معلومة

كيف يمكن تمييز عائلة البروتين في جزيرة الجينوم المفترضة؟

كيف يمكن تمييز عائلة البروتين في جزيرة الجينوم المفترضة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قمنا بتسلسل جينوم 200 سلالة بكتيرية تنتمي إلى نفس النوع ، أحد مسببات الأمراض البكتيرية للخنازير. في عمل سابق ، لوحظ وجود عائلة بروتينية من المواد اللاصقة في بعض هذه السلالات. كل سلالة لها نسخ متعددة مفصولة في جينومها. وقد لوحظت اختلافات وراثية بين تسلسل الحمض النووي في السلالات المختلفة. نظرًا لوجود بعض العناصر الجينية المتنقلة بالقرب من هذه الجينات ، فمن المحتمل أنها تلعب دورًا في التطور الجزيئي لعائلة البروتين هذه.

كيف يمكنني إضافة أدلة إضافية على أن هذه جزيرة جينومية مفترضة؟

سيكون موضع تقدير أيضا بعض المراجع.

شكرا

تحديث: لكل سلالة ، فكرت في استخراج المنطقة الجينومية حيث توجد هذه الجينات ، ربما 8 كيلو بايت صعودًا وهبوطًا من الجين. بعد ذلك ، قم بتشغيل مجموعة من الأدوات لمحاولة التنبؤ ببعض العناصر المرتبطة بالجزيرة. ومع ذلك ، بافتراض أن هذه الأدوات "القائمة على التسلسل" تحتاج إلى تسلسل الجينوم بأكمله ، فهل يمكنني تشغيلها باستخدام تسلسل الجينوم الكامل ثم التركيز على مناطق جينومية معينة محددة؟


توصيف البروتين غير الإنشائي NS4 لفيروس مرض الخيول الأفريقية

مرض الخيول الأفريقية هو مرض خطير يسببه فيروس أوربيفيروس داء الخيول الأفريقية (AHSV). يحتوي الفيروس على عشرة أجزاء من جينوم RNA مزدوج الشريطة ترميز سبعة بروتينات هيكلية وثلاثة بروتينات غير هيكلية. في الآونة الأخيرة ، تم التنبؤ ببروتين إضافي ليتم تشفيره بواسطة شريحة الجينوم 9 (Seg-9) ، والتي تشفر أيضًا VP6 ، لمعظم الفيروسات المدارية. تم تأكيد ذلك منذ ذلك الحين في فيروس اللسان الأزرق وفيروس جزيرة جريت آيلاند ، وأطلق على البروتين غير الهيكلي اسم NS4. في هذه الدراسة، في السيليكو كشف تحليل تسلسل AHSV Seg-9 عن وجود نوعين رئيسيين من AHSV NS4 ، NS4-I و NS4-II ، بأطوال مختلفة وتسلسلات الأحماض الأمينية. كانت تسلسلات تشفير AHSV NS4 في إطار قراءة +1 بالنسبة إلى إطار VP6. تم التعبير عن كلا النوعين من AHSV NS4 في خلايا الثدييات المستزرعة ، بأحجام قريبة من المتوقع 17-20 كيلو دالتون. كشف الفحص المجهري الفلوري لهذه الخلايا عن توزيع حشوي ونووي مزدوج ، ولكن ليس نوويًا ، كان مشابهًا جدًا لـ NS4-I و NS4-II. أظهرت الكيمياء النسيجية المناعية على أنسجة القلب والطحال والرئة من الخيول المصابة بـ AHSV أن NS4 يحدث في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة والبالعات أحادية النواة في جميع هذه الأنسجة ، مما يؤدي إلى تحديد موقع كل من السيتوبلازم والنواة. ومن المثير للاهتمام ، أن NS4 تم اكتشافه أيضًا في خلايا شبيهة بالبلاعم على شكل نجمي مع عمليات سيتوبلازمية طويلة في اللب الأحمر للطحال. أخيرًا ، أظهرت فحوصات حماية الحمض النووي باستخدام AHSV NS4 المؤتلف المعبر عنه بكتيريًا أن كلا النوعين من AHSV NS4 يربط dsDNA ، ولكن ليس dsRNA. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد الوظيفة الدقيقة لـ AHSV NS4 أثناء تكاثر الفيروس.

الاقتباس: Zwart L ، Potgieter CA ، Clift SJ ، van Staden V (2015) يميز البروتين غير الإنشائي NS4 لفيروس مرض الحصان الأفريقي. بلوس ون 10 (4): e0124281. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0124281

محرر أكاديمي: جميل سعد ، جامعة ألاباما في برمنغهام ، الولايات المتحدة

تم الاستلام: 15 يناير 2015 وافقت: 12 مارس 2015 نشرت: 27 أبريل 2015

حقوق النشر: © 2015 Zwart et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط ذكر المؤلف الأصلي والمصدر

توافر البيانات: تم إيداع جميع التسلسلات الجديدة في GenBank ، تحت أرقام الانضمام التالية: KF859992 ، KP009629 ، KP009717 ، KF860003 ، KP009637 ، KM886360 ، KP009647 ، KP009767 ، KM609473 ، KP009659 ، KP009777 ، KM886352 ، KP008698900 ، KP009757 ، KF860034 ، KP009699 ، KF860044 ، KP009707. يمكن الوصول إلى جميع التسلسلات المنشورة مسبقًا باستخدام أرقام التعريف التالية: AM883170 ، FJ196590 ، U19881 ، NC006019.

التمويل: قدمت Deltamune (Pty) Ltd الدعم في شكل رواتب للمؤلفين (CAP) ، ولكن لم يكن لها أي دور إضافي في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة. الأدوار المحددة لهؤلاء المؤلفين موضحة في قسم مساهمات المؤلفين.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.


خلفية

الديدان المفلطحة الطفيلية مسؤولة عن جزء كبير من عبء الدودة العالمي وهي طفيليات منتشرة في كل مكان بشكل فعال لجميع أنواع الفقاريات والعديد من مجموعات اللافقاريات. على مدار العقد الماضي ، تم إنتاج مرجع ومسودة جينومات لأنواع دودة الشريط والصدفة الرئيسية بما في ذلك العوامل المسببة لداء البلهارسيات وداء الكيسات المذنبة العصبية وداء المشوكات العدارية والسنخية [1،2،3،4،5،6]. بعد ذلك ، تم نشر التجميعات المحسّنة والتعليقات التوضيحية [7] و / أو نشرها للجمهور ، كما هو الحال بالنسبة لتسلسلات الحمض النووي الريبي من عدد متزايد من الدراسات النسخية ، وتنميط التعبير الجيني على مستوى الجينوم لمراحل دورة الحياة المختلفة ، ومقصورات الخلايا ، والظروف التجريبية [8،9،10،11]. في الآونة الأخيرة ، تم توسيع تنوع مسودة الجينوم لكل من الديدان المفلطحة والديدان الطفيلية ، مما يتيح حصرًا أوسع لعائلات الجينات الخاصة بالديدان الطفيلية وتحليلات مقارنة أكثر إفادة [12]. على الرغم من العدد المتزايد لمثل هذه الموارد للديدان الطفيلية ، إلا أنه لا يُعرف سوى القليل عن بنيتها الجينية.

القوارض / الخنفساء غشاء البكارة الأنواع هي من بين النماذج المختبرية الرئيسية للديدان الشريطية لأنها تتيح الوصول إلى جميع مراحل دورة حياتها المعقدة. مشروع جينوم لسلالة المختبر من الدودة الشريطية في القناة الصفراوية للفأر [13] ، ورم غشاء البكارة، تم نشره في 2013 [6] وتم تحديثه ببيانات إضافية وأعيد إصداره كإصدار 2 على WormBase ParaSite (WBP) [11] في عام 2015 (تفاصيل التجميع v2 موصوفة في [8]). هنا ، نقدم الإصدار الرئيسي الثالث من الجينوم: تحديث جودة مرجعي للتجميع الذي تم إتاحته للجمهور مع الإصدار الثاني عشر من WBP (ديسمبر 2018). تم تجميع الجينوم في كروموسومات كاملة ، بناءً على إضافة بيانات تسلسل قراءة طويلة إلى بيانات القراءة القصيرة السابقة متبوعة بمحاذاة مكثفة ، ومراجعة يدوية ، وإعادة تجميع مسترشدة ببيانات رسم الخرائط الضوئية. مع هذا الإصدار ، H. microstoma يمثل الجينوم الأكثر تجميعًا بالكامل من superphylum lophotrochozoan.


العنوان: يشارك بروتين عائلة LacI GlyR3 في تنظيم أوبرا celC و manB في Clostridium thermocellum

في هذه الورقة ، نوضح أن بروتين GlyR3 يتوسط في تنظيم manB. نحدد أولاً مواقع ربط GlyR3 المفترضة داخل مناطق الترميز manB و celT فقط أو في أعلى المنبع. باستخدام مقايسة تحول الحركة الكهربي (EMSA) ، قررنا أن هناك حاجة إلى تركيز أعلى من GlyR3 للربط الفعال بموقع manB المفترض مقارنة بموقع celC. لا يرتبط موقع celT المفترض ولا الحمض النووي العشوائي بشكل كبير GlyR3. بينما يتداخل laminaribiose مع ارتباط GlyR3 بموقع ربط celC ، لم يتأثر الارتباط بموقع manB. في وجود laminaribiose ، يزداد النسخ في الجسم الحي لمجموعة الجينات celC-glyR3-licA ، بينما يتم قمع تعبير manB ، مقارنةً بغياب laminaribiose ، بما يتوافق مع نتائج EMSA. أظهر اختبار النسخ في المختبر أن تفاعلات GlyR3 و laminaribiose كانت مسؤولة عن الأنماط المرصودة للنسخ في الجسم الحي.


نتائج ومناقشة

التكملة الجينية

هيكل الجينوم والميزات العامة

يتكون جينوم EAEC 042 من كروموسوم دائري يبلغ 5،241،977 نقطة أساس و بلازميد pAA يبلغ 113،346 نقطة أساس. يتم عرض السمات العامة لجينوم EAEC 042 في الجدول 1. تم تحديد ما مجموعه 4886 جينًا في الكروموسوم ، 100 (2 & # x00025) منها ليس لها أي تطابق في قاعدة البيانات ، 556 (11 & # x00025) هي بروتينات افتراضية محفوظة ، بدون وظيفة معروفة و 481 فقط (10 & # x00025) ) تبدو وكأنها عناصر متحركة مثل الجمل المتكاملة أو المنقولات أو الملتهمة ذات الصلة. لقد حددنا 78 جزيرة جينومية في EAEC 042 موزعة / ممثلة بشكل تفاضلي و / أو تباعد التسلسل بين التسلسل بكتريا قولونية الجينوم ، هذه الجزر هي مناطق الاختلاف المعينة (ROD) (الشكل 1 الجدول S1). الحجم الكلي لهذه RODs هو 1.26 ميغا بايت (24 & # x00025 من الكروموسوم). تقوم RODs بتشفير محددات الفوعة ، والبروتينات الأيضية ، والبروتينات التي ليس لها وظائف واضحة وعناصر متحركة مثل Prophage و transposon. ينقول اقتران Tn2411 (داخل ROD66) يشبه إلى حد كبير Tn21 ويحمل مجموعة متنوعة من الجينات المشفرة لمقاومة المضادات الحيوية (الشكل 2). تمت مناقشة الأهمية الوظيفية لهذه الجينات أدناه. تم تحديد تسع مناطق نفاذية ، تم تحديدها 042p1 & # x02013042p9 ، في جينوم EAEC 042 (الجدول 2). أربعة من العوارض كانت ذات طبيعة لامبودية (042p2 و 042p3 و 042p4 و 042p6) وكانت متشابهة إلى حد كبير مع بعضها البعض ولكن يبدو أن ثلاثة فقط (042p1 و 042p3 و 042p6) تحمل جينات البضائع (انظر الشكل S1 والملف S1). تتم مناقشة محتوى ROD المتبقي بالتفصيل لاحقًا.

من الخارج إلى الداخل ، تحدد الدائرة الخارجية 1 موضع مناطق الاختلاف (المذكورة في النص) بما في ذلك prophage (وردي فاتح) أوبيرونات خمسية (أخضر داكن) وكذلك المناطق الموجودة بشكل مختلف في أخرى بكتريا قولونية السلالات: أزرق (موجود في 0157: H7 & # x00026 غائب / متشعب في UPEC CFT073) أخضر فاتح (موجود في 0157: H7 غائب / متباعد في UPEC CFT073). تظهر الدائرة 2 الحجم في bps. تُظهر الدائرتان 3 و 4 موضع أقراص CDS المكتوبة في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة ، على التوالي (بالنسبة لرموز الألوان انظر أدناه) ، تُظهر الدائرة من 4 إلى 13 موضع بكتريا قولونية جينات O42 التي لها تقويم العظام (عن طريق تحليل FASTA المتبادل) في غيرها بكتريا قولونية السلالات (انظر الطرق): Sakai (0157: H7 أحمر) ، UT189 (UPEC أزرق غامق) ، CFT073 (UPEC أزرق فاتح) ، 536 (برتقالي UPEC) ، APEC 01 (APEC وردي غامق) ، E2348 / 69 (أسود EPEC) ، <"type": "entrez-nucleotide"، "attrs": <"text": "H10407"، "term_id": "875229"، "term_text": "H10407" >> H10407 (ETEC salmon pink)، E24377A ( ETEC وردي باهت) ، HS (رمادي) ، و K-12 MG1655 (أخضر). الدائرة 14 تزرع موقع الجينات الذي تنفرد به بكتريا قولونية 042 فريد (أحمر). تُظهر الدائرة 15 قطعة من محتوى G & # x0002bC (في نافذة 10 كيلوبايت). تُظهر الدائرة 16 مخططًا لانحراف GC ([G & # x02212C] / [G & # x0002bC] في نافذة 10 كيلوبايت). يتم ترميز الجينات الموجودة في الدوائر 3 و 4 وفقًا لوظيفة منتجاتها الجينية: الأخضر الداكن & # x0200a = & # x0200 غشاء أو هياكل سطحية ، أصفر & # x0200a = & # x0200 أيض مركزي أو وسيط ، سماوي & # x0200a = & # x0200 تحلل الجزيئات الكبيرة ، red & # x0200a = & # x0200ainformation transfer / cell divit، cerise & # x0200a = & # x0200adegradation of small Molecules، blue pale & # x0200a = & # x0200aregulators، Salmon pink & # x0200a = & # x0200apathogenicity or adjustment، black & # x0200a = & # x0200aenergy الأيض ، البرتقالي & # x0200a = & # x0200aconservical افتراضي ، شاحب أخضر & # x0200a = & # x0200aunknown ، brown & # x0200a = & # x0200apseudogenes.

يتم إدخال عنصر Tn21 بين الجينات lpfA و glmS ويشكل ROD 66. وجود هذا الموضع يتسق مع معلومات النمط الظاهري التي تم الحصول عليها من اختبارات BioLog.

الجدول 1

كروموسومبلازميد
الحجم (بي بي)5,241,977113,346
CDS المتوقعة4,810152
محتوى G & # x0002bC (& # x00025)50.5649.55
مناطق الترميز (& # x00025)86.680.4
متوسط ​​طول CDS (BP)943629
الحمض الريبي النووي النقال930
الرنا الريباسي220
الجينات الكاذبة11032

الجدول 2

عصاموقعمقاسموقع الإدراججينات الشحنموقف جينات البضائع
رود 15877116..9179264081115bp كرر مباشر gtrAB و Ec042-0853 ترميز البكتوبرينول الجلوكوزيل ترانسفيراز المتورط في تعديل مستضد O914835..917583
رود 181396781..145014953369كرر ناقص
رود 211533876..15842765040115bp كرر مباشر sitABCD ترميز بروتينات نقل الحديد1580324..1583773
رود 261763886..181120047315تكرار PalindromicEc042-1724 ترميز نوكلياز خارجي مفترض1807070..1809541
رود 271832521..184354511025Intragenic في Ec042-1748
رود 302214943..225664141699تكرار مباشر لـ tRNA-Arg 31-mer
رود 302256892..227238515494الحمض الريبي النووي النقال- MetEc042-2203 ترميز نوكلياز خارجي مفترض الثامن2268605..2271046
ROD342551911..25600798169الحمض الريبي النووي النقال بروEc042-2429 ، على غرار proQ ، العنصر الهيكلي الذي يؤثر على التنشيط التناضحي لـ proP على مستوى ما بعد الترجمة Ec042-2430 ، بروتين يشبه PerC ، مشابه لمنشط النسخ لـ LEE في EPEC / EHEC2557981..2558798
رود 604198051..421814220092
رود 614236703..424773211030tRNA SelC (ع)

على أساس تماثل تسلسل النوكليوتيدات ، ينتمي البلازميد pAA إلى عائلة IncFIIA. يشتمل البلازميد على 152 CDS ، 32 منها عبارة عن جينات خادعة. من الباقي ، هناك 7 ترميز بروتينات افتراضية بدون تطابق في قاعدة البيانات ، و 23 ترميز بروتينات افتراضية محفوظة بدون وظيفة متوقعة ، و 55 لها وظائف نقل أو نسخ أو صيانة البلازميد ، وهناك 18 جينًا مشتقًا من عنصر متحرك يشفر الترانسبوزيز ، وقد أظهرت 17 CDS المتبقية أو توقعت أدوارًا في الفوعة (الجدول 1 والشكل S2). تشتمل الإضافات في البلازميد على جينات ترميز العديد من عوامل الفوعة EAEC 042 ذات الخصائص الجيدة وتتضمن التوكسين الخلوي Pet ، و AAF / II التجميعي للنسخة ، ومنظم النسخ AggR ، وآلية الإفراز المشابهة Aat ، والأوبرونات التي تشفر الحديد المفترض نظام النقل ومسار التخليق الحيوي متعدد السكريات والتي ستتم مناقشتها جميعًا لاحقًا.

بكتريا قولونية الجينوم الأساسي و pangenome

يعتبر جينوم EAEC 042 علاقة خطية إلى حد كبير مع جينوم التسلسل السابق بكتريا قولونية الجينومات باستثناء عدد قليل من الانقلابات والإدخال / الحذف (الشكل S3). مخطط مربع يوضح حجم الجينوم الأساسي المقدر (أي الجينات المحفوظة في الكل بكتريا قولونية سلالات) ، كدالة لعدد الجينومات المتسلسلة لـ 100 مجموعة سلالات مختارة عشوائيًا في الشكل S4. كان منحنى الانحلال الأسي مناسبًا باستخدام الدالة R nlrq [21] ، وأعطى حجم الجينوم الأساسي المتوقع لـ 2356 جينًا (الجدول S2). هذا أكبر من التقدير السابق لـ & # x0223c2200 [22] ، [23] ، وربما يرجع ذلك إلى تضميننا للجينات الموجودة ولكن التي لم يتم توضيحها في بعض السلالات. يقترب حجم الجينوم الأساسي المتوقع من عدد الجينات المحفوظة في جميع الجينومات المدرجة في هذه الدراسة ، مما يشير إلى أن عدد عمليات حذف الجينات المحتملة قريب من التشبع ، وهذا أكثر بكتريا قولونية من غير المرجح أن تحدد مشاريع تسلسل الجينوم العديد من عمليات حذف الجينات الجديدة. يشير التحليل إلى فتح بكتريا قولونية pangenome ، كما تم العثور عليه في الدراسات السابقة [22] ، [24] ، مع ما يقدر بـ 360 جينًا جديدًا تم تحديدها مع كل تسلسل جينوم إضافي (الشكل S5). ال بكتريا قولونية تمت مقارنة الجينوم الأساسي أيضًا مع غيرالقولونية Escherichia albertii و Escherichia fergusonii، مع وجود 2173 جينًا محفوظًا (الجدول S2). أظهرت المقارنات مع الجينوم المعوي السليم الآخر المتاح أنه تم حفظ 967 جينًا عبر العائلة (الجدول S2).

بكتريا قولونية علم تطور السلالات

تم إنشاء نسالة بناءً على التسلسل المتسلسل لـ 2173 جينًا محفوظًا في جميع بكتريا قولونية سلالات و E. البرتي و E. fergusonii، والتي تم تضمينها كتسلسلات خارج المجموعة. النتائج موضحة في الشكل S6. المنشأة بكتريا قولونية المجموعات الفرعية (A و B1 و B2 و D و E) كلها أحادية اللون باستثناء المجموعة D ، المقسمة على الجذر. بكتريا قولونية سلالات مجموعة SECEC SMS-3-5 و IAI39 مع المجموعة B2 ، والتي تتضمن العديد من مسببات الأمراض خارج الأمعاء بكتريا قولونية السلالات ، في حين أن السلالات العنقودية EAEC 042 و UMN026 مع المجموعات A و B1 و E و the شيغيلا سلالات. يتوافق هذا مع الاستنتاجات التي تم التوصل إليها في دراسة MLST الأخيرة ، حيث تم اقتراح تصنيف سلالات مثل SMS-3-5 و IAI38 في مجموعة جديدة F [25]. ومع ذلك ، نفضل تعيين المجموعتين على أنهما D1 و D2 ، للاحتفاظ بالتوافق مع التسمية السابقة واتباع سابقة المجموعة B.

التنميط الأيضي

بكتريا قولونية سلالات K-12 ، مثل بكتريا قولونية MG1655 ، تم استخدامه لوصف العديد من المسارات الأيضية التي نفهمها اليوم. ومع ذلك ، فقد وصفت المنشورات الحديثة ما هو أكثر من ذلك بكتريا قولونية لقد عرف علماء الأحياء منذ فترة طويلة بسبب مرور المختبر لفترات طويلة ومجموعة متنوعة من العلاجات لإزالة & # x003bb-phage و F البلازميد ، بكتريا قولونية سلالات K-12 ليست سلالات نموذجية تمثل بيولوجيا الجنس [26]. النمط الجيني لل بكتريا قولونية سلالة K-12 MG1655 (F & # x02212 ، & # x003bb- ، ilvG, rfb-50, rph-1) التي قدمها بكتريا قولونية مركز الأسهم ، يعكس فقط بعض الاختلافات بين بكتريا قولونية MG1655 وغيرها بكتريا قولونية سلالات. تمتد هذه الاختلافات إلى ما هو أبعد من عوامل الفوعة الإضافية التي تحملها السلالات المسببة للأمراض وتشمل وظائف التمثيل الغذائي المركزية التي تقوم بها سلالات أخرى بكتريا قولونية سلالات لكنها خسرت بكتريا قولونية سلالات K-12 [26]. للكشف عن ملف تعريف التمثيل الغذائي أكثر تمثيلا ل بكتريا قولونية تم إجراء سلالات BioLog Phenotype Microarrays (PMs) على EAEC 042 ومقارنتها بتحليلات مماثلة لـ بكتريا قولونية MG1655 (جدول S3 و S4). تم وصف الأساس الجيني الذي يمثل اختلافات كبيرة بين السلالات. يمكن تلخيص الاختلافات الرئيسية بين السلالات في فئتين رئيسيتين: مقاومة مضادات الميكروبات والاختلافات في استخدام المغذيات.

مقاومة المضادات الحيوية / مقاومة الأدوية

بعد فترة وجيزة من اكتشاف ممر EAEC ، لوحظ أن العديد من العزلات السريرية لـ EAEC أظهرت مقاومة متعددة للمضادات الحيوية [27]. عادة ما تكون مقاومة المضادات الحيوية بين سلالات EAEC أعلى من بين مسببات الإسهال الأخرى الممرضة ، وربما يكون السبب في زيادة عزلة EAEC عن الدراسات الوبائية [28]. أبلغت مجموعة متنوعة من الدراسات من مناطق متميزة جغرافيًا عن مستويات عالية من المقاومة للتتراسيكلين ، والسبكتينوميسين ، والستربتومايسين ، وتريميثوبريم- سلفاميثوكسازول ، والأمبيسلين [29] & # x02013 [31]. ملف مقاومة المضادات الحيوية بكتريا قولونية أظهر 042 المشتق من PMs مقاومة للسلفوناميدات والكلورامفينيكول والأمينوغليكوزيدات والتتراسيكلينات التي لم تظهر بواسطة بكتريا قولونية MG1655 (الجدول S3). هذا يتوافق مع وجود كروموسوم Tn على EAEC 0422411، تينيسي21- مثل الينقولات (الشكل 2). تينيسي2411 يمتلك جينات ترميز مقاومة للكلورامفينيكول (قط) والتتراسيكلين (رباعي) ويتضمن أيضًا انجيغرون من الفئة 1 يحمل شرائط مقاومة للمضادات الحيوية aad (الستربتومايسين والسبيكتينوميسين) ، سوي (سلفوناميد) و emrE (بروميد إيثيديوم) (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام ، كشفت بيانات PM أنه لا يوجد فرق بين قدرة بكتريا قولونية MG1655 و EAEC 042 ينموان في وجود بروميد الإيثيديوم بالرغم من ذلك بكتريا قولونية MG1655 لا يمتلك Tn2411 حيازة عنصر emrE. يمكن تفسير ذلك من خلال حقيقة أن بكتريا قولونية MG1655 تمتلك كلا من emrE (prophage المرتبط) ونظام التدفق المتعدد الأدوية المتوقع إمريك على الكروموسوم ، الجينات الغائبة في الأقسام المكافئة لجينوم EAEC 042. بالإضافة إلى ذلك ، فإن Tn2411 يمتلك العنصر أيضًا جينات مقاومة الزئبق (merRTPCAD). ومع ذلك ، لا تتضمن PMs مقايسة للنمو في كلوريد الزئبق. ومع ذلك ، فإن الهوية العالية بين مير الجينات في تينيسي2411 عنصر في الكروموسوم EAEC 042 و Tn21 يشير بقوة إلى أن EAEC 042 مير المقاومة وظيفية [32].

كشفت PMs أن EAEC 042 أكثر مقاومة للزرنيخ وكلوريد الأنتيمون من بكتريا قولونية MG1655. هذا النمط الظاهري هو على الأرجح نتيجة لـ بكتريا قولونية MG1655 آرس أوبرا ينقصه arsA (ترميز الوحدة الفرعية التحفيزية لمضخة الزرنيخ / الأنتيمونيت التي تحركها ATP) أو arsD (البروتين المثبط النسخي) الجينات (الشكل S7). أظهر العمل السابق أنه في غياب الوحدة الفرعية ArsA ATPase ، يمنح ArsB مقاومة جزئية فقط للزرنيخ عن طريق نقل هذه الأيونات إلى محيط البلازم باستخدام الطاقة المشتقة إما من سلسلة الجهاز التنفسي التي تضخ البروتون أو من F0F1 ATPase [33].

كشف رؤساء الوزراء عن ذلك بكتريا قولونية MG1655 أكثر مقاومة للأكريفلافين من EAEC 042. ومع ذلك ، فإن كلا من EAEC 042 و بكتريا قولونية MG1655 تمتلك أكراب (Ec042-0500 / 0501) و tolC (Ec042-3326) المنتجات الجينية التي تعمل بشكل جماعي لتشكيل نظام التدفق الذي يمنح مقاومة الأكريفلافين [34] ، [35]. لتحديد ما إذا كان بكتريا قولونية كان MG1655 أكثر كفاءة من EAEC 042 في المركبات المتدفقة مثل acriflavine ، وتم تحديد تراكم Hoescht 33342. وصل تراكم Hoescht 33342 إلى حالة ثبات أعلى بكثير داخل EAEC 042 منها بكتريا قولونية MG1655 (الشكل 3). أدت إضافة مثبط مضخة التدفق PA & # x003b2N إلى زيادة تراكم الصبغة بواسطة كليهما بكتريا قولونية MG1655 و EAEC 042 على الرغم من أن التأثير كان أكبر بكثير بالنسبة للأخير (الشكل 3). يشير هذا إلى أن الكمية الأكبر من هذا المركب المتراكمة بواسطة EAEC 042 بالنسبة لـ بكتريا قولونية من المحتمل أن يكون MG1655 نتيجة لزيادة نفاذية EAEC 042 بدلاً من نقص نشاط التدفق. تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام كربونيل سيانيد - م - كلوروفينيل هيدرازون (CCCP) وهو مثبط القوة المحركة للبروتون الذي يثبط عمل أنظمة التدفق الأخرى (الشكل 3). ومع ذلك ، فإن الزيادة في تراكم الصبغة في وجود PA & # x003b2N و CCCP توضح أن أنظمة التدفق النشط موجودة في EAEC 042. بكتريا قولونية من المرجح أن يكون MG1655 إلى acriflavine بسبب انخفاض الامتصاص وربما لا يكون مفاجئًا حيث تم استخدام صبغة أكريدين البرتقالية ذات الصلة لاختيار مشتقات K-12 التي تفتقر إلى البلازميد F [26].

Hoescht 33342 عبارة عن ركيزة لأنظمة تدفق AcrAB-TolC الرئيسية. تراكم بواسطة بكتريا قولونية تم قياس MG1655 و EAEC 042 بطريقة قياس الفلور في وجود أو عدم وجود مثبط مضخة التدفق PA & # x003b2N ومثبط القوة الدافعة للبروتون CCCP. يتم منع تدفق Hoescht 33342 في وجود كل من PA & # x003b2N و CCCP في EAEC 042 و بكتريا قولونية MG1655. ومع ذلك ، يتراكم Hoescht 33342 إلى مستويات أعلى في EAEC 042 من بكتريا قولونية MG1655 تشير إلى أن EAEC 042 تمتلك غشاء أكثر نفاذاً.

للتحقق من صحة تسلسل الجينوم وبيانات الجسيمات الدقيقة ، تم تحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) للأكريفلافين ولوحة من مضادات الميكروبات الأخرى (الجدول 3). كانت بيانات PM تنبؤية لـ MIC على الرغم من أن هذا الارتباط لم يكن مطلقًا. كان EAEC 042 أكثر مقاومة للكلورامفينيكول والتتراسيكلين والستربتومايسين والسبيكتينوميسين بشكل ملحوظ من بكتريا قولونية MG1655 ، على الأرجح نتيجة نقل جينات المقاومة المحددة. لم تكن هناك اختلافات كبيرة أخرى (أي تخفيفين أو أكبر) في القابلية لأي من مضادات الميكروبات الأخرى التي تم اختبارها بين EAEC 042 و بكتريا قولونية MG1655.

الجدول 3

أضنى
وكيلات بكتريا قولونية MG1655EAEC 042
الكلورامفينيكول 4 أ & # x0003e32
تتراسيلين 2 & # x0003e32
الستربتومايسين 2 & # x0003e128
سبكتينوميسين 16 & # x0003e128
حمض الناليديكسيك 8 2
سيبروفلوكساسين& # x0003c0.015& # x0003c0.015
الجنتاميسين0.50.5
الاريثروميسين3232
سيفترياكسون0.060.06
كلوكساسيلين& # x0003e128& # x0003e128
تريكلوسان& # x0003c0.03& # x0003c0.03
بروميد الايثيديوم512256
أكريفلافين12864

ومن المثير للاهتمام ، أن اختبار الحساسية أظهر أن EAEC 042 كان أكثر عرضة بأربعة أضعاف من بكتريا قولونية MG1655 لحمض ناليديكسيك. يرتبط هذا ببيانات PM التي أشارت إلى انخفاض قدرة EAEC 042 على النمو في وجود حمض الناليديكسيك مقارنةً بـ بكتريا قولونية MG1655. أظهرت بيانات PM أيضًا ذلك بكتريا قولونية يعتبر MG1655 أكثر مقاومة من EAEC 042 لمجموعة متنوعة من المضادات الحيوية & # x003b2-lactamase ، والريفامبيسين ، والماكروليدات ، وبعض مضادات الميكروبات الأخرى (الجدول S4). قد يكون هذا بسبب زيادة امتصاص المضادات الحيوية ، كما هو موضح أعلاه ، أو قد يعكس زيادة قدرة EAEC 042 على تجنيد الحديد ، كما هو موضح أدناه.

اقتناء الحديد

الحديد عنصر غذائي أساسي لنمو البكتيريا وهو قيد رئيسي على الاستعمار الناجح داخل مضيف الثدييات. تحتوي الثدييات على بروتينات مرتبطة بالحديد عالية التقارب مثل الترانسفيرين واللاكتوفيرين والتي تضمن الحفاظ على توافر الحديد مجانًا عند مستويات منخفضة للغاية. لمواجهة هذه الإجراءات الوقائية ، طورت مسببات الأمراض مجموعة متنوعة من أنظمة إزالة الحديد عالية التقارب مثل إنتاج حامض الحديد ، وناقلات امتصاص الهيموغلوبين والهيموغلوبين [35]. لقد راجعنا الاختلافات في أنظمة نقل الحديد بين بكتريا قولونية سلالة K-12 MG1655 و EAEC 042 وتم تلخيصها في الجدول S5. بما يتفق مع سلالات مسببة للأمراض أخرى بكتريا قولونية، تمتلك EAEC 042 العديد من أنظمة امتصاص الحديد الإضافية مقارنةً بـ بكتريا قولونية MG1655. تتضمن هذه الأنظمة ناقل Shu ، المطلوب لامتصاص نظام Fit siderophore لامتصاص نظام امتصاص الحديد Yersiniabactin الموجود في يرسينيا جزيرة عالية الإمراض نظام SitABCD الذي يمكنه تجنيد الحديد والمنغنيز ، وبكتريوفريتين متنبأ به وناقل سيترات الحديديك (III) المشفر بالبلازميد. أظهر العمل السابق أن نظام Yersiniabactin سليم ويعمل في EAEC 042 [36]. علاوة على ذلك ، بينما تحتوي كلا السلالتين على efeUOB ناقل الحديد الحديدية المعتمد على أوكسيديز ، بكتريا قولونية الناقل MG1655 غير وظيفي بسبب طفرة تغيير الإطارات في efeU [37]. لتحديد ما إذا كان بكتريا قولونية كان EAEC 042 أكثر كفاءة في عزل الحديد ، قمنا بقياس محتوى الحديد الكلي لمزارع المرحلة الأسية المتوسطة لـ EAEC 042 و بكتريا قولونية سلالات MG1655 نمت في وسط نيدهارت الغني المحدد. لقد وجدنا أن بكتريا قولونية يحتوي 042 على 13.7 & # x000b10.6 ميكرو مول من الحديد / مجم بروتين مقارنة بـ 8.15 & # x000b10.976 ميكرو مول من الحديد / مجم بروتين في بكتريا قولونية MG1655. هكذا، بكتريا قولونية يحتوي 042 على 1.68 ضعف من الحديد بكتريا قولونية MG1655 نتيجة تتفق مع السلالات المسببة للأمراض الأخرى من بكتريا قولونية (M. Goldberg ، غير منشورة).

أظهرت الدراسات الحديثة التي أجراها Goldberg and Lund (التواصل الشخصي) أن القدرة المعززة للسلالات المسببة للأمراض على نقب الحديد يمكن أن تكون غير مؤاتية في ظل ظروف الأكسدة. يؤدي الإجهاد التأكسدي إلى إتلاف البروتينات المرتبطة بالحديد مما يؤدي إلى زيادة مستويات الحديد الحر في السيتوبلازم ، مما يؤدي إلى تفاعلات فنتون [38] ، [39]. يمكن أن يؤدي إنتاج الجذور الحرة المعزز الناتج عن هذا التفاعل إلى إرباك أنظمة إزالة الجذور الحرة بالخلايا ، مما يتسبب في مزيد من الضرر لبروتينات ربط الحديد بما في ذلك مانع الفراء ، مما يؤدي إلى زيادة امتصاص الحديد وزيادة الضرر التأكسدي. وبالتالي ، فإن الخلايا التي تحتوي على كميات أكبر من الحديد داخل الخلايا تكون أكثر عرضة للخضوع للإجهاد التأكسدي من الخلايا التي تحتوي على كمية أقل. لقد وجدنا أن بكتريا قولونية 042 أكثر عرضة لميناديون مركب تدوير الأكسدة والاختزال (MIC & # x0200a = & # x0200a1 mg / ml) من بكتريا قولونية MG1655 (MIC & # x0200a = & # x0200a2 mg / ml) يشير إلى أن EAEC 042 أكثر عرضة للإجهاد التأكسدي من بكتريا قولونية MG1655. أشارت بيانات PM إلى ذلك بكتريا قولونية 042 أكثر عرضة لمثبطات الجيراز (مثل حمض الناليديكسيك) والمضادات الحيوية & # x003b2-lactam (مثل Oxacillin ، Phenethicillin) من بكتريا قولونية MG1655 (جدول S4 و & # x200B و 3). 3). إن قدرة EAEC 042 على عزل مستويات أعلى من الحديد ، بالاقتران مع زيادة القابلية للتأثر بكاشف ميناديون المؤكسد ، تشير بقوة إلى زيادة حساسية EAEC 042 لهذه المضادات الحيوية بسبب إثارة تفاعلات Fenton بالطريقة التي سبق وصفها من قبل Kohanski والزملاء [39].

استخدام مصدر الكربون

تتطلب البكتيريا إمدادات كافية من الكربون لتغذية مساراتها الأيضية. تواجه الكائنات غيرية التغذية في بيئاتها الأصلية كميات محدودة من الخلائط المعقدة من مصادر الكربون التي غالبًا ما تكون موجودة بتركيزات منخفضة. نتيجة لذلك ، طورت الخلايا الميكروبية أنظمة مختلفة متعددة للاستفادة من مجموعة واسعة من الركائز المختلفة كمصادر للكربون. يتم استخدام هذه الاختلافات في الاختبارات التشخيصية للتمييز بين أنواع وسلالات معينة من البكتيريا. أظهرت PMs لاستخدام مصدر الكربون الوحيد أن EAEC 042 يمكن أن تستخدم 2-Deoxy-D-Ribose بشكل أكثر فعالية من بكتريا قولونية MG1655 (الجدول S5). أظهرت التقارير السابقة ذلك بكتريا قولونية لا يمكن لـ K-12 استخدام مصدر الكربون هذا ، لكن السالمونيلا المعوية يمكن أن يكون التيفيموريوم المصلي ، باستخدام deoXKPQ منتجات الجينات [40]. تمتلك EAEC 042 متجانسات من س. التيفيموريوم deoXKPQ (Ec042-4753 & # x020134756).

إن N-acetyl-D-galactosamine و N-acetyl-D-glucosamine هما مكونان من الميوسين المعوي ، وكذلك الببتيدوغليكان. أظهر فحص PM أن EAEC 042 يستخدم N-acetyl-D-galactosamine و N-acetyl-D-glucosamine بشكل أفضل من بكتريا قولونية MG1655 (الجدول S3) ، يؤكد العمل السابق الذي يظهر أن سلالات K-12 غير قادرة على استخدام هذه الركائز كمصدر وحيد للكربون [41]. في بكتريا قولونية O157: H7 تم تحديد جينات N-acetyl-D-galactosamine و N-acetyl-D-glucosamine على أنها agaZVWEFASYBCDI كتلة الجينات. في بكتريا قولونية MG1655 جزء من هذا الموضع مفقود بسبب إعادة التركيب الخاص بالموقع بينهما agaW و الآغا [42] ، ولكن هذا المكان موجود وسليم في EAEC 042 (الشكل S8). تتوافق هذه الملاحظة مع الدليل الأخير على أن EAEC 042 يمكنه استخدام مخاط الأمعاء كمصدر للكربون [43].

استخدام L- سوربوز عن طريق مسببات الأمراض بكتريا قولونية و شيغيلا يختلف بين السلالات [44] ، [45]. تظهر بيانات PM أن EAEC 042 أفضل بكثير في استخدام L-sorbose من بكتريا قولونية MG1655 (الجدول S3). تظهر مقارنة الجينوم بين السلالتين (الشكل S9) أن EAEC 042 ، مثل غيرها بكتريا قولونية و شيغيلا تحمل الأنواع المرضية sorEMABFDC المشغل (Ec042-4384 & # x020134390) ، يقع بين ybiC و rluF. بكتريا قولونية MG1655 لا يحمل هذا المشغل. أكد تحليل BLAST لـ CDS في هذه المنطقة في EAEC 042 أن الجينات لها هوية عالية للوصف سابقًا سور الجينات وبالتالي يفترض أنها وظيفية.

على العكس من ذلك ، أظهرت بيانات PM ذلك بكتريا قولونية MG1655 ينمو ويستقلب D-Serine ، Mucic acid (D-galactarate) ، & # x003b2-D-Allose و D-Xylose بشكل أكثر فعالية من EAEC 042 (الجدول S4). سلط تقرير سابق الضوء على التباين الجيني الشامل في أرجو-dsdCXA جزيرة الجينوم في بكتريا قولونية سلالات [46]. بكتريا قولونية MG1655 لديه dsdCXA مجموعة الجينات التي ترمز للقدرة على استخدام D-serine ، بينما تفتقر EAEC 042 إلى هذه الجينات التي تفسر الاختلاف الأيضي في استخدام السيرين بين السلالات. محاذاة غار أوبرون من بكتريا قولونية MG1655 الذي يشفر عامل التمثيل الغذائي للجالاكتارات [47] ، [48] مع المنطقة المكافئة لجينوم EAEC 042 يُظهر أن ORF الفردي في بكتريا قولونية MG1655 ترميز إنزيم دي جالاكتارات ديهيدروجينيز (جارد) عبارة عن اثنين من CDS في EAEC 042 ، مما يشير إلى أن وظيفة الإنزيم وبالتالي التمثيل الغذائي لـ D-galactarate سيتم تعطيلها في EAEC 042 بسبب طفرة في هذا الجين (الشكل S10). EAEC 042 معيب أيضًا في استقلاب D-Allose ، مقارنةً بـ بكتريا قولونية MG1655 في PMs. محاذاة الجينوم تركزت على als يظهر المشغل (الشكل S11) [49] ، [50] الغياب التام لـ als أوبرون (دورة في البوصة, rpiR, alsBACE و ك) في EAEC 042. يُظهر EAEC 042 أيضًا مستوى أقل من التمثيل الغذائي مقارنةً بـ بكتريا قولونية MG1655 عند استخدام الزيلوز كمصدر وحيد للكربون. يمكن تفسير ذلك بالغياب من EAEC 042 لـ زيلي الجين الذي يقوم بترميز الميسر الرئيسي متناغم البروتون الزيلوز منخفض التقارب فائق العائلة. يوجد نظام امتصاص زيلوز ثاني ، ناقل ABC (xylFGH) موجود في كلا السلالتين اللتين تم الإبلاغ عن أنهما نظام نقل الزيلوز السائد في كل من الظروف الهوائية واللاهوائية [51] ووظائف هذا النظام التي تؤدي إلى تقليل امتصاص الزيلوز ، ولكن مع ذلك ، يتوافق مع الاختلافات الأيضية بين بكتريا قولونية MG1655 و EAEC 042 عندما يكون الزيلوز هو المصدر الوحيد للكربون.

العديد من الاختلافات المظهرية بين EAEC 042 و بكتريا قولونية MG1655 ، التي لوحظت في PMs ، ليس لها أساس وراثي يمكن التعرف عليه بسهولة. ومع ذلك ، فإن زيادة قدرة EAEC 042 على تناول مركبات معينة ، كما تم قياسها في تجارب PA & # x003b2N (الشكل 3) ، قد تفسر سبب قدرة EAEC 042 على استقلاب العديد من المركبات التي بكتريا قولونية MG1655 ليس كذلك. المسار الطبيعي لامتصاص الجزيئات الصغيرة يكون عبر البورنس [52] ، [53]. تعمل بورين كمناخل جزيئية للسماح بالانتشار السلبي للمواد المذابة منخفضة الوزن الجزيئي (& # x0003c600 Da) في الخلية. على الرغم من تشابهها من الناحية الهيكلية ، إلا أن البورنات المختلفة لها أحجام مسام مختلفة ، وانتقائية أيونية وملامح تعبير تسمح للبكتيريا بالتكيف مع البيئات المتغيرة [54] & # x02013 [56]. أضع ثقتي في بكتريا قولونية MG1655 ، التي تمتلك أربعة جينات بورين (ompF, ompC, phoE و ompN) وجين كاذب واحد (nmpC/ompD) ، تمتلك EAEC 042 ستة جينات سليمة ترميز porins. يحب بكتريا قولونية MG1655 ، EAEC 042 تمتلك ompF (Ec042-1020) ، ompC (Ec042-2456) ، phoE (Ec042-0302) و ompN (Ec042-1523) ، لكنها تمتلك أيضًا وظيفية على ما يبدو ompD (Ec042-1601) وبورين إضافي متميز نسبيًا (Ec042-2121) يتم تمثيله تفاضليًا بين العوامل المسببة للأمراض بكتريا قولونية ولكن وظيفتها الدقيقة غير معروفة (الشكل 4 والشكل S12). بالإضافة إلى الأدوار الفسيولوجية الهامة التي تلعبها البورنات ، تخضع هذه الجزيئات لضغط انتقائي مستمر بسبب التعرف عليها من قبل العاثيات والكوليسين والجهاز المناعي. في الواقع ، OmpD من S. المعوية أظهر التيفيموريوم مؤخرًا أنه هدف رئيسي لاستجابة الجسم المضاد الواقي المستقل عن T ووجوده العالمي بين غير التيفود السالمونيلا suggest it plays an important role in the ability of enteric organisms, such as EAEC 042, to persist in the intestine and interact with the host [57].


Non-coding sequence evolution

NcRNA sequence evolution

The availability of complete sequence from 12 ذبابة الفاكهة genomes, combined with the tractability of RNA structure predictions, offers the exciting opportunity to connect patterns of sequence evolution directly with structural and functional constraints at the molecular level. We tested models of RNA evolution focusing on specific ncRNA gene classes in addition to inferring patterns of sequence evolution using more general datasets that are based on predicted intronic RNA structures.

The exquisite simplicity of miRNAs and their shared stem-loop structure makes these ncRNAs particularly amenable to evolutionary analysis. Most miRNAs are highly conserved within the ذبابة الفاكهة genus: for the 71 previously described miRNA genes inferred to be present in the common ancestor of these 12 species, mature miRNA sequences are nearly invariant. However, we do find a small number of substitutions and a single deletion in mature miRNA sequences (Supplementary Table 14), which may have functional consequences for miRNA–target interactions and may ultimately help identify targets through sequence covariation. Pre-miRNA sequences are also highly conserved, evolving at about 10% of the rate of synonymous sites.

To link patterns of evolution with structural constraints, we inferred ancestral pre-miRNA sequences and deduced secondary structures at each ancestral node on the phylogeny (Supplementary Information section 12.1). Although conserved miRNA genes show little structural change (little change in free energy), the five ميلانوجاستر group-specific miRNA genes (miR-303 و ال mir-310/311/312/313 cluster) have undergone numerous changes across the entire pre-miRNA sequence, including the ordinarily invariant mature miRNA. Patterns of polymorphism and divergence in these lineage-specific miRNA genes, including a high frequency of derived mutations, are suggestive of positive selection 140 . Although lineage-specific miRNAs may evolve under less constraint because they have fewer target transcripts in the genome, it is also possible that recent integration into regulatory networks causes accelerated rates of miRNA evolution.

We further investigated patterns of sequence evolution for the subset of 38 conserved pre-miRNAs with mature miRNA sequences at their 3′ end by calculating evolutionary rates in distinct site classes (Fig. 6, and Supplementary Information section 12.2). Outside the mature miRNA and its complementary sequence, loops had the highest rate of evolution, followed by unpaired sites, with paired sites having the lowest rate of evolution. Inside the mature miRNA, unpaired sites evolve more slowly than paired sites, whereas the opposite is true for the sequence complementary to the mature miRNA. Surprisingly, a large fraction of unpaired bulges or internal loops in the mature miRNA seem to be conserved—a pattern which may have implications for models of miRNA biogenesis and the degree of mismatch allowed in miRNA–target prediction methods. Overall these results support the qualitative model proposed in ref. 141 for the canonical progression of miRNA evolution, and show that functional constraints on the miRNA itself supersede structural constraints imposed by maintenance of the hairpin-loop.

Bootstrap distributions of miRNA substitution rates. Structural alignments of miRNA precursor hairpins were partitioned into six site-classes (inset): (1) hairpin loops unpaired sites (2) outside, (3) in the complementary region of, and (4) inside the miRNA and base pairs (5) adjacent to and (6) involving the miRNA. Whiskers show approximate 95% confidence intervals for median differences, boxes show interquartile range.

To assess constraint on stem regions of RNA structures more generally, we compared substitution rates in stems (س) to those in nominally unconstrained loop regions (إل) in a wide variety of ncRNAs (Supplementary Information section 12.3). We estimated substitution rates using a maximum likelihood framework, and compared the observed إل/س ratio with the average إل/س ratio estimated from published secondary structures in RFAM, which we normalized to 1.0. إل/س ratios for ذبابة الفاكهة ncRNA families range from a highly constrained 2.57 for the nuclear RNase P family to 0.56 for the 5S ribosomal RNA (Supplementary Table 15).

Finally, we predicted a set of conserved intronic RNA structures and analysed patterns of compensatory nucleotide substitution in D. melanogaster, D. yakuba, D. ananassae, D. pseudoobscura, D. virilis و D. mojavensis (Supplementary Information section 13). Signatures of compensatory evolution in RNA helices are detected as covarying nucleotide sites or ‘covariations’ (that is, two Watson–Crick bases that interact in species A replaced by a different Watson–Crick pair in species B). The number of covariations (per base pair of a helix) depends on the physical distance between the interacting nucleotides (Supplementary Fig. 9), as has been observed for the RNA helices in the Drosophila bicoid 3′ UTR region 142 . Short-range pairings exhibit a higher average number of covariations with a larger variance among helices than longer-range pairings. The decrease in rate of covariation with increasing distance may be explained by physical properties of a helix, which may impose selective constraints on the evolution of covarying nucleotides within a helix. Alternatively, if individual mutations at each locus are deleterious but compensated by mutations at a second locus, given sufficiently strong selection against the first deleterious mutation these epistatic fitness interactions could generate the observed distance effect 143 .

Evolution of رابطة الدول المستقلة-regulatory DNAs

Comparative analyses of رابطة الدول المستقلة-regulatory sequences may provide insights into the evolutionary forces acting on regulatory components of genes, shed light on the constraints of the رابطة الدول المستقلة-regulatory code and aid in annotation of new regulatory sequences. Here we rely on two recently compiled databases, and present results comparing رابطة الدول المستقلة-regulatory modules 144 and transcription factor binding sites (derived from DNase I footprints) 145 between D. melanogaster و D. simulans (Supplementary Information section 8). We estimated mean selective constraint (ج, the fraction of mutations removed by natural selection) relative to the ‘fastest evolving intron’ sites at the 5′ end of short introns, which represent putatively unconstrained neutral standards (Supplementary Information section 8.2) 146 . Note that this approach ignores the contribution of positively selected sites, potentially underestimating the fraction of functionally relevant sites 147 .

Consistent with previous findings, ذبابة الفاكهة رابطة الدول المستقلة-regulatory sequences are highly constrained 148,149 . Mean constraint within رابطة الدول المستقلة-regulatory modules is 0.643 (95% bootstrap confidence interval = 0.621–0.662) and within footprints is 0.692 (0.655–0.723), both of which are significantly higher than mean constraint in non-coding DNA overall (0.555 (0.546–0.563)) and significantly lower than constraint at non-degenerate coding sites (0.862 (0.856–0.868)) and ncRNA genes (0.864 (0.846–0.880)) (Supplementary Fig. 10). The high level of constraint in رابطة الدول المستقلة-regulatory sequences also extends into flanking sequences, only declining to constraint levels typical of non-coding DNA 40 bp away. This is consistent with previous findings that transcription factor binding sites tend to be found in larger blocks of constraint that cluster to form رابطة الدول المستقلة-regulatory modules 150 . To understand selective constraints on nucleotides within رابطة الدول المستقلة-regulatory sequences that have direct contact with transcription factors, we estimated the selective constraint for the best match to position weight matrices within each footprint 151 core motifs in transcription-factor-binding sites have a mean constraint of 0.773 (0.729–0.814), significantly greater than the mean for the footprints as a whole, and approaching the level of constraint found at non-degenerate coding sites and in ncRNA genes (Supplementary Fig. 10).

We next examined the variation in selective constraint across رابطة الدول المستقلة-regulatory sequences. Surprisingly, we find no evidence that selective constraint is correlated with predicted transcription-factor-binding strength (estimated as the position weight matrix score ص-value) (Spearman’s ص = 0.0681, ص = 0.0609). We observe significant variation in constraint both among target genes (Kruskal–Wallis tests, footprints, ص < 0.0001 and position weight matrix matches within footprints, ص = 0.0023) and among chromosomes (رابطة الدول المستقلة-regulatory modules, ص = 0.0186 footprints, ص = 0.0388 and position weight matrix matches within footprints, ص = 0.0108 Supplementary Table 16).


خلفية

Integrative Conjugative Elements (ICEs) carry functional modules involved in their conjugative transfer, chromosomal integration and for control of expression of ICE genes [1]. ICEs are maintained in their host via site-specific integration and establishment at a unique site or sites in their host [2-7]. ICEs have been discovered in the genomes of various low G+C Gram-positive bacteria, various α, & # x003b2- و & # x003b3-Proteobacteria, and باكتيرويدس species [8]. The first ICE found was Tn916 من عند باكتيرويدس species [8].

One of the best models of ICEs is a family of elements called the R391SXT family that are found in & # x003b3-Proteobacteria. These are interesting elements as over 25 have been found to date in organisms spread across the world. They share a common core scaffold of genes related to integration, excision, transfer and regulation. Different elements can possess different fitness determinants such as antibiotic resistances, heavy metal resistances, and error-prone DNA repair systems [9].

Tn4371 is a 55-kb ICE, which allows its host to degrade biphenyl and 4-chlorobiphenyl. It was isolated after mating between Cupriavidus oxalaticus (Ralstonia oxalatica) A5 carrying the broad-host-range conjugative plasmid RP4 and Cupriavidus metallidurans (Ralstonia metallidurans) CH34. Selection was applied for transconjugants that expressed the heavy metal resistances from CH34 and grew with biphenyl as a sole source of carbon and energy [10]. The transconjugants carried an RP4 plasmid with a 55-kb insert near its tetracycline resistance operon. The insert was shown to transpose to other locations and hence was called Tn4371 [10-12]. Tn4371 has been sequenced [13] and closely related elements have been found in the genome sequences of a number of bacteria including Ralstonia solanacearum GMI1000, a phytopathogen from French Guyana [14], Cupriavidus metallidurans CH34, a heavy metal resistant bacteria from Belgium [15], اروينيا الاقحوان 3937, aphytopathogen [16] and Azotobacter vinelandii AvOP, a nitrogen-fixing bacterium isolated from soil in the USA [13,17]. None of these other elements possessed the biphenyl and 4-chlorobiphenyl degradation genes.

The Tn4371-like ICEs characterised to date are mosaic in structure consisting of Ti-RP4-like transfer systems, an integrase region, plasmid maintenance genes and accessory genes [13]. All the characterised elements integrate into sites on the bacterial genomes with a conserved 5'-TTTTTCAT-3' sequence, termed the attB site [11]. Tn4371 transposition most likely involves a site-specific integration/excision process, since the ends of the element can be detected covalently linked as a transfer intermediate [11,13]. Integration is catalysed by a tyrosine based site specific recombinase related to bacteriophage and ICE family integrases [18].

A small number of putative ICEs have been discovered following sequence analyses of genomes of various low G+C Gram-positive bacteria [19], various & # x003b1, & # x003b2- و & # x003b3-Proteobacteria [20-22], and باكتيرويدس species [23].

We now report the discovery and comparative analysis of a number of novel uncharacterised Tn4371-like ICEs from several different bacterial species. These elements are also mosaics of plasmid and other genes and posses a common scaffold with apparent hotspots containing insertions of different presumably adaptive genes. Using sequences from the common scaffold a PCR method was developed to discover and characterise new Tn4371-like ICEs in different bacteria. Here we report on the use of this method to discover and characterise two new Tn4371-like ICEs in Ralstonia pickettii strains isolated from a purified water system. Furthermore we propose a uniform nomenclature for newly discovered ICEs of the Tn4371 أسرة


يسلط الضوء

Genomic sampling of mosquito diversity has greatly improved in recent years and looks set to take advantage of emerging technologies to explore even further.

Evolutionary genomics analyses have unveiled dynamic patterns of gene and genome evolution likely linked to mosquito adaptability that will guide future research and control efforts.

Functional genomics assays have helped to characterise biological roles of thousands of genes, albeit with condition-patchy and species-biased coverage that is now starting to be remedied.

Comparative genomics approaches are increasingly being applied to contextualise and enhance the interpretation of results from multispecies studies with an evolutionary perspective.

These trends mean that effective data sharing will be critical to facilitate future integrative meta-analyses and fully harness the benefits of combined evolutionary and functional analyses.

Mosquitoes are widely despised for their exasperating buzzing and irritating bites, and more poignantly because, during blood-feeding, females may transmit pathogens that cause devastating diseases. However, the ability to transmit such viruses, filarial worms, or malaria parasites varies greatly amongst the ∼3500 recognised mosquito species. Applying omics technologies to sample this diversity and explore the biology underlying these variations is bringing increasingly greater resolution that enhances our understanding of mosquito evolution. Here we review the current status of mosquito omics, or ‘mozomics’, resources and recent advances in their applications to characterise mosquito biology and evolution, with a focus on the intersection of evolutionary and functional genomics to understand the putative links between gene and genome dynamism and mosquito diversity.


Genome-wide analysis of Hsp70 و Hsp100 gene families in Ziziphus jujuba

ال زيزيفوس species are naturally tolerant to a range of abiotic stresses. Therefore, it is expected that they are an enriched source of genes conferring stress tolerance. Heat shock proteins (Hsps) play a significant role in plants in imparting tolerance against abiotic stress conditions. To get an insight into potential Hsp function in زيزيفوس, we performed a genome-wide analysis and expression study of Hsp70 و Hsp100 gene families in Ziziphus jujuba. We identified 21 and 6 genes of the ZjHsp70 و ZjHsp100 families, respectively. Physiochemical properties, chromosomal location, gene structure, motifs, and protein domain organization were analysed for structural and functional characterization. We identified the contribution of tandem and segmental gene duplications in expansions of ZjHsp70s و ZjHsp100s في Z. jujuba. Promoter analysis suggested that ZjHsp70s و ZjHsp100s perform diverse functions related to abiotic stress. Furthermore, expression analyses revealed that most of the Z. jujuba Hsp genes are differentially expressed in response to heat, drought, and salinity stress. Our analyses suggested ZjHsp70-3, ZjHsp70-5, ZjHsp70-6, ZjHsp70-16, ZjHsp70-17, ZjHsp70-20, ZjHsp100-1, ZjHsp100-2، و ZjHsp100-3 are potential candidates for further functional analysis and with regard to breeding new more resilient strains. The present analysis laid the foundation for understanding the molecular mechanism of Hsps70 و Hsp100 gene families regulating abiotic stress tolerance in Z. jujuba.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


مناقشة

Amiloride effects and the Wieczorek model

ال ذبابة الفاكهة Malpighian tubule is exquisitely sensitive to agents hypothesised to affect the components of the Wieczorek model for insect epithelia, namely the apical V-ATPase and associated exchanger. However, while bafilomycin is agreed to be a selective inhibitor of V-ATPase, amiloride could target a range of molecules on apical or basal surfaces. Here, we show that the Malpighian tubules are blocked by a characteristic range of amiloride derivatives characteristic of exchangers, rather than channels. The order of inhibition of fluid secretion in Malpighian tubules is EIPA≫2,4-dichloro-benzamil>DMA>amiloride≈benzamil (Fig. 1 Table 1). These results are consistent with those recently obtained in Aedes aegypti (Petzel, 2000), increasing our confidence that amiloride targets NHEs in insect Malpighian tubules. This is also consistent with our RT-PCR data showing that ذبابة الفاكهة NHE genes, but not ENaC genes (Fig. 9, see also Fig. 2), are expressed in Malpighian tubules. Our failure to identify ENaCs in Malpighian tubules is consistent with electrophysiological analysis, which showed that amiloride inhibited transepithelial Na + secretion in Aedes aegypti Malpighian tubules without any effect on transepithelial and fractional membrane resistance (Hegarty et al., 1992).

The Drosophila NHE family

This paper describes three genes that appear to encode the ذبابة الفاكهة members of the NHE gene family. Their protein sequences are quite different from the protein sequences of the other members of the family, but there is sufficient similarity to the other NHEs to assign them unambiguously to this group of proteins (Fig. 6). More specifically, DmNHE1 appears to be very similar to a novel human NHE, KIAA0939, which has been found in kidney (IMAGE 3134373) and brain (GenBank accession number AB023156) (Nagase et al., 1999). DmNHE2 is most similar to two invertebrate NHEs, the NHE found in كارسينوس ميناس and the newly described NHE3 in Aedes aegypti (GenBank accession number AF80554 S. S. Gill, H. Wediak and L. S. Ross, unpublished). DmNHE3 sits near human mitochondrial NHE6 (although DmNHE3 encodes no mitochondrial targeting sequences) and also close to نبات الأرابيدوبسيس thaliana and yeast genes.

الثلاثة DmNHEs described above are predicted to be plasma membrane integral proteins with 10–12 transmembrane domains just like the other members of the family (Fig. 6). كل ال ذبابة الفاكهة NHEs have a putative signal peptide and a possible cleavage site. This is similar to the position in mammalian NHEs, although it is not certain whether the signal peptide is ever cleaved (Zizak et al., 2000) see Shrode et al. (Shrode et al., 1998) and Wakabayashi et al. (Wakabayashi et al., 2000). The presence of distinct messages for DmNHE2, encoding peptides with differing C-terminal domains, has interesting implications for control of the exchanger.

In principle, the elucidation of genes in ذبابة الفاكهة would allow the reverse genetic analysis of their function in mutants. However, there are no candidate P-element insertions documented at any of the three loci. The nearest mutation is an insertion, 2 kb beyond the 3′ end of DmNHE3, that generates a lethal recessive phenotype. However, this insertion is at the 5′ end of a novel gene (CG11329), and so the lethality is probably attributable to the latter locus.

Are any of these genes candidates for the Wieczorek exchanger? Their relative dissimilarity to cardinal vertebrate NHEs (Fig. 8) would allow them to be ascribed different functional properties. على سبيل المثال، DmNHE2 sits in a branch of the similarity tree with only invertebrate representatives and so would be a strong candidate. Our data show that, in ذبابة الفاكهة, all three exchangers are widely expressed (Fig. 9) and are certainly present in a relevant epithelium (the Malpighian tubule). However, the same general expression pattern would argue against a specialised role in transporting epithelia only, and our pharmacological analysis (Fig. 1) does not distinguish between an apical or basolateral localisation. Recent electrophysiological evidence suggests that amiloride may be acting at the basolateral membrane of Aedes aegypti Malpighian tubules (Petzel, 2000), and our results cannot be taken to contradict this view. In insects, it may have been naïve to assume that sensitivity to bafilomycin and amiloride is sufficient proof that an epithelium conforms to the Wieczorek model. However, whether DmNHE1, DmNHE2 أو DmNHE3 transpires to be the elusive apical exchanger, or a vital part of the cell’s ion-regulatory machinery, the description of this gene family in a genetic model organism should be useful.

Sensitivity of secretion by the ذبابة الفاكهة سوداء البطن Malpighian tubule to inhibition by amiloride and its derivatives. Dose/response curves for amiloride, 5-ن,ن-dimethyl amiloride (DMA), benzamil, 5-ن-ethyl-ن-isopropyl amiloride (EIPA) and 2′,4′-dichlorobenzamil (DCB). The upper limits of each graph are determined by the solubility of the compounds. Values are means ± s.e.m . (ن=10).

Sensitivity of secretion by the ذبابة الفاكهة سوداء البطن Malpighian tubule to inhibition by amiloride and its derivatives. Dose/response curves for amiloride, 5-ن,ن-dimethyl amiloride (DMA), benzamil, 5-ن-ethyl-ن-isopropyl amiloride (EIPA) and 2′,4′-dichlorobenzamil (DCB). The upper limits of each graph are determined by the solubility of the compounds. Values are means ± s.e.m . (ن=10).

Malpighian tubules do not express epithelial Na + channels (ENaCs). (A) Phylogenetic tree of all ذبابة الفاكهة ENaCs identified by BLASTP search using human amiloride-sensitive cation channel 2, neuronal hBNaC2 (GenBank accession number NP 064423) protein sequence as a probe. (B) RT-PCR for putative EnaCs (left-hand panels) and corresponding Southern blots with probes specific to each gene (right-hand panels). Labels refer to known genes or to Gadfly-predicted genes. Size markers denote expected sizes from genomic (black arrows) and cDNA (white arrows) templates. The ladder is a Gibco BRL 1 kb ladder. The templates are as follows: Genomic, genomic DNA Whole fly, whole-fly cDNA Head, head cDNA Tubule, Malpighian tubule cDNA No template, no template (negative control).

Malpighian tubules do not express epithelial Na + channels (ENaCs). (A) Phylogenetic tree of all ذبابة الفاكهة ENaCs identified by BLASTP search using human amiloride-sensitive cation channel 2, neuronal hBNaC2 (GenBank accession number NP 064423) protein sequence as a probe. (B) RT-PCR for putative EnaCs (left-hand panels) and corresponding Southern blots with probes specific to each gene (right-hand panels). Labels refer to known genes or to Gadfly-predicted genes. Size markers denote expected sizes from genomic (black arrows) and cDNA (white arrows) templates. The ladder is a Gibco BRL 1 kb ladder. The templates are as follows: Genomic, genomic DNA Whole fly, whole-fly cDNA Head, head cDNA Tubule, Malpighian tubule cDNA No template, no template (negative control).


شاهد الفيديو: الأحياء متقدم- صف 11 - بناء البروتين (كانون الثاني 2023).