياس الطيف الكتلي عالي الدقة عند عتبة معدل اكتشاف خاطئة تبلغ 1 ٪ ، تم تحديد 108 منها بشكل فريد في ظل غياب التتراسيكلين بينما تم تحديد 126 بشكل فريد في وجود التتراسيكلين. كشفت هذه البروتينات اختلافًا مثيرًا للاهتمام في على سبيل المثال. البروتينات المشاركة في بروتينات جدار الخلية القائمة على الببتيدوغليكان وأيض الطاقة. عند العلاج ، تم تنظيم 12 بروتينًا بشكل تفاضلي أظهر تغيرًا أكثر من ضعفين و p & lt0.05 (تم تصحيح قيمة p للاختبار المتعدد). توفر هذه الدراسة المتكاملة باستخدام البروتينات الكمية الخالية من الملصقات على أساس قياس الطيف الكتلي عالي الدقة لدراسة استجابة المضادات الحيوية التيتراسيكلين في البروتين القابل للذوبان من الإشريكية القولونية المقاومة ، نظرة ثاقبة جديدة للإجهاد المرتبط بالتتراسيكلين.

الدلالة: حفز الافتقار إلى مضادات حيوية جديدة لمكافحة العدوى التي تسببها الكائنات الدقيقة المقاومة للأدوية المتعددة على استخدام المضادات الحيوية القديمة والبحث عن أهداف دوائية جديدة. إن تطور مقاومة المضادات الحيوية أمر معقد ، لكن من المعروف أن النظم الإيكولوجية الزراعية تلعب دورًا مهمًا في اختيار البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. لا يزال التتراسيكلين يستخدم كعوامل صيدلانية نباتية في المحاصيل ، واختيار البكتيريا المقاومة وتغيير بيئة تربة المزرعة. لا يُعرف الكثير عن الاستجابة الأيضية للسكان المقاومين وراثيًا للتعرض للمضادات الحيوية. في الواقع ، حتى الآن لا توجد دراسات كمية لمقاومة التتراسيكلين يتم إجراؤها باستخدام أحدث جيل من مقاييس الطيف الكتلي عالية الدقة مما يسمح بدقة عالية للكتلة في كل من عمليات المسح MS و MS / MS. هنا ، قمنا بالإبلاغ عن التنميط البروتيني للإشريكية القولونية المحمولة في التربة عند إجهاد التتراسيكلين ، بحيث يمكن لهذا المنظور الجديد أن يوفر فهمًا أوسع للاستجابات الأيضية للإشريكية القولونية لمضاد حيوي واسع الاستخدام.

الكلمات الدالة: مقاومة المضادات الحيوية Escherichia coli التمثيل الغذائي بروتيوم التتراسيكلين.


قياس تفاعلات البروتين والبروتين بكميات عالية باستخدام مصفوفات مجال البروتين

توفر المصفوفات الدقيقة للبروتين طريقة فعالة لتحديد وقياس تفاعلات البروتين والبروتين في الإنتاجية العالية. أحد عيوب هذه التقنية هو أن البروتينات تظهر مجموعة واسعة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية وغالبًا ما يكون من الصعب إنتاجها بشكل متجانس. للتحايل على هذه المشكلات ، ركزنا على عائلات مجالات تفاعل البروتين. نحن هنا نقدم بروتوكولات لبناء المصفوفات الدقيقة لمجالات تفاعل البروتين في الآبار الفردية للوحات ميكروتيتر 96 جيدًا ، وللتحديد الكمي لتفاعلات المجال الببتيد في الإنتاجية العالية باستخدام الببتيدات الاصطناعية المسمى الفلورسنت. كأمثلة محددة ، سنصف بناء المصفوفات الدقيقة لكل مجال متماثل 2 (SH2) بشري تقريبًا ومجال ربط الفوسفوتيروزين (PTB) ، بالإضافة إلى المصفوفات الدقيقة لنطاقات PDZ الخاصة بالفأر ، والتي تم إنتاجها جميعًا بشكل مؤتلف في الإشريكية القولونية. بالنسبة للمجالات التي تتوسط تفاعلات عالية التقارب ، مثل مجالات SH2 و PTB ، يمكن قياس ثوابت تفكك التوازن (K (D) s) لروابط الببتيد الخاصة بهم مباشرة على المصفوفات عن طريق الحصول على منحنيات ربط التشبع. بالنسبة لمجالات الربط الأضعف ، مثل مجالات PDZ ، من الأفضل استخدام المصفوفات لتحديد التفاعلات المرشحة ، والتي يتم إعادة اختبارها بعد ذلك وتحديدها بواسطة استقطاب التألق. بشكل عام ، توفر المصفوفات الدقيقة لمجال البروتين القدرة على تحديد وقياس تفاعلات البروتين - الترابطية مع الحد الأدنى من استهلاك العينة. نظرًا لأنه يمكن استجواب عائلات المجال بالكامل في وقت واحد ، فإنها توفر طريقة قوية لتقييم انتقائية الربط على نطاق واسع للبروتينات وتوفر منظورًا غير متحيز حول اتصال شبكات تفاعل البروتين البروتين.

الأرقام

مصفوفات مجال البروتين. مجالات البروتين ...

مصفوفات مجال البروتين. يتم تجميد مجالات البروتين على دعامة صلبة (طبقة سفلية زجاجية) ...

قياس تفاعلات المجال والببتيد بدرجة عالية ...

قياس تفاعلات المجال والببتيد في الإنتاجية العالية باستخدام مصفوفات مجال البروتين. ( أ )…

استخدام مصفوفات مجال البروتين من أجل ...

استخدام مصفوفات مجال البروتين لتحديد وقياس تفاعلات ربط المجال والببتيد. ( أ…

المصفوفات الدقيقة في أطباق ميكروتيتر. (...

المصفوفات الدقيقة في أطباق ميكروتيتر. ( أ ) NanoPrint Microarrayer يكتشف المجالات المؤتلفة على ...


نتائج

الاختلافات الجينية

متوسط ​​هوية النوكليوتيدات للمناطق الجينومية المحاذية لـ REL606 [GenBank: NC_012967] [6] و MG1655 [GenBank: NC_000913] [3] كان & gt99.1٪. حوالي 4 ٪ فقط من إجمالي الجينوم يمثل مناطق محددة بالسلالة ، بما في ذلك العوارض والجزر الجينية التي تم نقلها مؤخرًا على ما يبدو (الشكل 1). ومن المثير للاهتمام أن جينوم B يشفر مجموعة إضافية من الجينات لإفراز النوع الثاني (T2S) واستخدام D- أرابينوز ، ويفتقر إلى مجموعة الجينات للتخليق الحيوي للسوط ونظام إصلاح التصحيح القصير جدًا. وقد لوحظت مجموعات مختلفة من الجينات من أجل إنتاج Qin ، والتخليق الحيوي لمستضد O ، وتقويض المركبات العطرية ، وتخليق عديد السكاريد الدهني (LPS). كما تم الكشف عن مجموعات جينية مختلفة لتقويض المركبات العطرية hpa الكتلة لتحلل 3 و 4-هيدروكسي حمض الخليك في السلالة B و السلطة الفلسطينية العنقودية لتقويض حمض الخليك فينيل في سلالة K-12. وجدنا العديد من الاضطرابات الجينية الخاصة بالسلالة الناتجة عن عمليات الحذف ، أو تغير الإطارات ، أو إدخال عناصر تسلسل الإدراج (IS) التي قد تؤثر على الأنماط الظاهرية للبكتيريا (الجدول S1 في ملف إضافي 1).

مقارنة الجينوم الكامل بكتريا قولونية B REL606 و بكتريا قولونية K-12 MG1655. يشار إلى المناطق الخاصة بالسلالة من خلال الانقطاعات على الخط القطري (يتم تمييز تلك & gt10 كيلو بايت بواسطة الأسهم). تمثل الخطوط الرأسية القصيرة على كل محور تسلسلات الترميز الموجودة على الشريط الأمامي أو العكسي. تظهر المقاطع التي تشغل نفس الموقع على كل جينوم وتقوم بتشفير وظائف مكافئة ولكنها شديدة الاختلاف بالخط العريض. باستثناء تلك المميزة بعلامات النجمة ، تتطابق جميع المناطق الخاصة بالسلالة مع الجزر الجينومية التي تم تحديدها بواسطة الشذوذ الجيني. يتم تمييز القراد كل 500 كيلو بايت.

نمو الخلايا البكتيرية

اثنين بكتريا قولونية سلالات B [6] ، REL606 و BL21 (DE3) ، وسلالتان K-12 [4] ، MG1655 و W3110 ، تمت تربيتها في وسط Luria-Bertani (LB) أو وسط R / 2 (الشكل S1 في ملف إضافي 1) . نمت كلتا المجموعتين من السلالات بشكل مشابه عند استزراعها في وسط معقد ، ومع ذلك ، نمت السلالات B بشكل أسرع من سلالات K12 في الوسط الأدنى. كان الاختلاف بين أنواع السلالات في تراكم المنتجات الثانوية مثل حمض الخليك والفورميك واللاكتيك ضئيلًا عند زراعته في وسط معقد مقارنة بالنمو في أدنى الوسائط.

الاختلافات النسخية

تم تحليل ملفات تعريف النسخ باستخدام عينات مأخوذة في مراحل النمو الأسي والثابت أثناء زراعة REL606 و MG1655 في وسط LB. خلال مرحلة النمو الأسي ، كانت الجينات الأكثر تعبيرًا في السلالة B هي تلك التي تشارك في التكرار أو الترجمة أو نقل النيوكليوتيدات والتمثيل الغذائي ، في حين أن العديد من الجينات المعبر عنها بشكل كبير في سلالة K-12 كانت متورطة في حركة الخلية والنسخ ، نقل الكربوهيدرات ، أو إنتاج الطاقة (الشكل 2 الجدول S2 في ملف إضافي 1). في المرحلة الثابتة ، شاركت العديد من الجينات التي تم التعبير عنها بشكل كبير في السلالة B في النقل والتمثيل الغذائي لمختلف الأحماض الأمينية والكربوهيدرات ، في حين أن الجينات المعبر عنها بشكل كبير في سلالة K-12 لها وظائف مرتبطة بحركة الخلية ، بروتين الوحدة الريبوسومية أو توليد الطاقة.

نسب النسخ من بكتريا قولونية B REL606 إلى K-12 MG1655 في مراحل النمو الأسي (E) والثابتة (S) أثناء النمو في وسط LB. تم وضع الخطوط الداخلية عند ± 1.0 على كلا المحورين للإشارة إلى السجل2- نسب التعبير المحولة. يتم عرض عدد الجينات داخل كل نطاق من نسب التعبير. تم تخصيص فئة وظيفية باستخدام قاعدة بيانات COG [45] لكل جين وتم استخدام الترميز اللوني على النحو التالي: الدوائر الحمراء ، ونقل الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي ، والدوائر الزرقاء لحركة الخلية ، وإنتاج الطاقة وتحويل الدوائر السوداء ، والتكوين الحيوي للخلية مكونات الجدار دوائر فارغة ، وظيفة أخرى أو غير معروفة.

أظهرت العديد من الجينات مستويات تعبير مميزة للغاية في REL606 و MG1655 بغض النظر عن ظروف النمو (أعلى اليمين لـ REL606 واليسار السفلي لـ MG1655 في الشكل 2 ، انظر أيضًا الجدول S2 في الملف الإضافي 1). تضمنت الجينات المعبر عنها بشكل كبير في REL606 تلك الإنزيمات المشفرة للتخليق الحيوي لـ L-arginine (argagdecbhi) والأحماض الأمينية متفرعة السلسلة (ilvGMEDA) ، وحدة فرعية لناقل L-arginine (ArtJ) ، السيتوكروم b562 (cybC) ، الوحدات الفرعية لناقل الهيستيدين ABC (hisPJ) ، السموم الخلوية (هوكيد) ، بورين الغشاء الخارجي (ompF) ، ل-أرجينين ديكاربوكسيلاز (speA) ومثبط انقسام الخلية (سولا). في MG1655 ، تضمنت الجينات المعبر عنها بشكل كبير أولئك المشاركين في الانجذاب الكيميائي (cheZYRWA, صنبور, trg, tsr) ، لون البروتياز (لون) ، ج4-dicarboxylate-sensing هيستيدين كيناز (DCUS) ، المرافقون (clpB, dnaK, groES, htpG, ibpA) ، الوحدة الفرعية الرئيسية من النوع 1 fimbriae (فيما) ، وهو منظم للتخليق الحيوي للسوط (flhC) ، الجلسرين -3 فوسفات-ديهيدروجينيز (glpABCD) ، ديستر فوسفوديستيراز (glpQ) ، ناقل الجلسرين -3 فوسفات (glpT) ، هيدروجيناز 2 (hybCBO) ، بورين الغشاء الخارجي (nmpC, ompA, ompC) ، ونقل الجالاكتيتول والتمثيل الغذائي (جاتيزك).

الاختلافات البروتينية

تحليلات البروتينات للبروتينات الكلية داخل الخلايا ، والغشاء الخارجي ، والبروتينات خارج الخلية للأربعة بكتريا قولونية كشفت السلالات المستزرعة في وسط LB (الشكل S2 في الملف الإضافي 1) عن 18 بقعة بروتينية من سلالات B و 42 بقعة من سلالات K-12 التي أظهرت فرقًا أكثر من ضعفين في الكثافة وتم تمييز البروتينات المقابلة (الجدول S3 في ملف إضافي 1). كانت البروتينات داخل الخلايا التي كانت أكثر وفرة في سلالات B عبارة عن إنزيمات مطلوبة للتخليق الحيوي لبعض الأحماض الأمينية (AspC و ArgCDI و SerC) واستقلاب المالتوز (MalPQ). شملت البروتينات التي كانت أكثر وفرة في سلالات K-12 إنزيمات لنقل واستقلاب الجالاكتيتول (GatYZAB) ، والإنزيمات لتحلل الأحماض الأمينية (TdcE ، TnaA) ، وبروتينات الاستجابة للتوتر (ClpP ، CspE ، YfiD). كانت الملامح البروتينية لسلالتين B متشابهة جدًا ، مثل تلك الموجودة في السلالتين K-12 (الشكل S2A في ملف إضافي 1). تم تصنيع البروتينات المشاركة في الانجذاب الكيميائي (CheY) ومسار تحلل الأحماض الأمينية (TdcF) على مستوى كبير فقط بواسطة MG1655.

كشف تحليل SDS-PAGE لبروتينات الغشاء الخارجي (OMPs) أن سلالات B تعبر عن كميات كبيرة من OmpF ولكن ليس OmpC ، في حين أن سلالات K-12 عبرت عن كل من OmpF و OmpC (الشكل S2B في ملف إضافي 1). كان مستوى تعبير OmpA أعلى في سلالات K-12 منه في سلالات B.

كشف فحص البروتين خارج الخلية (الشكل S2C في ملف إضافي 1) أن سلالات B أطلقت كميات أكبر من البروتين في مرحلة النمو الثابت من سلالات K-12 (الشكل 3). كانت البروتينات التي يتم إطلاقها بشكل شائع من سلالتي B و K-12 عبارة عن بروتينات غشاء خارجي (OmpA و OmpF و OmpX) وبروتينات نقل / ربط (ArgT و ArtI و ArtJ و CusF و GlnH و HisJ و LivJ). تم إطلاق بروتينات الغشاء الخارجي OmpF و YaeT ، ونقل الركيزة المحيطة بالبروتينات الرابطة CusF و RbsB ، وبروتين الصدمة الباردة CspC عند مستويات أعلى من B مقارنة بسلالات K-12 ، بينما تم إطلاق البروتينات المرتبطة بالحركة (FimA ، FlgF ، FlgL ، FliC ، و FliD) والإنفلونزا فقط بواسطة سلالات K-12 (أعلى الشكل 4).

تركيزات البروتين خارج الخلية من بكتريا قولونية فرقة بكتريا قولونية K-12. تم ترسيب البروتينات خارج الخلية من المواد الطافية لكل منها بكتريا قولونية سلالة نمت في LB والحد الأدنى من وسائط R / 2 في مرحلتي النمو الأسي (E) والثابت (S).

مقارنة بين الترانسكريبتومات والبروتينات والظواهر من بكتريا قولونية B REL606 و بكتريا قولونية مستنبت K-12 MG1655 في وسط LB. في الرسوم البيانية المصغرة الفردية ، تشير محاور x إلى مراحل النمو الأسي والثابت ، وتوضح المحاور y نسبة النسخ (على السجل2 مقياس) لكل جين في سلالة B إلى الجين المتماثل في سلالة K-12. تم ترميز أشرطة النسخ باللون الأحمر للتنظيم الأعلى في B والأخضر للتنظيم الأعلى في K-12. تظهر الجينات التي تظهر اختلافات في مستويات النسخ (أو متعدية) بمقدار ≥2- أو 0.5 ضعفًا في المرحلة (الأطوار) الأسية و / أو الثابتة. تكون خلفيات الرسوم البيانية رمادية إذا تم الكشف عن اختلافات في النسخ والترجمة. تظهر أسماء الجينات باللون الأحمر إذا كان المستوى الانتقالي أعلى في السلالة B والأخضر إذا كان أعلى في K-12. يُظهر الجزء العلوي من الشكل بروتينات خارج الخلية مع اختلاف مضاعف بين السلالات في الطور الثابت عند النمو في الوسط الأدنى. تظهر اختلافات كبيرة في نمو الخلايا في مصادر كربون معينة ، والتي تم إثباتها من خلال اختبارات النمط الظاهري الدقيقة ، في الجزء السفلي. منحنيات النمو باللون الأخضر لـ B ، والأحمر لـ K-12 ، والأصفر للمنطقة المتداخلة. توجد الاختصارات في ملف إضافي 1.

الاختلافات الفينومية

كشفت اختبارات المصفوفات الدقيقة للنمط الظاهري (PM) على REL606 و MG1655 عن اختلافات نمطية دراماتيكية بين السلالتين (الشكل S3 في ملف إضافي 1). كانت السلالة B أكثر عرضة من سلالة K-12 لمجموعة متنوعة من الظروف المجهدة التي تسببها الأسمولية أو الأس الهيدروجيني أو التعرض للمركبات المثبطة مثل الساليسيلات والمضادات الحيوية بيتا لاكتام. MG1655 لم ينمو على ثنائي ببتيدات فالين.

إعادة بناء شبكة التمثيل الغذائي

أعدنا بناء نموذج شبكة التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم لـ REL606 من خلال دمج الاختلافات الجينية بين REL606 و MG1655 (الجدول S4 في ملف إضافي 1). بدءًا من نموذج الشبكة الأيضية لـ MG1655 (iAF1260) [15] ، تمت إضافة 29 تفاعلًا خاصًا بـ REL606 و 11 مركبًا خاصًا بـ REL606 ، وتم تقديم 12 لائحة خاصة بـ REL606 ، وتم استبعاد 43 تفاعلات خاصة بـ MG1655. تضمن النموذج الأيضي الناتج لـ REL606 1،369 تفاعلًا أيضيًا و 1،051 مستقلبًا. للتحقق من صحة النموذج ، تم استخدام تحليل توازن التدفق (FBA) للتنبؤ بنمو الخلايا على مصادر الكربون المختلفة ، وتمت مقارنة النتائج مع نتائج اختبارات PM (الجدول S5 في ملف إضافي 1). وافق النموذج نوعيًا على 83.2٪ من نتائج نمو الخلايا التجريبية على ألواح الجسيمات الدقيقة التي تم اختبار استخدام مصدر الكربون فيها.


الآليات والعوامل المؤثرة في تكوين أجسام احتواء البروتين في بكتريا قولونية

طورت جميع الكائنات الحية آلية معقدة للحفاظ على توازن البروتين. يشير توازن البروتين إلى التحكم في التركيز والتشكيل والتفاعلات الرابطة وتوطين البروتينات الفردية التي تشكل البروتين عن طريق إعادة تكييف البيولوجيا الفطرية للخلية. يعد الحفاظ على توازن البروتين أمرًا بالغ الأهمية لوظيفة الخلية والصحة العامة للكائن الحي (Balch et al. ، 2008). إنه يتضمن قطعًا متعددة من الآلات الخلوية للنسخ والترجمة وتعديل البروتين بعد الترجمة والطي والتحلل. تشكيل البروتين IBs في بكتريا قولونية تنتج الخلايا من توازن غير متوازن بين طي البروتين المناسب وتجميعه وتدهوره (الشكل 1). يرتبط بالعديد من العوامل بما في ذلك استقلاب الخلية المضيفة ، وتخليق البروتين ، وآلية التعديل ، وخصائص البروتين المستهدفة ، والظروف البيئية (Strandberg and Enfors ، 1991 Donovan et al. ، 1996).

شكل 1. شبكة توازن البروتين في بكتريا قولونية الخلايا. يشير توازن البروتين إلى التحكم في التركيز والتشكيل والتفاعلات الرابطة وتوطين البروتينات الفردية التي تشكل البروتين عن طريق إعادة تكييف البيولوجيا الفطرية للخلية. إنه يتضمن قطعًا متعددة من الآلات الخلوية للنسخ والترجمة وطي البروتين وتفكك البروتين. تشكيل البروتين IBs في بكتريا قولونية تنتج الخلايا عن توازن غير متوازن بين الطي المناسب للبروتين و / أو التجميع و / أو التدهور. تم إنشاء هذا الرقم بناءً على Balch et al. (2008) وموريموتو وآخرون. (2019) مع بعض التعديلات.

يمكن أن يحدث تكوين الـ IBs من خلال معدل مرتفع من تعبير البروتين ، وهو ذروة خطوط أنابيب إنتاج البروتينات المؤتلفة. غالبًا ما يتم تحقيق هذا الهدف من خلال إنشاء ناقلات تعبير مع مروجين أقوياء (على سبيل المثال ، T7 و لاك المروجين) ، باستخدام البلازميدات ذات أرقام النسخ العالية ، أو تحسين استخدام الكودون ، أو الهندسة بكتريا قولونية سلالات المضيف لنموها السريع. ومع ذلك ، عندما يتجاوز معدل التعبير البروتيني المؤتلف قدرة الخلايا المضيفة على إدارة التعديلات والطي البروتين بعد الترجمة ، فإن البروتين المستهدف سيصبح غير مطوي بشكل متزايد ، ثم يتجمع في IBs حيث أن البقايا الكارهة للماء مدفونة في البروتين الأصلي. مكشوفة على أسطحها. علاوة على ذلك ، لا تستطيع الخلايا المضيفة الحفاظ على التعبير البروتيني بهذه المستويات العالية بسبب إجهاد الخلية وعبء التمثيل الغذائي من زيادة الطلب على الطاقة (Gill et al. ، 2000 Zeng and Yang ، 2019).

يعد الافتقار إلى الآلات المضيفة المناسبة لتعديلات البروتين بعد الترجمة (PTMs) عاملاً آخر يؤدي إلى اختلال البروتين ، خاصة عند التعبير عن البروتينات حقيقية النواة (على سبيل المثال ، البروتينات الثديية والنباتية والفطرية) في بكتريا قولونية. تعتبر PTMs مهمة لتحقيق تشكيل أصلي ونشط بيولوجيًا ، ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على خصائص البروتينات بما في ذلك شحنتها ، ونفورها من الماء ، وإمكانية الوصول إلى المذيبات ، وما إلى ذلك (Walsh ، 2010). من بين العديد من PTMs ، يلعب الارتباط بالجليكوزيل بشكل خاص أدوارًا حاسمة في فرز البروتين والطي والتوطين ومراقبة الجودة في الكائنات حقيقية النواة (Molinari ، 2007). ومع ذلك ، فإن PTM آخر ، تكوين رابطة ثاني كبريتيد ، ضروري أيضًا لإنتاج بروتينات مستقرة. بكتريا قولونية يفتقر إلى مقصورات تحت خلوية مثل الشبكة الإندوبلازمية وجهاز جولجي لتسهيل تكوين الجليكوزيل وتشكيل جسر ثاني كبريتيد. إفراز البروتين المؤتلف للبيئة المؤكسدة لـ بكتريا قولونية أثبتت البيريبلازم نجاحها في تكوين رابطة ثاني كبريتيد في حالات معينة (Baumgarten et al. ، 2018 Zhang et al. ، 2018). ومع ذلك ، فإن كفاءة الإفراز غالبًا ما تكون محدودة بسبب حجم وهيكل البروتين المعني بالإضافة إلى آلية إفراز بكتريا قولونية (تشوي وآخرون ، 2000 تشوي ولي ، 2004).

يخضع تراكم البروتين في أجسام متضمنة أيضًا للسمات الفيزيائية والكيميائية والهيكلية للبروتينات نفسها. تشمل هذه الخصائص الوزن الجزيئي ، وعدد المخلفات المتاخمة للماء ، والمناطق منخفضة التعقيد (Dyson et al. ، 2004 Goh et al. ، 2004). دايسون وآخرون (2004) استخدم نهج التعدين العميق للتحقيق في الارتباط بين هذه العوامل وإمكانية إنتاج بروتينات ثديية وظيفية قابلة للذوبان في بكتريا قولونية. بشكل عام ، تميل البروتينات أحادية المجال ذات الوزن الجزيئي المنخفض إلى إنتاجها في شكل قابل للذوبان مع الاحتفاظ بوظيفة البروتينات. ويرجع ذلك جزئيًا إلى الحاجة إلى عدد أقل من الوسائط القابلة للطي في مسار طي البروتين (Markossian and Kurganov ، 2004). على عكس ذلك ، قد يكون طي البروتينات متعددة المجالات مصحوبًا بوسائط مطوية أو غير متجانسة مما يزيد من احتمالية التجميع. تشكل البروتينات الأخرى المعرضة للتجمع مثل البروتينات المضطربة جوهريًا والبروتينات الغشائية أيضًا تحديات كبيرة في دراسات التعبير البروتيني. إن وجود مناطق مضطربة منخفضة التعقيد وامتدادات من المناطق الكارهة للماء يؤهب هذه البروتينات لتكوين IBs.

تؤثر الظروف البيئية ، مثل درجة حرارة المزرعة ودرجة الحموضة ، أيضًا على تكوين IBs أثناء إنتاج البروتينات المؤتلفة في بكتريا قولونية. تأثير الإجهاد الحراري عند 45 & # x00B0C على إحداث تراكم لوسيفيراس المؤتلف في بكتريا قولونية تم الإبلاغ عنها سابقًا (Winkler et al. ، 2010) ، بالإضافة إلى قدرة ظروف الأس الهيدروجيني الفسيولوجية (pH = 7.5) على الاستفادة من تأثير مفيد على التعبير غير المتجانس عن Boophilus microplus سفينغوميليناز- D في بكتريا قولونية (Castellanos-Mendoza et al. ، 2014). نظرًا للمنطق أعلاه ، فإن ظروف الثقافة المخصصة هي نهج يستخدم غالبًا كحل لتقليل تكوين IBs للبروتينات المؤتلفة في بكتريا قولونية.

في جوهرها ، فإن عملية التجميع مدفوعة بتفاعلات كارهة للماء التي تعمل كإجراءات مضادة تحمي امتدادات البروتين الكارهة للماء من البيئة المائية المحيطة (Winkler et al. ، 2010). قد تعزز الركام المتكون حديثًا التنوي من خلال العمل كبذور لتجميع البروتينات الأخرى المتشابهة للغاية (موريل وآخرون ، 2008). من المرجح أن تحدث هذه العملية في بدائيات النوى مثل بكتريا قولونية، والتي لا تمتلك آلية تعديل البروتين المناسبة. تعزز المستويات العالية من التعبير المقترن بنقص آلية التعديل سوء التشكيل ، مما يؤدي إلى التعرض غير المقصود للمخلفات الكارهة للماء على سطح البروتين (Markossian and Kurganov، 2004 Schramm et al.، 2019).


أساليب

علم النسخ وتحليل البيانات البروتينية.

HTSeq. تم استخدام (32) و DESeq2 (33) للحصول على تعدادات طبيعية وللتعرف على الجينات المعبر عنها تفاضليًا. ال ص تم تجميع القيم باستخدام طريقة Stouffer (34) وتعديلها للاختبار المتعدد باستخدام تصحيح Benjamini-Hochberg (35). تم تحويل بيانات RNA-Seq إلى ض عشرات بعد تسجيل الدخول2 التحول وشمل النمو في 3 مصادر كربون (sbrg.ucsd.edu/Downloads/SupplementalData) ، و 8 نقاط نهاية ALE على متوسط ​​الحد الأدنى من الجلوكوز (16). تم إجراء مقارنات البروتينات بشكل زوجي بين MG1655 وأربع سلالات من BW25113 (WT ، ΔpKأ، ΔpKأΔarcA ، ΔarcA). ارى الملحق SI, طرق SI للتفاصيل.

التحليل الإحصائي ومتعدد المتغيرات.

تم استخدام انتشار التقارب (36) لتجميع ملفات تعريف تدفق الترجمة المحاكاة (37). تم إجراء تحليل التخصيب باستخدام الهندسة الفوقية ص القيم ، مع تصحيح Benjamini-Hochberg للاختبار المتعدد (29). تم إجراء الاختبارات الإحصائية للاختلاف بين معاملات ارتباط بيرسون باستخدام طريقة تحويل Z فيشر (38) وطريقة فاصل الثقة Zou (39). تم إجراء الاختبار الإحصائي للاختلاف بين ارتباطات رتبة سبيرمان باستخدام اختبار التقليب مع 10000 تبديل.

تحليل ب. أفيديكولا و M. genitalium.

قمنا بتغيير عدد الشروط التي كان مطلوبًا من الجين التعبير عنها في عمليات المحاكاة ME لإضافتها إلى النواة (أي عمليات القطع التي تتراوح من 1 إلى 333 شرطًا). لكل قطع ، قمنا بحساب جزء التنبؤات الإيجابية الحقيقية (مجموعة الجينات المعبر عنها الموجودة في ب. أفيديكولا) والتنبؤات الإيجابية الخاطئة (الجينات المعبر عنها غير موجودة في ب. أفيديكولا). ثم قمنا بحساب AUC. ارى الملحق SI, طرق SI للتفاصيل.

محاكاة ME عبر 333 ظروف نمو وتعريف البروتين الأساسي.

تم إجراء عمليات المحاكاة باستخدام iOL1554-ME ، نموذج مقياس الجينوم لـ بكتريا قولونية K-12 MG1655 التمثيل الغذائي والتعبير (13) ، لوسط أساسي من M9 الحد الأدنى من المتوسط ​​+ الجلوكوز. في كل محاكاة ، تم تغيير المصدر الرئيسي للكربون أو النيتروجين أو الفوسفات أو الكبريتات في الوسط ، مع ثبات مصادر المغذيات الثلاثة الأخرى. في المجموع ، تم إجراء 333 محاكاة ، مقابل 180 مصدرًا مختلفًا للكربون ، و 49 مصدرًا للفوسفور ، و 93 مصدرًا للنيتروجين ، و 11 مصدرًا للكبريت. قمنا بتحليل الاتجاه في حجم البروتين الأساسي كدالة لعدد الشروط المطلوبة للتعبير (تدفق ترجمة الجين & gt 0) (الملحق SI، الشكل S11). لتجنب عتبة وسيطة غامضة ، استخدمنا التعريف الأكثر صرامة للبروتين الأساسي: الجين المعبر عنه في جميع الحالات البالغ عددها 333 حالة.

تجارب تسلسل Tn-seq وتحليل البيانات.

تعتبر الجينات ضرورية إذا تم تعديلها ص كانت القيمة & lt0.05 والسجل2 كانت نسبة عدد القراءات (المقيسة) التي تم قياسها أكثر من المتوقع للقراءات لكل جين أقل من الحد الأمثل كما هو متوقع من قبل ESSENTIALS (40). ارى الملحق SI, طرق SI للتفاصيل.


خدمة الأجسام المضادة المسمى الفلورسنت

مع سنوات من الخبرة في الاقتران ، Biolabs الإبداعية تقدم العديد من خدمات الأجسام المضادة المسمى الفلورسنت المخصص. تتوفر مجموعة واسعة من الملصقات ، بما في ذلك الأصباغ الفلورية ، والبروتينات النباتية والإنزيمات ، وبعض المواد الكيميائية الخاصة بوضع العلامات. يمكن الحصول على العديد من خدمات البحث العلمي من Creative Biolabs ، مثل خدمة الجسم المضاد avi-tag biotinylated وخدمة قطع fab abzyme ومنتجات الأجسام المضادة للكائنات النموذجية ، والتي يمكن استخدامها للأغراض البحثية والتجارية.

المترافق متاح

تقدم Creative Biolabs مجموعة متنوعة من ملصقات الفلورسنت التي يمكن ربطها بالأجسام المضادة الأولية لاستخدامها في تطبيقات الكشف والفرز والفحص المجهري. تشمل العينات المقبولة التي سيتم تصنيفها الجسم المضاد IgG ، والبروتين الجزيئي ، وجزيء صغير متعدد الببتيد ، ومركب جزيئي صغير ، إلخ.

  • علامة الإنزيم
  • الفوسفاتيز القلوي (AP / ALP)
  • بيروكسيداز فجل الحصان (HRP)
  • الفلورسين التقليدية
  • إيزوثيوسيانات فلوريسئين (FITC)
  • رودامين ب (RBITC)
  • سلسلة Cy من فلوريسئين
  • سلفو سيانين 3 (Cy3)
  • سلفو سيانين (Cy5)
  • سلفو سيانين 5.5 (Cy5.5)
  • سلفو سيانين 7 (Cy7)
  • سلسلة اليكسا فلور من الفلورسين
  • Alexa Fluor 350 (AF350)
  • Alexa Fluor 488 (AF488)
  • اليكسا فلور 555 (AF555)
  • Alexa Fluor 594 (AF594)
  • Alexa Fluor 647 (AF647)
  • سلسلة ATTO من الفلورسين
  • ATTO 550
  • ATTO 488
  • ATTO 665
  • البروتين الفلوري
  • فيكويريثرين (PE)
  • ألوفيكوسيانين (APC)
  • تسمية مزدوجة الفلورسنت
  • PE-Cy3
  • PE-Cy5
  • PE-Cy5.5
  • PE-Cy7
  • علامة الذهب الغروية
  • شارك Au

سير عمل خدمتنا

تقدم Creative Biolabs مجموعة واسعة من التألق المسمى مما يسمح للباحثين بالاختيار. تتيح تقنية وضع العلامات الفلورية وضع علامات سريعة على الأجسام المضادة غير التساهمية.

الميزات في Creative Biolabs

تُستخدم الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية على نطاق واسع في الأبحاث الطبية الحيوية لاكتشاف المستضدات ، وهي أدوات أساسية في التشخيص المناعي والبحث العلمي الآخر. طورت شركة Creative Biolabs كواشف مترافقة للأجسام المضادة وفقًا لمتطلبات المستهلكين.


البحوث الأصلية المادة

بو تشوين هسو 1 & # x2020 ، Chien-Sheng Chen 2 & # x2020 ، شوينغ وانغ 3،4،5،6 & # x2020 ، ماسايوكي هاشيموتو 1،4،5 ، ون تشون هوانغ 1،4 و تشينغ هاو تنغ 1،4،5 *
  • 1 معهد الطب الجزيئي ، كلية الطب ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان ، تايوان
  • 2 قسم سلامة الأغذية / النظافة وإدارة المخاطر ، كلية الطب ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان ، تايوان
  • 3 قسم الأحياء الدقيقة والمناعة ، كلية الطب ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان ، تايوان
  • 4 معهد العلوم الطبية الأساسية ، كلية الطب ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان ، تايوان
  • 5 مركز أبحاث الأمراض المعدية والإشارات ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان ، تايوان
  • 6 قسم التكنولوجيا الحيوية وعلوم الصناعة الحيوية ، كلية العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الحيوية ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان ، تايوان

يلعب البروتياز الميكروبي أدوارًا محورية في العديد من جوانب العمليات الفسيولوجية البكتيرية. نظرًا لأن البروتياز يمارس وظيفته البيولوجية عن طريق تنظيم ركائزه بروتينيًا ، فإن تحديد وتوصيف الركائز الفسيولوجية للبروتياز يعزز فهمنا للأدوار البيولوجية للبروتياز. Prc (المعروف أيضًا باسم Tsp) هو ملف الإشريكية القولونية يعتقد أن البروتياز periplasmic لا غنى عنه ل بكتريا قولونية للبقاء على قيد الحياة تحت الأسمولية المنخفضة عند 42 & # x00B0C. يساهم تراكم ركيزة Prc MepS بسبب نقص Prc في عيب النمو المشروط. لأن منع تراكم MepS استعاد جزئيًا نمو Prc النقص بكتريا قولونية، افترضنا أن ركائز Prc الأخرى غير المحددة تتراكم داخل الخلايا بسبب نقص Prc وتساهم في عيب النمو الشرطي. لتحديد ركائز غير مكتشفة سابقًا ، 85 بكتريا قولونية تم التعرف على البروتينات القادرة على التفاعل الجسدي مع Prc باستخدام بكتريا قولونية صفائف البروتين. تم عرض عشرة بروتينات لتكون قابلة للانقسام بواسطة Prc في المختبر. من بين هؤلاء المرشحين ، تمكنت MltG من التفاعل مع Prc في بكتريا قولونية. نظمت Prc المستوى داخل الخلايا لـ MltG ، مما يشير إلى أن MltG عبارة عن ركيزة فسيولوجية لـ Prc. تسبب نقص Prc في تراكم MltG في البكتيريا. منع تراكم MltG عن طريق حذف mltG استعاد جزئيًا نمو نقص Prc بكتريا قولونية. بالإضافة إلى ذلك ، Prc ناقص بكتريا قولونية مع تعبير MltG و MepS المحظور أظهر مستويات نمو أعلى من تلك التي تم حظر تعبير MltG أو MepS فقط تحت الأسمولية المنخفضة عند 42 & # x00B0C ، مما يشير إلى أن هذه الركائز المتراكمة ساهمت بشكل إضافي في عيب النمو المشروط. MltG هو عبارة عن transglycosylase lytic يشارك في التكوّن الحيوي للببتيدوغليكان (PG). بالإضافة إلى MltG ، فإن ركائز Prc الفسيولوجية التي تم تحديدها مسبقًا MepS و PBP3 متورطة في التكوُّن الحيوي لـ PG ، مما يشير إلى دور محتمل لـ Prc في تنظيم التكوين الحيوي لـ PG.


ملخص

يتم تكييف التنميط الحراري للبروتينات الإشريكية القولونية لفحص الثبات الحراري للبروتينات في الجسم الحي، مما أسفر عن رؤى حول بنية البروتين المعقدة ، ونشاط البروتين ، وحالة التمثيل الغذائي الخلوي ، والمشاركة المستهدفة للعقار داخل الخلايا ، وتأثيرات الدواء في مجرى النهر.

  • ال بكتريا قولونية البروتين هو أكثر ثباتًا للحرارة من الإنسان ، مع ثبات الحرارة للبروتين اعتمادًا على موقع البروتين دون الخلوي.
  • تذوب الوحدات الفرعية من مجمعات البروتين الموجودة في حجرة واحدة بشكل مشابه ، بينما غالبًا ما تذوب وحدات البروتين التي تمتد عبر الأجزاء التي تغطيها وحداتها الفرعية بطريقة حكيمة في الموقع.
  • أدت الضربة القاضية لـ tolC إلى زعزعة الاستقرار الحراري لشركائها في التفاعل ، وتقليل تنظيم بورين رئيسي (OmpF) ، وزيادة الإجهاد المحيطي.

هل يمكن تمييز بروتين الإشريكية القولونية الفلورية؟ - مادة الاحياء

الأغشية البيولوجية ضرورية لبقاء الخلية. تعتمد خصائصها الوظيفية بشدة على محتواها من البروتين ، والذي يتكون من غشاء (متكامل) وبروتينات غشائية مرتبطة طرفيًا. تتوسط كل من بروتينات الغشاء الداخلي المحيطي والتكامل في عدد كبير من العمليات البيولوجية. في حين أن بروتينات الغشاء لها امتدادات مميزة كارهة للماء ويمكن التنبؤ بها باستخدام مناهج المعلوماتية الحيوية ، فإن بروتينات الغشاء الداخلي المحيطي محبة للماء ، وتوجد في حالة توازن مع برك قابلة للذوبان ، ولا تحمل إشارات استهداف غشاء يمكن تمييزها. حددنا تجريبيا بروتين الغشاء الداخلي المحيطي السيتوبلازمي للكائن الحي النموذجي الإشريكية القولونية باستخدام نهج متعدد التخصصات. Initially, we extensively re-annotated the theoretical proteome regarding subcellular localization using literature searches, manual curation, and multi-combinatorial bioinformatics searches of the available databases. Next we used sequential biochemical fractionations coupled to direct identification of individual proteins and protein complexes using high resolution mass spectrometry. We determined that the proposed cytoplasmic peripheral inner membrane proteome occupies a previously unsuspected ∼19% of the basic بكتريا قولونية BL21(DE3) proteome, and the detected peripheral inner membrane proteome occupies ∼25% of the estimated expressed proteome of this cell grown in LB medium to mid-log phase. This value might increase when fleeting interactions, not studied here, are taken into account. Several proteins previously regarded as exclusively cytoplasmic bind membranes avidly. Many of these proteins are organized in functional or/and structural oligomeric complexes that bind to the membrane with multiple interactions. Identified proteins cover the full spectrum of biological activities, and more than half of them are essential. Our data suggest that the cytoplasmic proteome displays remarkably dynamic and extensive communication with biological membrane surfaces that we are only beginning to decipher.

The research leading to these results has received funding from the European Commission (EC) through Seventh Framework Programme Agreement No. 229823 Capacities-FP7-REGPOT-2008-1/project “ProFI” the project “IRAKLITOS II - University of Crete” of the Operational Programme for Education and Lifelong Learning 2007–2013 (E.P.E.D.V.M.) of the NSRF (2007–2013), which is co-funded by the European Union (European Social Fund) the Onassis foundation pre-doctoral program the Operational Programme “Competitiveness and Entrepreneuriship” (OPCE II - EPAN II) - National Strategic Reference Framework (NSRF 2007–2013), Grant No. 09SYN-13-705 and an Excellence grant (Grant No. 1473) from the General Secretariat of Research (to A.E.).

Papanastasiou, M., Orfanoudaki, G., Koukaki, M., Kountourakis, N., Tsolis, K., Sardis, M. F., Aivaliotis, M., Karamanou, S., Economou, A., manuscript in preparation.


شاهد الفيديو: Microbiology - Bacteriology - Antimicrobial Chemotherapy. د. سعد عزيز (شهر نوفمبر 2022).